作者：杨勤，陈云波，闫福曼，程淑意，王奇
【摘要】 【目的】观察阿尔茨海默病（alzheimers disease，ad）模型细胞的大电导钙激活钾通道bkca的变化及人参皂苷rb1对ad模型细胞上bkca通道的影响。【方法】实验分为aβ2535模型组（终浓度为5、10、20、40μmol/l）、人参皂苷rb1预处理组（终浓度为0.5、1、2、4μmol/l）、治疗组（aβ2535+人参皂苷rb1）和空白对照组。采用膜片钳技术观察各组bkca通道的平均开放时间、平均开放概率和电流幅度，选择aβ2535模型组及人参皂苷rb1预处理组的最佳浓度，并观察人参皂苷rb1对ad细胞的作用。【结果】20μmol/laβ2535可显著降低bkca通道的平均开放时间（p<0.05），抑制bkca通道开放； 4μmol/l人参皂苷rb1组bkca通道平均开放概率和开放时间较空白对照组均显著升高（p<0.05），与模型组比较均显著升高（p<0.05或p<0.01）。【结论】人参皂苷rb1治疗ad的机制可能与其能激活bkca通道、对抗aβ2535的毒性作用并保护神经细胞有关。
【关键词】 人参皂苷rb1/药理学；膜片钳；大电导钙激活钾通道；阿尔茨海默病/中药疗法；细胞培养
abstract：objectiveto observe the changes of largeconductance calciumactivated potassium channels（bkca）in rats alzheimers disease（ad） model cells induced by βamyloid peptide 2535（aβ2535），and to investigate the effect of ginsenoside rb1（grb1） on the bkca channel activity. methodswe set up βamyloid protein peptide 2535（aβ2535）model groups（in the final concentration of 5，10，20，40μmol/l），grb1 pretreatment groups（in the final concentration of 0.5，1，2，4μmol/l），treatment groups（treated by aβ2535 and grb1），and blank control group for the experiment. the average opening hours，average opening probability and electric current amplitude of bkca channels were assayed with patch clamp recording technique in order to measure the bkca channel activity in the rat cortical neurons. the optimal concentration of aβ2535 for ad cellular model and the optimal concentration of rb1 for pretreatment were determined according to the cellular morphology and the bkca channel activity. resultsaβ2535（20μmol/l） markedly decreased the average opening hours of the bkca channels in the rat cortical neurons（p<0.05），and inhibited the opening of bkca channels. the average opening probability and average opening hours of bkca channels in 4μmol/l rb1 group were higher than those in the blank control group（p<0.05） and the model group（p<0.05 or p<0.01）. conclusionthe therapeutic mechanism of grb1 is probably related with the activation of bkca channels，the counteraction of aβ2535 toxicity and the protection of neurons.
