第1篇：肿瘤中卡介苗药物治疗的方法
膀胱肿瘤是泌尿系统中最常见的肿瘤，90%以上为移行上皮细胞癌，大部分为浅表性膀胱癌,除了用手术治疗以外，还须辅以抗肿瘤药物膀胱内灌注治疗，但有一定的复发率和应用药物的副作用，其中卡介苗是主要的治疗药物。本研究采用MNU膀胱灌注诱导建立大鼠膀胱肿瘤模型，用塞来昔布和卡介苗单独和联合用药，评价其疗效，以寻求更安全有效的膀胱肿瘤药物联合治疗方法。
1材料与方法
1.1材料实验动物及主要试剂5～6周龄Wistar雌性大鼠，由河北医科大学实验动物中心提供；MNU由美国Sigma公司生产；冻干卡介苗购自上海生物制品研究所；塞来昔布由美国辉瑞公司生产。
试剂的配制MNU溶液：用pH6.0的0.1mol/L枸橼酸缓冲液为溶剂，将MUN配成浓度为20mg/ml的溶液，每只大鼠用量0.1ml。BCG溶液：50mg/支冻干卡介苗溶于5ml生理盐水中，每只大鼠用量0.1ml。塞来昔布:每只大鼠用量100mg/kg，按大鼠体重确定其用量，溶于2ml生理盐水中。
1.2方法膀胱肿瘤大鼠模型的制备40只大鼠造模过程：灌注前腹腔内注射0.6%的戊巴比妥钠麻醉动物，剂量为2.5ml/kg。起效后仰卧固定，0.1%的碘伏消毒尿道外口后，用5cm硬膜外导管导尿排空膀胱后，接上带有6号半针头的1ml注射器按计划向膀胱内注入0.1mlMNU溶液，每2周1次，共5次。
分组及处理于第10周，将40只大鼠随机分为4组：PBS组，塞来昔布组、卡介苗组、塞来昔布+卡介苗组，每组10只。开始给予药物干预治疗，分别给予0.1mlPBS、100mg/kg塞来昔布、0.1ml卡介苗、100mg/kg塞来昔布+0.1ml卡介苗，PBS与卡介苗采用膀胱灌注给药，每周1次，共3次，塞来昔布采用灌胃给药，每天1次，共3周。
1.3标本处理病理切片观察：于第13周采用断颈法处死大鼠，解剖膀胱，完整切取膀胱，于膀胱前壁剖开，观察膀胱内表面及肿瘤形成的大体情况；在病变明显处切取部分肿瘤组织，置于中性福尔马林溶液中固定24h，常规石蜡包埋，4μm切片，HE染色，显微镜下观察。
1.4免疫状态检测：用免疫组化法分别检测切片中肿瘤组织中CD3+、CD4+、CD8+的表达量；TUNEL法检测肿瘤组织细胞的AI值。
统计学处理数据用x±s表示，所有实验数据均采用SPSS11.5软件进行处理,用SNK法进行多个样本均数的方差分析，以α=0.05作为检验水准。
2结果
诱发膀胱肿瘤情况解剖切开膀胱发现膀胱壁增厚、苍白、菜花状新生物形成，绝大多数为多发肿瘤。HE染色结果:移行上皮结构特征部分消失，呈弥漫分布或排列成实体性癌灶。细胞异形明显，表现为细胞大小不一，排列紊乱，极向消失，核畸形，核浆比例大，核分裂像明显。
每个视野计数100个细胞，计数3个视野，计算阳性细胞数占细胞总数的百分率。其余3组CD3+、CD4+、CD8+细胞的浸润百分比与PBS组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。联合用药组与卡介苗组及塞来昔布组比较，免疫细胞浸润更明显（P<0.05），联合用药可以增强免疫细胞在肿瘤组织局部的作用。
各组均出现不同程度的肿瘤细胞核呈棕褐色染色。其他实验组AI均明显高于PBS组（P<0.05）。且联合用药组与卡介苗组及塞来昔布组比较凋亡更明显，差异有统计学意义（P<0.05）。
3讨论
研究发现，以卡介苗为基础的联合灌注治疗能够明显地延长膀胱癌患者的总体生存时间。卡介苗发挥抗癌作用的主要方式是通过激活免疫系统而发挥作用[1]。
