作者：龚淑琪，傅颖媛，孙午，姜青龙，舒奇
【摘要】 目的研究黄芩苷对人外周血t细胞表面tcr vβ mrna表达的影响及其可能受体。方法采用尼龙毛柱法分离t淋巴细胞，将其分为空白对照组（t1）、黄芩苷组（t2）、抗体封闭用药组（t3）、抗体封闭对照组（t4），37℃培养48h，trizol法提取总rna，实时荧光rt-pcr法检测各组tcr vβ mrna表达。结果t2组较t1组tcr vβ mrna的表达明显增强（p﹤0.01）；t3组较t2组tcr vβ mrna的表达明显减低（p﹤0.01）；t3组较t4组tcr vβ mrna的表达增高（p>0.05）。结论黄芩苷能显著增加t细胞表面tcr vβ mrna的表达；t细胞受体（tcr αβ）是黄芩苷作用于t细胞的主要受体之一。
【关键词】 黄芩苷； t细胞受体； tcr vβ mrna； 实时荧光rt-pcr
abstract：objectiveto study the effect of baicalin on the mrna expression of tcr vβ on the surface of human peripheral blood t cells and explore the possible receptor for baicalin.methodst cells were separated by nylon fiber column method, and diuided into four groups: blank control group(t1), baicalin group(t2), antibody blocking 4 drug group(t3) and blocking control group(t4). after incubation for 48 h, the tcr vβ mrna expression in different groups was detected by real-time fluorescent rt-pcr. results1.the tcr vβ expression of t2 group was significant higher than that of t1 group(p﹤0.01). 2.the tcr vβ expression of t3 group was obviously decreased compared with t2 group(p﹤0.01). 3. the tcr vβ expression of t3 group was higher than that of t4 group(p>0.05). conclusionbaicalin can improve the tcr vβ expression significantly and the tcr αβ is one of the major receptors for baicalin
key words：baicalin; tcr; tcrvβ mrna; real-time fluorescent rt-pcr
黄芩是一种唇形科多年生草本植物的干燥根，作为药用已有上千年的历史，其味苦、性寒，具有清热解毒、凉血止血、除热安胎的功效。wWW.133229.coM其主要活性成分黄芩苷（分子式c21h18o11、分子量446.35）是一种黄酮类化合物，研究发现黄芩苷具有抗病毒［1］，抗炎症［2］，抗肿瘤［3］及免疫调节的作用［4］。其中对黄芩苷免疫调节机制的研究，尤其是抗病毒、抗肿瘤方面的免疫调节机制已成为学者们关注的热点问题之一，但目前的研究大多局限于细胞水平。本实验在本室既往摸索的黄芩苷最佳体外作用浓度及促进t、b细胞体外增殖研究的基础上，从黄芩苷对tcr vβ mrna表达的影响入手，结合抗体封闭技术，试图从分子水平上探索黄芩苷作用t细胞表面的可能受体。
1 材料与仪器
1.1 细胞及药品人外周血浓缩白细胞购自江西省血液中心，黄芩苷由江西省中医药研究所提供（纯度＞98%）。
1.2 试剂及仪器鼠抗人tcr（αβ）单克隆抗体（美国bd公司），revertaidtm first strand cdna synthesis kit（mbi 公司），trizol试剂、sybr green qpcr试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），myiq实时荧光定量pcr仪（美国bio-rad公司）。
1.3 qpcr引物由primier primer 5.0 软件设计，上海生工生物工程有限公司合成。以β-actin（β-肌动蛋白）为内参基因，序列如下：
tcrvβ (xm_001716513) 141bp forward 5’-ggggctgaggctgatt-3’ reverse 5’-acagatgtttgggaggga-3’
β-actin (nm_001101) 128bp forward 5’-tgtgacgtggacatccg-3’ reverse 5’-atcttcattgtgctgggtg-3’
2 方法
2.1 t细胞分离参见文献［5］应用密度梯度离心法从血浓缩白细胞中分离pbmc，再利用玻璃贴壁法去除单核细胞，最后将收集的淋巴细胞用尼龙毛柱法分离t细胞。洗涤收集的t细胞，用0.2%台朌蓝染色计数细胞活率（≥95%），补体依赖细胞毒实验（cdc）鉴定t细胞纯度（≥90%），最后调整细胞浓度为5×106/ml。
2.2 实验分组按表1分组加样后转种于24孔板上，置37℃ 5%co2箱培养48 h。表1 t细胞分组加样表（略）