key words:ginsenoside rb1/pharmacology；patch clamp;
人参皂苷rbl是人参的主要活性成分之一［1］。www.133229.CoM人参皂苷rbl对学习记忆的促进作用已被实验所证实，对其促进神经递质释放、减轻兴奋性毒性、增强第二信使活性、促进突触可塑性、提高受体密度等作用也有广泛的报道［2-3］，是人参作用于神经系统和促智的主要有效成分之一。
钾通道在调节细胞膜的兴奋性中起重要作用，其分子结构基础普遍保守，因此，对通道不适宜的调控会导致病变。阿尔茨海默病（alzheimers disease，ad）患者体内βamyloid protein peptide（aβ）、tau蛋白、βamyloid precursor protein（βapp）、presenilin protein1（ps1），presenilin protein2（ps2）等为代表的多种内源性致病因素可上调或下调钾通道功能，使其出现异常，从而导致ad患者早期记忆损失、认知功能下降等症状的出现［4-5］。由神经元细胞膜电位和胞浆内ca2+浓度决定通道启闭的一类钾通道称钙激活钾通道（ca2+actived k+channels，kca）。其中大电导钙激活钾通道（bkca）分布广泛（如血管平滑肌、神经细胞、心肌细胞和气管平滑肌等），电导值大（100～300ps）则在调节细胞膜兴奋性中作用更显著。kca开放导致钾离子外流使细胞膜复极化或超极化，细胞膜的兴奋性降低 ［6］。近期的一些实验证实钾通道开放剂（kcos）对ad有某种潜在治疗价值［7］，但是有关人参皂苷rbl对ad模型细胞bkca通道的影响方面的研究尚未见报道。本实验利用膜片钳技术观察人参皂苷rbl对ad模型细胞bkca通道变化的影响，探讨其治疗ad 的可能机理。现报道如下。
1材料与方法
1.1主要药品、试剂及其配制人参皂苷rb1购于中国药品生物制品检定所（批号：0703200721），aβ2535购自首都医科大学宣武医院神经生化室（批号：p99），细菌蛋白酶xiv（protease p5417）、羟乙基磺酸钠、4羟乙基哌嗪乙磺酸［4（2hydroxyerhyl）piperazine1erhanesulfonic acid，hepes］、hanks balance saline solution （hbss）、earless balance saline solution （ebss）均购自sigma公司，高蔗糖液（g/l）：蔗糖 80、kcl0.186、na2hpo40.142、cacl20.015、hepes 3.574、葡萄糖1.982，ph7.2～7.4，羟乙基磺酸钠液（g/l）：羟乙基磺酸钠 19.6、kcl0.149、cacl20.0147、mgcl20.813、hepes3.574、葡萄糖 4.144，ph7.2～7.4，earless平衡盐溶液（g/l）：cacl2·2h2o0.265、mgso40.0977、kcl0.4、nacl6.8、na2hpo40.122、葡萄糖 1.0、酚红 0.011，ph7.35～7.4，hanks平衡盐溶液（g/l）：kcl0.4、k2hpo40.06、nacl8.0、nah2po40.0479、hepes2.6、酚红0.011，ph7.2～7.4，电极内液（g/l）：kcl10.213、cacl20.061、mgcl20.02、hepes2.383，ph 7.2～7.4，细胞浴液（g/l）：kcl10.613、cacl20.061、mgcl20.02、hepes2.383，ph7.2～7.4。以上试剂均采用国产优质分析纯，以去离子水配制而成。
1.2仪器设备ma752型震动切片机（美国），ck40倒置显微镜（日本olympus公司），电子天平（德国sartorius公司），水浴箱（上海一恒公司），bs210s 型ph计量仪（德国sartorius公司），微量移液器（美国吉尔森公司），epc9膜片钳放大器（德国heka公司），mp285型三维操作仪、p97微电极拉制仪（均为美国sutter公司）。