近期研究表明,在浅表性膀胱癌和人类其他肿瘤的癌组织和细胞系中检测到COX-2蛋白及分子水平都有高表达[2-4]。COX-2诱导产生的PGE2分泌增加与机体免疫抑制相关，PGE2能降低机体的抗肿瘤免疫而促进肿瘤的生长[5]。研究认为，塞来昔布抗肿瘤效应主要是通过降低PGE2水平从而增强免疫系统的功能来起作用的。
研究表明，在BCG激活的膀胱肿瘤局部免疫中，CD4+T细胞在膀胱黏膜下层的浸润是最重要的，CD4+T细胞的表达量直接关系到BCG激活的免疫系统的效能[6]。本实验结果显示，联合用药组CD3+、CD4+T细胞比单独用药组有显着的增长，其差别有统计学意义。本研究中，CD8+T细胞的表达量用药组比PBS组均减小，联合用药组减少更显着。研究表明，CD8+T细胞在用药治疗早期是升高的，但是治疗后期会下降，这与大量的CD8+T细胞作用于肿瘤细胞，杀伤肿瘤细胞的同时，自身也崩解、凋亡有关。塞来昔布组与PBS组比较，肿瘤免疫细胞的表达量的差异无统计学意义，这说明在无BCG激活局部免疫反应的条件下，使用塞来昔布难以充分调动机体的免疫反应，其抗肿瘤效应主要是通过抑制PGE2的产生从而提高肿瘤定向细胞毒性作用[7]。说明联合使用塞来昔布和卡介苗可以更大地激活免疫系统的反应性。
凋亡细胞指数是衡量组织中细胞凋亡发生程度的一项指标，本实验通过TUNEL法检测各组肿瘤组织的凋亡细胞，观察药物对肿瘤细胞的凋亡和生长抑制的影响。本研究中，联合用药组的AI值明显高于其他各组，差别有统计学意义。说明联合塞来昔布和卡介苗能显着增加肿瘤细胞的凋亡，抑制其分化增值。
综上所述，塞来昔布联合卡介苗治疗膀胱肿瘤，比单纯使用卡介苗及塞来昔布更有效，但要成为一种新的膀胱肿瘤的治疗方法，还需要进一步的试验和研究。
作者：刘彦斌，米振国，杨新晶，任连生
第2篇：卡介苗治疗肿瘤的启示
膀胱癌是沁尿系统最常见的恶性肿瘤，其中约75%为浅表性膀胱癌，它的特点是极易复发。如何降低肿瘤复发一直是人们探究的焦点。自1976年莫拉莱斯将卡介苗（BCG)，灌注膀胱成功地治疗人膀胱癌以来[1]，国内外对BCG的治疗做了许多基础和临床研究。现在，BCG膀胱内灌注也成为膀胱原位癌和浅表性膀胱癌的一种最有效的治疗手锲2。2002年，巴锡(Bassi)总结了1496例病人的临床研究资料证明，BCG治疗膀胱原位癌的完全缓解率为60%~79%[3]。
目前认为BCG治疗膀胱癌是肿瘤免疫治疗最为成功的范例之一。因此，对BCG治疗膀胱癌机制的分析和探讨可能为正在开展的肿瘤细胞免疫治疗提供一些新的研究策略。
1BCG治疗浅表性膀觥癌的免疫机制
由于膀胱的解剖特征，BCG灌注后能与肿瘤细胞和肿瘤内的基质细胞充分接触，治疗后的组织学和细胞学检查以及尿中的免疫细胞和肿瘤细胞等产生的细胞因子和其他产物，均可通过膀胱镜和尿液检查获得，这为全面了解治疗机制提供了详细的信息。
当BCG灌注膀胱后，在纤连蛋白的介导下，尿道上皮细胞和肿瘤细胞将其内吞，被内吞后消化处理的菌体蛋白、脂类、小分子肽和糖类物质可以更好的刺激和募集免疫效应细胞，产生一系列免疫级联反应。通过膀胱镜活检和尿液细胞学检查证实，参与免疫反应的细胞既有固有免疫应答细胞也有适应性免疫应答细胞。在参与的这些细胞中树突状细胞（DC)起到非常关①解放军第九七医院江苏徐州键的作用，因为它既可以激活固有免疫细胞产生非特异性免疫应答，又可以激活T细胞产生特异性免疫应答。
