【摘要】 目的 探讨cd4+cd25+cd127-调节t细胞（treg）在类风湿关节炎中的诊断价值及临床意义。方法 选取42例类风湿关节炎（ra）患者和20正常健康者分为两组，采用流式细胞仪检测两组调节t细胞的表达频率，检测两组实验室指标，观察两组实验室指标与调节t细胞的关系。结果 与正常对照组相比，ra组白细胞（wbc）、免疫球蛋白a（iga）、抗链球菌溶血素o（aso）、类风湿因子（rf）、糖酸蛋白（α1-agp）、c反应蛋白（crp）、血沉（esr）显著升高（p<0.05或p<0.01）；血红蛋白（hb）、cd25+t细胞、cd4+cd25+t细胞、cd4+cd25+cd127-t细胞的表达频率降低（p<0.05）。spearman相关分析显示，cd25+t细胞与hb 、igm、esr呈正相关，cd4+cd25+cd127-t细胞与igm呈正相关（p＜0.01或 p＜0.05）；cd25+t细胞与rbc、iga呈负相关，cd4+cd25+t细胞与补体c4呈负相关，cd4+cd25+cd127-t细胞与aso呈负相关（p＜0.05）。结论 cd4+cd25+cd127-treg在ra患者的外周血中显著降低，并且与疾病的活动性高度相关，说明调节t细胞可能参与了ra的发病，早期检测可能为ra的诊断及治疗提供依据。
【关键词】 类风湿关节炎 cd4+cd25+cd127-调节t细胞 流式细胞术 免疫学机制
detection of regulatory cd4+cd25+cd127-t cells in asthma patients and its clinical significance
wang qinbao，liu jian, wan lei
clinical laboratory center the first affliated hospital of anhui college of tcm, hefei 230031，china
［abstract］ objective to evaluate the diagnosis and clinical significance of t cells (treg) in rheumatoid arthritis.methods forty-two cases of rheumatoid arthritis (ra) patients and twenty normal healthy volunteers were chosen for this study. the proportion of cd4+cd25+cd127t cells population in total t cells was evaluated by flow cytometric analysis. detect two groups of laboratory indexes, the relationship between t-cell and two sets of laboratory indicators was observed.results compared with normal control group, white blood cell (wbc), immunoglobulin a (iga), anti-streptolysin o (aso),rheumatoid factor (rf), sugar acid protein (α1-agp), c reaction protein (crp) and erythrocyte sedimentation rate (esr) was significantly higher (p<0.05 or p<0.01) in ra group the frequency of expression in hemoglobin (hb), cd25+ t cells, cd4+ cd25+t cells, cd4+cd25+cd127 - t cells is reduced （p<0.05）in ra group. spearman correlation analysis showed that cd25+t cells had significantly positive relation ship with hb, igm and esr. cd4+ cd25+cd127-t cells had significantly positive relation with igm；cd4+t cells had significantly negative relation ship with rbc,plt,iga,igm,rf,α1-agp and esr. cd25+ t cells had significantly negative relation with rbc and iga. cd4+cd25+t cells had significantly negative relation with complement c4. cd4+cd25+cd127-t cells had significantly negative relation with aso.conclusion cd4+cd25+cd127-treg was significantly lower in the peripheral blood of ra patients, and was closely related to the disease activity. t cells may be involved in the pathogenesis of ra, and early detection of ra may provide a basis for the diagnosis and treatment.