1.3大鼠皮层神经元的分离选用出生7～14d的sd大鼠，雌雄不限（由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：2005a008），迅速取出脑组织，置于氧饱和的冰水互溶的高蔗糖液（0℃～4℃，预先通纯氧20min）中冻存2min，期间持续通体积分数100％纯氧。取出脑组织放入震动切片机上，将脑组织沿冠状面切成400～500μm厚的脑片3～4片，切片过程中切片槽中放入冰水互溶的高蔗糖液，并持续通纯氧。然后将切好的脑片置于33℃、通体积分数95％o2+5%co2混合气的ebss液（预先通20min体积分数95％o2+5%co2混合气）中孵育50min。将脑片用低钙的羟乙基磺酸钠缓冲液清洗3次，移入2ml含细菌蛋白酶xiv（protease p5417，1.1～1.4mg/ml）的hbss液中，再将放脑片的hbss液置于33℃水浴箱，持续通体积分数100％o215min。用低钙的羟乙基磺酸钠缓冲液冲洗脑片3次，用注射器针头将皮层脑片分离并粉碎，然后用尖端经火抛光处理的口径依次为500、300、150μm的pasteur吸管进行吹打，制成细胞悬液，并将其移入35mm的培养皿，待细胞贴壁20min后孵育液换成记录液即可用于实验。实验中选用贴壁良好 、细胞膜完整 、折光较好的细胞用于膜片钳实验。
1.4微电极的制作与高阻封接的形成将硬质玻璃毛坯（sutter公司）用p97拉制仪拉制成微电极，内灌电极内液后，入水电阻为7～14mω。通过zeiss正置显微镜观察，用微电极操纵仪驱动微电极，电极入水前在电极腔内加正压，当微电极尖端刚与细胞膜接触时放掉正压，稍加负压形成高阻封接。
1.5单通道膜片钳记录采用细胞贴附式记录神经细胞膜上单通道bkca通道电流，经epc9膜片钳放大器放大，放大器反馈电阻为50gω以上，实验中钳制电压由-40mv逐步去极化到+40mv。采用pulsefit﹠pulse采集入计算机，采样频率为50hz，采样时间为10s。采用分析软件tac进行数据处理，测量通道开放和关闭时间的分辨率为0.2ms，以某一记录电压下的电流幅度的50％作为判断通道开放和关闭的转换；采用tacfit软件作统计学分析，记录中通道成单级或多极开放，对时间数据的分析仅选用单级开放。分析指标有：电流幅度、平均开放时间、电导值、开放概率。
1.6实验分组实验分为aβ2535模型组（终浓度为5、10、20、40μmol/l），人参皂苷rb1预处理组（终浓度为0.5、1、2、4μmol/l）、治疗组（aβ2535+人参皂苷rb1）和空白对照组。
1.7统计学方法采用spss11.5统计软件统计分析。给药前后的显著性检验用独立样本t检验，组间比较用单因素方差分析。
2结果
2.1bkca通道的记录与鉴定所记录通道的电活动特性符合bkca通道的特点，表现为大电导、k+选择性、电压依赖性和ca2+依赖性（见表1、图1）。（1）大电导：记录到大电导钙激活钾通道的电导值为（200.42±17.220）ps（n=5）。（2）k+选择性：通道电流的翻转电位为0mv，而且用140mmol/lcsc1或加入20mmo1/l三乙胺（triethylamine，tea）可完全阻断通道活动。（3）ca2+依赖性：记录的通道的活动受细胞膜内侧钙离子活动影响。随着膜片内侧钙离子浓度的增加和细胞膜的去极化，单通道开放概率（p）及开放频率明显增加。（4）电压依赖性：高阻封接形成后，钳制膜电位为0mv，几乎不见通道活动，钳制膜电位至+10mv，电流多隐藏于背景噪音中。钳制膜电位至+30mv，均记录到通道活动。不断加大膜去极化水平，外向单通道电流随之增大，可出现2个水平甚至3个水平的通道活动。钳制膜电位至-10mv，使膜超极化，电流方向相反。若不断加大膜超极化水平，内向电流也随之增大。通道开放频率及其电流幅度均随钳制膜电位的增大而增加，呈明显的电压依赖性。本实验中细胞内外为对称性高钾，故钾离子平衡电位为0mv。实验中记录到的通道其翻转电位为0mv，等于钾离子平衡电位。再根据其高电导和钙敏感性即可鉴定为bkca通道。但由于本实验的记录模式为细胞吸附式，所以采用上述bkca通道特性中的1、2、4作为判断所记录到的通道是否为bkca通道的标准。表1 bkca通道的电压依赖性(略)
2.2aβ2535对正常神经元bkca通道特性的影响表2结果显示：5μmol/laβ2535组可显著增加bkca通道的平均开放时间（p<0.05），对神经元具有保护作用；10μmol/l组平均开放时间与空白对照组比较差异无显著性意义（p＞0.05）；
