【摘要】 目的：探讨gmcsf和其诱导的破骨细胞对成骨细胞生长的影响。方法：采用分组对照、细胞计数等方法进行研究。结果：gmcsf和其诱导的破骨细胞可以促进成骨细胞生长。结论：gmcsf和其诱导的破骨细胞促进成骨细胞增殖、分化，可能是通过破骨细胞内gmcsf介导的信号通路而发挥作用。
【关键词】 gmcsf 破骨细胞 成骨细胞
effect of gmcsf and its inducing osteoclast on the proliferation of osteoblast
liu zheng, sun yuanming, xiao xiangjun, li yumin, sun yong, yang fujun.
institute of radiation medicine, chinese academy of medical sciences & peking union medical college, tianjin 300192, china
［abstract］ objective:to study the effect of gmcsf and its inducing osteoclast on proliferation of osteoblast.methods:contrast to divide into groups to be adopted and the cell counts, use the analysis of variance to examine, define this relation.results:gmcsf and its inducing osteoclast induced proliferation of osteoblast.conclusion:gmcsf can activate the signal pathway and gene expression in the osteoclast, at the same time, express gene result to proliferation of osteoblast.
［key words］ gmcsf；osteoclast；osteoblast
gmcsf对破骨细胞的发育有着重要作用，我们实验室建立了一整套的应用gmcsf等细胞因子将源于小鼠脾干细胞诱导培养成破骨细胞的技术［1，2］。WWw.133229.CoM破骨细胞和成骨细胞彼此间相互作用，调节机体内的成骨和破骨作用的平衡。gmcsf介导的细胞信号传导通路引起破骨细胞内基因的表达是否对成骨细胞产生影响，目前还不清楚。我们采用分组对照、细胞计数等实验方法对此进行了观察。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂 4～6周龄c57雌性小鼠由中国医学科学院实验动物研究所提供；鼠成骨细胞株mc3t3e1购自american type culture collection公司；amem培养基为gibco公司产品；5氟尿嘧啶（5fu）购自上海旭东海谱药业有限公司；1，25（oh）2d3由丹麦lise binderup博士惠赠；胎牛血清（fcs）、牛血清白蛋白（bsa）、琼脂、il3、il6以及gmcsf均购自中国医学科学院血液病学研究所。
1.2 破骨细胞的培养 6周龄的c57雌性小鼠，按每只150 mg/kg的剂量注射5fu，5天后拉颈处死。取出脾脏，制备脾细胞，将其接种于含5×104 u/l il3、10-8 mol/l il6、300 ml/l fcs及10 g/l bsa的3 g/l amem半固体培养基中，于37℃、5%co2条件下培养15天。形成的细胞集落，接种于含2×105 u/l gmcsf和50 ml/l fcs的amem培养液中，培养条件同前。然后将培养液换成含1×10-8 mol/l 1，25（oh）2d3、100 ml/l fcs的amem培养液，上述条件再培养15天，于显微镜下观察到破骨细胞的生长。用1 g/l胰酶消化细胞，在培养液中充分摇匀，转种到22个培养皿中，于同样条件培养20天。挑选出2个培养皿，对皿中的破骨细胞抗酒石酸盐酸性磷酸酶染色（trap），可以更清晰地看到生长的破骨细胞，见图1～3。
1.3 成骨细胞的培养 将mc3t3e1细胞接种于含100 ml/l fcs的amem培养基中，37℃、5%co2培养20天左右，观察到成骨细胞生长。然后用1 g/l胰酶消化，在培养液中充分摇匀，转种到20个培养皿中，于相同条件培养20天。
1.4 实验分组、培养与细胞计数 培养20天的成骨细胞都充分生长，且30个皿内成骨细胞长势基本相同。将30个培养皿随机分为a、b和c组，每组10个平皿。a为实验组，b和c为对照组。将余下20个皿中生长的破骨细胞，用1 g/l胰酶消化并在培养液中混匀，平均加入到a、b组中，同时向a、c组每个皿内加入500 u的gmcsf，37℃、5%co2培养20天。最后将培养皿中的细胞用胰蛋白酶消化下来，显微镜下对实验组和对照组的成骨细胞计数，结果进行方差分析。
图1 经trap染色的破骨细胞（×400）（略）
fig.1 osteoclast stained by trap（×400）
图2 a组7号皿(×200)（略）
fig.2 number 7 of a group(×200)
图3 c组9号皿(×200)（略）
fig.3 number 9 of c group(×200)
2 结果
2.1 破骨细胞与成骨细胞的培养 成功地诱导培养出可供研究用的、量较大、纯度较高的破骨细胞，同时，用amem培养基培养出大量的成骨细胞。
表1 30个培养皿中成骨细胞的计数结果（略）
tab.1 the count of osteoblasts in 30 culture plates
note:1) p<0.05 vs b group；2) p<0.05 vs c group.