2.3 总rna提取及鉴定①利用trizol试剂提取总rna。②100v、1%琼脂糖凝胶电泳观察总rna完整性。③紫外分光光度计测定od260/od280，在1.80～2.0之间，说明纯度较好，并计算总rna的浓度。
2.4 实时荧光定量rt-pcr以5μg总rna为模板按试剂说明书逆转录为第一链cdna，逆转录反应体系为20 μl。qpcr反应体系为50 μl：cdna 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、supermix 25 μl、sybr green dye 1μl、mg2+ 2μl补足双蒸水至50 μl。每个样本做3个复孔，取三孔的平均值分析。qpcr扩增程序：cycle 1: ( 1×) 95.0℃for 05:00; cycle 2: ( 45×) 95.0℃for 00:15 ,53.0℃for 00:30 , 72.0℃for 00:30，72.0℃延升阶段收集荧光信号。循环结束后增加熔点曲线程序以观察产物特异性：cycle 3: (1×): 95.0℃for 01:00; cycle 4: (1×) 55.0℃for 01:00; cycle 5:( 80×) 55.0℃for 00:30,每个循环升温0.5℃并收集荧光信号。
2.5 统计分析利用livak法［6］即2 – δδct来计算各实验组相对于空白对照组的tcrvβ相对表达量，以β-actin作为校正基因，δδct=（cttcrvβ-ctβ-actin）实验组-（cttcrvβ-ctβ-actin）t1。各组数据以mean±s的形式描述，并利用spss17.0做单因素方差分析（方差齐性检验、snk多重比较），p<0.05为有统计学意义。
3 结果
3.1 qpcr扩增结果图1～4。熔解曲线结果显示tcrvβ、β-actin分别在86℃，89℃附近出现单峰，与产物解链温度吻合，表明引物设计合理具有特异性。根据扩增ct值按公式2 – δδct计算得到t1，t2，t3，t4组的tcrvβmrna相对表达比率分别是1.0，（4.388±0.917），（1.717±0.493），（1.040±0.293），表明t2组tcrvβmrna表达较t1组明显增加，而t3组tcrvβmrna表达较t2组明显抑制，但较t4组仍有增加。
3.2 各实验组tcr vβ mrna相对表达比率见图5。将计算所得的各组tcr vβ mrna相对表达率做anvoa统计分析，结果表明t2组较t1组tcr vβ mrna的表达明显增强（p﹤0.01）； t3组较t2组tcr vβ mrna的表达明显减低（p﹤0.01）；t3组较t4组tcr vβ mrna的表达增高（p>0.05）。
4 讨论
tcr即t 细胞受体是t细胞特异性识别抗原的受体，是所有t细胞的特征性表面标志，可分别由α、β链或γ、δ链构成异二聚体，外周血中以tcrαβ为主，αβ t细胞也是参与免疫应答的主要细胞群［7］。tcr α、β链分别由v（variable）-d（diversity）-j（junctinal）集合与c（constant）恒定区构成，在胸腺的分化过程中，每条链都经历了复杂的基因重组、重排过程。通过v-d-j区的随机重排、重组形成高度多样性的tcr，从而可以特异性识别环境中千变万化的抗原。作用tcr的抗原分普通抗原和超抗原，普通抗原即一般的蛋白质、多糖类抗原，经由抗原呈递细胞(apc)加工处理后形成抗原肽-mhc复合物表达apc表面，在cd4/cd8分子的辅助下与tcrα、β链特异性结合，由cd3分子将活化信号传入t细胞内，刺激t细胞发生特异性免疫应答。而某些逆转录病毒（如hiv）、细菌毒素类超抗原，则不需要apc加工处理可直接与mhc-ⅱ、tcr vβ分子结合活化t细胞，在某些细胞因子辅助下甚至不需要mhc-ⅱ分子参与也可以经tcr vβ途径活化t细胞。
近年来利用多重pcr检测tcr vβ家族谱变化在对自身免疫性疾病、感染性疾病的免疫发病机制方面的研究报道较多，jae seonlee等［8］研究发现胶原诱导大鼠的类风湿关节炎模型中，从大鼠淋巴结引流液中检测出cd+4t细胞 vβ+3亚型明显增加，并证实此亚型t细胞可诱导其它非应答t淋巴细胞群发生免疫应答，其可能是类风湿关节炎发病机制之一。 monica kharbanda等［9］研究发现在儿童hiv病毒感染患者中常伴随有明显的tcr vβ谱变化，其中55% cd+8tcr vβ表达增强，这可能与促进cd+8t细胞对病毒的细胞毒性作用有关。jorge clare＾ncio等［10］研究发现利什曼原虫疫苗接种志愿者外周血cd+4，cd+8tcr vβ表达均增强，并证实tcr vβ12的表达与ifn-γ的分泌、t细胞的活化有关。这些均说明tcr vβ在抗感染免疫中有活化t细胞、增加cd+8t细胞的细胞毒作用以及促进抗病毒细胞因子分泌的作用。王辉等［11］研究还发现肝癌患者也伴随有特异性的tcr vβ7.1表达降低，通过质粒构建将该tcr vβ基因转染入人外周血淋巴细胞后可明显增加外周血淋巴细胞的抗肿瘤活性，诱导肿瘤细胞凋亡。