［key words］ rheumatoid arthritis；cd4+cd25+cd127-regulating t-cell；flow cytometry； immunological mechanisms
类风湿关节炎(ra)是以慢性多发性关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病，其疾病的发生、发展与细胞免疫功能紊乱,细胞异常活化和细胞亚群的平衡失控密切相关。WWW.133229.CoMra源于免疫平衡失调,机体通过多种机制调控自身免疫应答,其机制十分复杂。调节性t细胞在免疫平衡机制方面起着重要作用,但其在ra发病机制中的作用尚不清楚。本文研究了cd4+cd25+cd127-调节t细胞在ra患者体内表达数量与疾病活动性、实验室指标关系，进而探讨ra在免疫学的发病机制。
1 对象与方法
1.1 研究对象
42例ra患者来自我院风湿免疫等科室2008年7月至2009年8月住院和门诊患者，其中男性10例，女性32例，男∶女=1∶3.2，年龄19～68岁，平均（47.2±11.6）岁，病程0.5～27年，平均（8.9±6.2）年。所选病例在近2年内均未应用过免疫抑制剂或激素，排除合并其他疾病。根据ra疾病活动指数分为复发活动组30例和稳定期组12例。20例正常人对照为来我院体检者,体检结果无明显异常且年龄相匹配，男性8例，女性12例，男∶女=2∶3，年龄22～64岁，平均（40.2±14.7）岁。两组年龄、性别的差异均无统计学意义（p>0.05）。
1.2 诊断标准
1.2.1 西医诊断标准
参照1987年美国风湿病学会(ara)修订的诊断标准［1］。
1.2.2 纳入标准
所有纳入的患者均需符合下列全部条件：①符合上述西医疾病诊断标准。②年龄17～70岁。
1.3 方法
1.3.1 主要试剂：荧光标记的抗体：异硫氢酸荧光素（fitc）标记的鼠抗人cd4单抗（抗cd4-fitc单抗）、藻红蛋白(pe)标记的鼠抗人cd25单抗(抗cd25-pe单抗)、藻红蛋白-青色素染料5 (pe-cy5)标记的鼠抗人cd127单抗(抗cd127-pe单抗)试剂盒，相应同型对照抗体为apc标记的小鼠igg1, fitc标记的小鼠igg1、pe标记的小鼠igg1、pe-cy5标记的小鼠igg1，溶血素均购自美国 beckman coulter公司；rf、igg、iga、igm、c3、c4试剂盒及其配套试剂购自英国伯明翰公司；crp、ccp试剂盒均购自欧蒙医学实验诊断有限公司。
1.3.2 实验器材：流式细胞仪（美国beckman coulter公司epics xl流式细胞仪）；全自动酶标仪680（美国biorad公司）；全自动血细胞分析仪（美国beckman coulter lh-750）；血沉仪（上海迅达医疗仪器公司）；微量加样器（德国eppendorff公司）。
1.3.3 标本制备：患者及正常人均为清晨未起床前空腹、平卧位采取肘静脉血抽取5 ml，离心，取上清备用；取血2 ml，加肝素20 u/ml抗凝，用于检测调节t细胞。
1.3.4 cd4+cd+cd127-treg细胞百分率的测定：分别取正常对照组、ra组抗凝全血100 μl,分别先后加入10 μl cd4-fitc、20 μl cd25-pe、10 μl cd127-pe-cy5,抗体,平行设3管同型对照。室温下避光孵育15～30 min，加入红细胞裂解液1ml，室温避光放置15～20 min，振荡混匀，1 400 r/min离心5 min，弃上清，用2 ml pbs洗涤1次，加入400 μl pbs重新浮悬细胞，上流式细胞仪检测。
1.3.5 流式细胞仪检测：采用美国beckman coulter公司epics xl流式细胞仪，根据前向散射光和侧向散射光以淋巴细胞群设门，分别测定ra组和正常对照组的cd4+cd25+t细胞、cd4+cd+cd127-t细胞占cd4+t细胞的百分率。
1.3.6 实验室指标的测定：按相关试剂盒操作步骤测定。
1.4 统计学方法
采用spss11.5软件，计量资料用±s表示，成组资料比较采用t检验，配对资料比较采用配对t检验，相关分析采用spearman相关分析法,检验水准为0.05。
2 结果
2.1 ra患者与正常健康者实验室指标的比较
在42例ra患者中ccp抗体阳性者30例,阳性率71.2%；rf阳性者34例，阳性率80.4%。与正常对照组相比，ra组白细胞（wbc）、免疫球蛋白a（iga）、抗链球菌溶血素o（aso）、类风湿因子（rf）、糖酸蛋白（α1-agp）、c反应蛋白（crp）、血沉（esr）显著升高，差异有统计学意义（p<0.05或p<0.01）；血红蛋白（hb）降低，差异有统计学意义（p<0.05）；ra组血小板计数（plt）升高，但两者差异无统计学意义（p>0.05）。见表1。表1 ra患者与正常健康者的实验室指标的比较（略）
2.2 ra患者与正常健康者treg表达频率的比较（图1，2）
与正常对照组比较，ra组的cd25+treg、cd4+cd25+treg、cd4+cd+cd127-treg的百分率明显降低，差异有统计学意义（p<0.01）。见表2。表2 ra组和正常组treg表达频率的比较（略）
2.3 不同性别、临床分期ra患者treg表达频率的比较
cd4+cd25+cd127-treg在性别之间无明显差异，随着病程的延长treg频率呈降低趋势，患者处于急性活动期其treg表达频率明显低于缓解期，两者之间差异有统计学意义（p＜0.01）。见表3。表3 ra患者treg在性别、临床分期的比较（略）