研究证实，膀胱癌组织中树突状细胞浸润数与预后密切相关[4]。近些年研究表明，结核杆菌低分子多肽抗原可特异性地扩増免疫Y沏细胞。Y沏细胞对多种肿瘤细胞具有杀伤溶解活性，它对抗原的识别是MHC非限制性的，能直接识别应激抗原、磷酸化抗原和热休克蛋白等内源分子，在卡介苗膀胱灌注后，可在膀胱癌组织中检出激活的Y茳细胞。
此外，BCG中的一些成份是广泛表达于免疫细胞表面的Toll样受体配基，它们之间的相互作用同样能诱发细胞因子的合成和分泌，诱发炎症反应，促进DC向T细胞提呈抗原，启动T细胞应答，从而使固有免疫和适应性免疫紧密相联。因此，BCG膀胱灌注后几乎引发了机体固有免疫和适应性免疫中的所有抗肿瘤免疫效应细胞。
如果把上述抗肿瘤免疫效应细胞比喻为参加战争中的各军兵种的士兵，那么免疫细胞释放的各种介质、细胞因子和趋化性细胞因子等则形成信息传递系统和武器系统，只有这些系统运转正常，才能最终杀死癌细胞。膀胱内灌注BCG后，除了激活各种免疫效应细胞释放细胞因子外，膀胱粘膜上皮细胞和肿瘤细胞等也产生一些细胞因子，在这些细胞因子中，重要的有IL一12、IFN—r?和IL一2这些细胞因子通过庞大的免疫细胞网络调节效应来扩大和増强其抗肿瘤作用。此外BCG膀胱内灌注后，也可被肿瘤细胞内化，促进肿瘤细胞表面MHC—II类分子、细胞内粘附分子1和Fas受体的表达，这样免疫效应细胞就能容易识别和粘附肿瘤细胞，通过Fas—FasL和穿孔素等作用使其凋亡和死亡。
2BCG成功治疗膀觥癌对肿瘤免疫治疗的启示
现代研究表明，固有免疫和适应性免疫应答中的细胞均参与抗肿瘤免疫，如树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞、Y茳细胞、CD3+/CD8+T细胞和CD3+细胞，其中树突状细胞既参与固有免疫应答，也参与适应性免疫应答。从上述可以看出，BCG膀胱内灌注后参于的细胞如此众多，与参于调节的细胞因子、协同刺激分子、粘附分子和集落刺激因子等组成一个复杂的抗肿瘤免疫效应网络，细胞产生的细胞因子作用于不同的靶细胞，效应细胞之间的相互作用通过信息分子又刺激放大这些细胞的免疫效应功能，使得抗肿瘤免疫效应既充分又持久，从而取得很好的临床治疗效果。在涉及的细胞因子中多为Thl细胞因子，未能检出Th2细胞因子中的关键分子IL一4通过对患膀胱癌小鼠基因剔除技术发现，IL一12和顶F—Y是抗肿瘤关键分子。从上述治疗的免疫病理性改变和取得的临床疗效给我们许多启示：
2.1有效的肿瘤生物治疗必须联合固有免疫和适应免疫反应中的免疫细胞协同作用从20世纪80年代，美国国立癌症研究所罗森伯将淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK细胞）应用于恶性肿瘤治疗，迄今，己用于临床试治的免疫效应细胞有A-LAK、肿瘤浸润淋巴细胞、CD3单抗激活的杀伤细胞（主要为多克隆CD3+/CD8+T细胞和细胞）、巨噬细胞、以树突状细胞为基础的免疫治疗(成熟和未成熟的树突状细胞、肿瘤抗原致敏的树突状细胞）、细胞因子激活的杀伤细胞（由细胞和CD3+/CD4+T细胞和NKT细胞组成）、肿瘤抗原致敏的树突状细胞诱导的肿瘤特异性T细胞等，这些细胞单独应用和联合其他治疗方法均取得一定的治疗效果[6_'但是由于治疗的肿瘤患者大多为晚期，肿瘤负荷大，且多数己发生转移，此时患者除了肿瘤细胞产生的免疫抑制分子如TGF—卩、IL一10、半乳凝集素等抑制T细胞和降低淋巴细胞介导的细胞毒外，患者体内还出现CD4+CD25+T细胞増多，树突状细胞和细胞毒T细胞等抗肿瘤效应细胞数质量方面的改变。因此，使用上述单一种免疫细胞治疗常具有两方面的不足:一是输入体内细胞数量常不足以抗衡体内为数众多的肿瘤细胞，二是单一种免疫细胞通常不能形成一个高效的抗肿瘤免疫细胞网络，这可能是疗效不佳的重要原因[8]。