2.2 成骨细胞计数结果应用方差分析 应用spss 11.5软件，对3组结果分析。得到3组一起分析p值为0.01，a组与b组分析结果p值为0.03；a组与c组分析结果p值为0.01，都小于0.05，见表1。
3 讨论
我们参考kanatani等［3］和kurihara等［4］的方法，并进行适当改进，将源于小鼠脾的干细胞诱导培养出大量可供实验用的破骨样细胞。这有异于以往的破骨细胞骨髓分离法，我们诱导培养出的破骨细胞有两个特点：①数量大；②纯度高。
实验结果统计分析表明看到a组与b组和c组细胞数目存在显著差异（p值分别为0.03和0.01）。将实验设计为a组（gmcsf、破骨细胞与成骨细胞）、b组（破骨培养液与成骨细胞）和c组（gmcsf和成骨细胞）3组，这样排除了破骨细胞和gmcsf对成骨细胞的直接影响。相同条件下同时培养，使得3组的细胞得到了无差异的培养条件，尽量小地减少了环境和人为因素对细胞生长的影响，我们设计的实验排除了这2个干扰因素。实验结果显示gmcsf可以通过激活破骨细胞内的信号传导通路，不但引起破骨细胞分裂增殖，而且使得成骨细胞的数目更加增多，也说明了gmcsf使破骨细胞增殖而激活的信号传导通路间接影响了成骨细胞。
目前知道，gmcsf是通过激活细胞内的丝裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,mapk）以及三磷酸肌醇激酶（pi3k）等信号通路，起到细胞分化、增殖作用［5，6］。我们的研究表明gmcsf和其诱导的破骨细胞促进成骨细胞增殖，间接证实了破骨细胞中gmcsf介导的信号传导通路激活的表达蛋白可以作用于成骨细胞。这对于细胞间相互影响、作用的研究十分有意义，在以后的研究中，我们希望寻找到该表达基因。
致谢：感谢中国医学科学院放射医学研究所动物研究室王映兰、卫生统计学研究室范亚光博士给予动物实验、统计处理方面的帮助。
【参考文献】
1 朱 梅，杨福军，孙元明 et al.源于脾细胞的破骨细胞样细胞体外培养及其对成骨细胞的影响 ［j］.中华骨科杂志，2003;23（4）：239244.
2 孙元明，杨福军，李雨民 et al.源于脾干细胞的破骨细胞诱导生成及培养 ［j］.中国地方病杂志，2003;22（2）：57.
3 kanatani m,sugimoto t,takahashi y et al. esterogen via the estrogen receptor blocks campmediated parathyroid hormone(pth) stimulated osteoclst formation ［j］. j bone miner res,1998;13（5）:854862.
4 kurihara n, suda t, miura y et al. generation of osteoclasts from isolated hematopoietic progenitor cells ［j］. blood,1989;74(4):12951302.
5 kutsuna h, suzuki k, kamata n et al. actin reorganization and morphological changes in human neutrophils stimulated by tnf, gmcsf and gcsf: the role of map kinases ［j］. am j physiol cell physiol,2004;286(1):c55c64.
6 baumgartner m, chaussepied m, moreau m f et al.constitutive pi3k activity is essential for