国内外研究发现黄芩苷具有一定的抗hiv、hbv病毒作用以及抗肿瘤活性，因此考虑黄芩苷可能与病毒抗原有共同的作用途径。本实验从genebank中选择了一段相似于人t细胞受体β链v区前体（t-cell receptor beta chain v region c5 precursor）的序列作为目标基因，以外周血t淋巴细胞为研究对象，分别设空白对照组(t1)、黄芩苷组(t2)、抗体封闭用药组(t3)以及抗体封闭对照组(t4)，利用实时荧光rt-pcr检测各组细胞tcr vβ目标基因的相对表达变化，我们的结果显示：黄芩苷能显著增加t细胞表面tcr vβ的表达（p﹤0.01），提示黄芩苷可能是通过增加t细胞表面tcr vβ的表达来增加t细胞的抗病毒及抗炎活性，并且这也可能与黄芩苷的抗肿瘤作用有关；其二抗tcr（αβ）单抗体封闭tcr后能明显抑制黄芩苷对tcr vβ的影响（p﹤0.01），尽管抗体封闭后用黄芩苷干预tcr vβ表达较抗体封闭对照组略有增高，但无明显统计学意义（p>0.05），提示tcr可能是黄芩苷作用于t细胞的主要受体之一。此外，抗体封闭组tcr vβ表达较空白组略有升高（p>0.05），这表明抗tcr（αβ）抗体对t细胞有一定的刺激作用，其机制可能与抗tcr（αβ）抗体结合tcr后诱导tcr相互交连，促使tcr活化有关。
综上所述，黄芩苷能显著增加t细胞表面tcr vβ mrna的表达并且t细胞受体（tcr αβ）是黄芩苷的主要作用受体之一。
【参考文献】
1］qian wang, yu-tian wang, shao-ping pu, et al. zinc coupling potentiates anti-hiv activity of baicalin［j］. biochem bioph res co, 2004,324:605.
［2］teresa krakauer, bao qun li, howard a young, et al. the flavonoid baicalin inhibits superantigen-induced inflammatory cyrokines and chemokines［j］. febs letters, 2001,500:52.
［3］franky l chan, h l choi, z y chen, et al. induction of apotosis in prostate cancer cell lines by a flavonoid baicalin［j］. cancer letters, 2000,160:219.
［4］tan bk, vanitha j. immunomodμlatory and antimicrobial effects of some traditional chinese medicinal herbs［j］.curr med chem, 2004,11(11):1423.
［5］季敬璋,吕建新.免疫磁珠及尼龙毛分离纯化t淋巴细胞的比较研究［j］.温州医学院学报,2005,35 (1):4.
［6］kenneth j. livak,thomas d. schmittgen.analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the 2 – δδct method［j］. methods,2001,25: 402.
［7］eva geissinger,irina bonzheim,la′ szlo′ krena′ cs, et al. identification of the tumor cells in peripheral t-cell lymphomas by combined polymerase chain reaction-based t-cell receptorβ spectrotyping and immunohistological detection with t-cell receptor β-chain variable region segment-specific antibodies［j］. journal of molecular diagnostics, 2005,7(4):455.
［8］jae-seonlee,mi-la cho, joo-yeon jhun, antigen-specific expansion of tcr vc t cells in the early stage of collagen-induced arthritis and its arthritogenic role in dba/1j mice［j］. journal of clinical immunology,2006,20(3):204.
［9］monica kharbanda, thomas w. mccloskey, rajendra pahwa, et al, alterations in t-cell receptorvβ repertoire of cd4 and cd8t lymphocytes in human immunodeficiency virus-infected children［j］. clinical and diagnostic laboratory immunology,2003,10(1):53.
［10］jorge clare＾ncio,camila i. de oliveira, glo′ria bomfim, et al. characterization of the t-cell receptor vβ repertoire in the human immune response against leishmania parasites［j］. infection and immunity, 2006, 74(8):4757.
［11］王辉,罗利琼,林月霞.tcrvb7.1基因转染外周血单个核细胞后表达及抗癌作用［j］.广东药学院学报,2005,21(3):318.