2.4 ra患者treg表达频率与wbc等实验室指标的相关分析
ra患者treg与实验室指标的spearman相关分析显示，cd25+t细胞与hb、igm、esr呈正相关，cd4+cd25+cd127-t细胞与igm呈正相关，相关结果有统计学意义（p＜0.01或p＜0.05）；cd25+t细胞与rbc、iga呈负相关，cd4+cd25+t细胞与补体c4呈负相关，cd4+cd25+cd127-t细胞与 aso 呈负相关，相关结果有统计学意义（p＜0.05）。见表4。表4 ra患者treg与实验室指标等的相关分析（略）
3 讨论
ra是一种累及周围关节为主的多系统性自身免疫疾病,其特征为对称性、周围性多关节慢性炎性病变,病程常呈持续反复发作, 其病因和发病机制尚未清楚。血沉(esr)、c反应蛋白(crp)、类风湿因子(rf)均已被认为与本病活动性有一定关系。近年来研究发现血小板不仅具有凝血和止血功能,而且参与了ra的炎症和免疫反应［2］。同时一群具有抑制免疫反应作用的调节性t细胞参与了ra的发生［3］。
本组研究显示，与正常健康者相比，ra患者iga、aso、rf、α1-agp、crp、esr显著升高；ra患者的cd25+t细胞、cd4+cd25+t细胞、cd4+cd25+cd127-t细胞的百分率明显低于健康者，并且随着病程的延长treg表达频率有降低趋势，在急性活动期，treg表达频率明显低于缓解期。相关分析可知，cd25+t细胞与hb 、igm、esr，cd4+cd25+cd127-t细胞与igm均呈正相关（p＜0.01或p＜0.05）； cd25+t细胞与rbc、iga，cd4+cd25+t细胞与补体c4，cd4+cd25+cd127-t细胞与 aso 均呈负相关（p＜0.05）。提示调节说明在ra的发生、发展中细胞因子和免疫复合物发挥着重要作用，疾病的进一步加重可能跟免疫耐受的降低有关。
cd4+cd25+调节性t细胞不但参与对自身抗原外周耐受的主要t细胞群,而且还作为对外来抗原应答的调节性t细胞，对于维持外周免疫耐受有重要意义［4］。最近研究发现,在新鲜分离的正常人外周血t细胞中cd127和foxp3表达呈负相关，87%的cd25+cd127-treg高表达foxp3,自身活化的效应t细胞高表达cd127，因而可用cd127区分这两种细胞，现今认为cd4+cd25+cd127-t是天然产生treg细胞最好的细胞膜标志［5，6］。已有研究表明，自身免疫病的易感性与cd4+cd25+调节性t细胞的数量或功能有关［7］，同时发现，cd4+cd25+cd127-t细胞在ra患者中数量和功能都发生了很大改变［8］。 我们研究发现，cd4+cd25+cd127-t在ra患者的血液中减少，减少原因可能与外周血cd4+cd25+cd127-t细胞转移至受累关节中有关。具体的减少机制还将进一步研究，从而为临床诊断提供重要的依据。
【参考文献】
［1］ arnett fc, edworthy sm, bloch da, et al. the 1987 revised ara criteria for rheumatoid arthritis (ra). arthritis rheum, 1987,30(12):17.
［2］ 刘健,纵瑞凯,余学芳,等.佐剂关节炎大鼠血小板参数和细胞因子的变化及新风胶囊对其的影响.中医中药与免疫，2008，24(7):593-596.
［3］ 主鸿鹄,陈复兴,徐开林,等. cd4+cd25+调节性t细胞:一类新被认识的免疫调节细胞. 国外医学免疫学分册, 2004, 27(2): 87-90.
［4］ rizzellov, liuzzo g, brugaletta s,et al.modulation of cd4+cd28 nullt lymphocytes by tumor necrosis factor-alpha blockade in patientswith unstable angina. circulation, 2006,113(19):22-27.
［5］ liu w,putnam al,xu-yu z,et al.cd127 expression inversely cor-relates with foxp3 and suppressive function of human cd4+t reg cells. j exp med,2006,203(7):1701.
［6］ seddiki n,santner-nanan b,martinson j,et al.expression of inter-leukin(il)-2 and il-7 receptors discriminates between human regu-latory and activated t cells. j exp med, 2006,203(7):1693.
［7］ leipe j, skapenkoa, lipsky pe, et al. regulatory t cells in rheumatoid arthritis. arthritis res ther, 2005, 7(3): 93-99.
［8］ 陈瑞莲，刘健，潘喻珍，等.类风湿关节炎患者外周血cd4+cd25+cd12710调节性t细胞的变化及意义. 中国临床保健杂志，2008, 6(19):606-608.