20μmol/l aβ2535组可显著降低bkca通道的平均开放时间（p<0.05），抑制bkca通道开放；40μmol/laβ2535组封接后细胞无法维持，很快破裂死亡，膜稳定性差，图形无法作统计学计算。结合bkca通道的平均开放时间，最后选择aβ2535造模的浓度为20μmol/l。表2aβ2535对正常神经元bkca通道特性的影响(略)
2.3人参皂苷rb1对正常神经元bkca通道特性的影响表3结果显示：与空白对照组比较人参皂苷rb1预处理组细胞存活时间长，易封接。1、2μmol/lrb1组的bkca通道平均开放时间有所提高，但差异无显著性意义（p>0.05）；4μmol/lrb1组bkca通道平均开放概率和开放时间较空白对照组均显著升高（p<0.05）；8μmol/lrb1组bkca通道长时程猛烈开放，造成细胞膜稳定性不好，图形无法作统计学计算（图2）。提示4μmol/lrb1可上调bkca通道活性。表3人参皂苷rb1对正常神经元bkca通道特性的影响(略)
2.4人参皂苷rb1对ad模型细胞bkca通道的影响加入20μmol/l的aβ2535后，再加入4μmol/l的人参皂苷rb1，同一细胞的bkca通道的平均开放时间、开放概率、电流幅度见表4。镜下见将20μmol/laβ2535作用于正常神经元后，加人参皂苷rb1组均比不加人参皂苷rb1组的存活时间长，封接容易，但较空白对照组差。加入4μmol/l人参皂苷rb1后平均开放时间和平均开放概率均显著升高，与20μmol/laβ2535组比较差异均有显著性意义（p<0.05或p<0.01），电流幅度较空白对照组和20μmol/laβ2535组均无显著改变（图3）。表4人参皂苷rb1对aβ2535诱导ad模型细胞bkca通道特性的影响(略)
3讨论
alkon等［8］发现钾通道是动物记忆储存不可缺少的因素，而ad则正是老年期发生的以学习记忆障碍为主的神经退行性疾病。大量的研究显示［9-10］：ad患者一些内源性致病因素如β淀粉样蛋白前体（βapp）、ps1，ps2可能通过对钾通道的影响导致ad患者早期记忆、认知功能下降。
人参皂苷rb1是近年来研究较多的一种人参皂苷单体，文献中对人参皂苷rbl治疗ad作用机制的研究尚无定论。人参皂苷rbl对学习记忆的促进作用已被动物实验及离体细胞培养实验所证实［11-12］。离体实验研究表明［13］，人参皂苷rb1终浓度为1～10μmol/l时，对原代培养的大鼠海马神经细胞可以延长存活时间，减低死亡率，对抗谷氨酸介导的神经毒作用。这些研究结果为人参皂苷rbl在临床上更好的运用提供了科学的理论依据。随着电生理学技术的发展及其与离子通道分子生物学的联合研究，人参皂苷rbl的神经元保护作用在离子通道水平对ad细胞的影响已得到广泛关注。
本实验采用单通道细胞吸附式膜片钳技术，通过bkca通道的平均开放概率、平均开放时间等指标，观察不同浓度组人参皂苷rb1对大鼠急性分离的大脑皮层神经元bkca通道活动的影响。结果显示：20μmol/laβ2535作用于正常皮层神经元后，bkca通道的平均开放时间和开放概率均较空白对照组显著降低（p<0.05），提示20μmol/laβ2535复制ad模型细胞成功，与文献报道基本一致［14-16］。而在此基础上再给予4μmol/l人参皂苷rb1后则bkca通道的平均开放时间和开放概率与单纯的20μmol/l aβ2535组比较有显著提高 （p<0.05或p<0.01），提示4μmol/l的人参皂苷rb1可激活bkca通道，对抗aβ的毒性作用。
根据bkca通道的生理功能，aβ2535对bkca通道产生的快速抑制效应将导致神经元兴奋性增高、放电频率增加和动作电位复极化减慢，引发细胞内、外离子稳态破坏，细胞内ca2+超载，从而导致细胞死亡。由此推测，bkca通道是aβ在脑内的可能作用靶点，此效应所导致的神经元损伤可能是aβ的神经毒性作用机制之一。复制ad细胞模型较适宜的aβ2535浓度为20μmol/l。人参皂苷rb1可能通过激活bkca通道，增加bkca通道的平均开放时间及开放概率，从而起到拮抗aβ的神经毒性，保护神经元的作用。根据本研究结果推测人参皂苷rb1可能作为钾通道开放剂，通过上调bkca通道的活性起到保护神经元的作用，bkca通道可能是人参皂苷rb1对神经元细胞的作用靶点之一，具体机制有待进一步研究。
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