将BCG膀胱内灌注治疗浅表性膀胱癌的细胞生物学和分子免疫机制与近年提出的肿瘤免疫编辑理论结合起来进行分析，我们认为，肿瘤在经过相持期后发展到免疫逃逸期，机体体内参于抗肿瘤的固有免疫和适应性免疫反应的细胞中，存在着多种细胞功能障碍和多种信号传导途径缺陷。因此，在肿瘤治疗上除了“大综合”即手术切除(尽可能去除肿瘤负荷，减少肿瘤所致免疫抑制）放疗和化疗(二者除了减少肿瘤负荷外，放疗和某些药物还可使肿瘤细胞坏死凋亡，便于抗原提呈细胞加工处理肿瘤抗原)外，在生物治疗上也应采取“小综合”治疗，如生物应答调变剂IFN、IL—2、OK432和香茹多糖等与免疫细胞的联合应用，固有免疫细胞如NK细胞、NKT细胞、Y贫细胞和巨噬细胞与适应性免疫细胞aT细胞以及树突状细胞联合应用，这样才能取得好的疗效。我们近几年用树突状细胞联合CIK细胞(?町细胞和NKT细胞）治疗一些晚期肿瘤，取得较好疗效。我们还应用树突状细胞和巨噬细胞皮下或淋巴结内注射、环磷酰胺静注和3个疗程的CIK回输，使一例晚期胆管细胞癌和1例无法手术切除的肝癌到达完全缓解。分析其原因，可能是由于环磷酰胺抑制体内细胞功能和通过巨噬细胞和树突状细胞的补充，充分引发了体内固有免疫和适应性免疫反应细胞，加上补充足够量的特异性和非特异性杀伤肿瘤的免疫效应细胞所致。体内抗肿瘤免疫尤如一场战争，必须充分了解掌握信息(肿瘤抗原的识别)，“各军兵种(各种类型细胞)密切配合，集中兵力协同作战”才能打赢这场战争。
2.2使用的生物反应调节剂和免疫细胞必须与肿瘤细胞直接作用才能发挥最有效的抗肿瘤作用从BCG灌注治疗中还有一点值得重视的就是BCG和免疫效应细胞与肿瘤细胞的直接接触，只有这样才能触发一系列免疫反应并直接杀伤肿瘤细胞，己有许多报告显示BCG肿瘤内应用效果好于其他应用途径。由于实体瘤中心缺乏血管，因此，尽量将BCG和免疫细胞注入瘤体中心，以发挥最有效的抗肿瘤效应。我们曾将树突状细胞和CIK注入己经无水乙醇瘤体内注射治疗后的肝癌中，取得明显的疗效[1q。依据上述原理，我们将患者自身的树突状细胞和CIK细胞膀胱内灌注和静脉回输相结合，治疗1例晚期膀胱癌取得较好效果。
2.3对BCG的分子改造可使其更有效地用于肿瘤治疗现己清楚IFN—r、IL—2、和IL—12等在免疫反应中起着关键作用。因此，可将BCG作为这些细胞因子基因的表达载体使其集佐剂与载体为一体使免疫作用更为有效。这种新型BCG疫苗可能会起到如下作用：（1)由于肿瘤微环境中的免疫抑制作用，常使浸润于肿瘤组织中的免疫细胞不能増殖和发挥杀伤功能，如BCG瘤体内直接使用，它分泌的细胞因子可活化和促进这些细胞増殖，提高其杀瘤活性；（2)BCG的瘤内注射后分泌的细胞因子直接作用瘤内免疫细胞和瘤细胞，这样可以减轻这些细胞因子全身使用所产生的副作用；(3)还可以根据不同的肿瘤导入相关肿瘤抗原基因，使其在体内诱导产生肿瘤特异性细胞毒T细胞。相信人们可以从上述治疗中得到许多启示，设计出新型的抗肿瘤BCG疫苗。
综上所述，我们认为体内发生的任何一件重大事件(如肿瘤、心脑血管疾病、自身免疫性疾病等）均是经历了长时间、多途径和多因素所致，要想处理和预防此类事件，也必须要多种方法经过长时间、多阶段才能完成，事件，也必须要多种方法经过长时间、多阶段才能完成。
作者：陈复兴1 李玺1刘军权1 许承斌1（解放军第九七医院江苏徐州221004）
