【摘要】 目的：观察人参皂苷rg1和rh1对树突状细胞（dendritic cell，dc）表面分子cd25、hladr、cd44、icam1、cd11c及eselectin表达的影响。方法：用不同浓度的rg1和rh1分别加入成熟dc中，刺激一定时间后，用免疫组化法观察，并用图像分析法分析结果。结果：除eselectin外，rg1和rh1均可不同程度地促进hladr、cd25、cd11c、cd44和icam1的表达。结论：rg1、rh1可增强dc表面促进t细胞活化的第一、二类信号系统分子的表达,提高其抗原递呈能力，并促进dct细胞簇的形成而活化初始t细胞。
【关键词】 树突状细胞 人参皂苷 cd25 hladr cd44 icam1
effect of ginsenoside rg1 and rh1 on the expression of hladr,cd25,cd44, cd11c and eselectin on dendritic cell
wang yi, hao yu, qiu quanying, huang qifu.
microbiology and immunology department, beijing university of chinese medicine, beijing 100029, china
［abstract］ objective:to test the effect of ginsenoside rg1 and rh1 on the expression of cd25,hladr,cd44,icam1,cd11c and eselectin on the surface of dendritic cell(dc).methods:mature dcs were treated with different doses of rg1 and rh1. certain time later, the expression of adhesion molecular was detected with immunohistochemical method and the results were recorded with imaging data.results:except for eselectin, both of rg1 and rh1 could increase the expression of hladr,cd25,cd11c,cd44 and icam1 on dcs.conclusion:expression increase of surface molecular, including in two signals required by t cell activation, stimulated by rg1 and rh1, is propitious to the formation of dc t cell cluster that would enhance the antigenpresenting function of dc.
［key words］ dendritic cell；ginsenoside；cd25；hladr；cd44；icam1
人参皂苷rg1(rg1) 是人参的主要活性物质，具有增强免疫力及抗衰老活性［1］。Www.133229.COm我们以往的研究表明，口服给药后，rg1及其肠内菌代谢产物rh1均可经人肠壁吸收入血，并发现rg1及rh1可通过增强前体dc与血管内皮细胞的黏附，而促进dc前体细胞的移行和发育成熟［2，3］；增加dc分泌il12p40蛋白及其mrna的转录，刺激t细胞的增殖及增强lpak细胞杀伤肿瘤的活力［46］。因此，rg1及rh1具有启动和增强免疫应答的作用。
成熟dc可表达多种辅助分子，包括高表达mhcⅰ、ⅱ类分子、b71、b72，某些黏附分子cd11c、cd50、cd54（icam1）、cd102和cd58，归巢受体cd105、cd44以及cd1、cd2、cd5、cd40、cd83、cd25等［7］。这些表面分子的表达，是dc抗原递呈作用及活化初始t细胞的物质基础。本实验用免疫组化法及图像分析，观察人参皂苷rg1和rh1对dc表面cd25、hladr、cd44、icam1、cd11c及eselectin表达的影响，以阐明其对dc功能影响的分子机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器 正常人外周血白细胞层，由北京红十字血站提供；人参皂苷rg1标准品（北京生物制品检定所）；rh1由长春中医学院王本祥教授惠赠；淋巴细胞分层液（ρ=1.077）（上海第二化工厂）；rpmi1640、hepes、胎牛血清（fcs）、胰蛋白酶(美国gibco)；青霉素、链霉素（华北制药总厂）；rhil4(北京大学医学院免疫室)；gmcsf临床用制剂（利百复，华北制药厂生产）；鼠抗人cd44单抗（1∶3 000）（军事医学科学院微生物病菌研究所免疫室罗振革博士和孔祥英老师惠赠）；鼠抗人icam1单抗（深圳晶美生物医学公司）；鼠抗人cd25单抗（1∶10）（北京赛斯公司）；鼠抗人hladr单抗（1∶50）、鼠抗人cd11c单抗（1∶50）及sabcap免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。
co2恒温培养箱（美国froma）；倒置相差显微镜及显微照相系统（日本olympus）；涂片机（军事医学科学院仪器厂，ltpc离心涂片机）；低温冷冻离心机（日本hitachi）；leicadmirb图像分析仪；leica qwin soft分析软件。
1.2 方法
1.2.1 dc的分离培养及鉴定 见文献［5］。
1.2.2 dc常规培养第7天后，将经鉴定后纯度为99%的成熟dc离心，加入rpmi1640完全培养基，调细胞浓度为1×105个/ml, 加入6孔板中，每孔3 ml。分别加入rg1(100、10、1 μg/ml)和rh1(100、10、1 μg/ml)，同时设未加药的阴性对照，5%～7%co2培养箱培养2天后，用离心涂片机制备细胞涂片（每组3张）,涂片于室温干燥2小时以上，丙酮固定20分钟, pbs洗3次，按说明书步骤操作：滴加正常血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体；分别滴加待测的适当稀释的一抗，37℃温育2小时, 0.01 mol/l tbs洗3次；滴加生物素化山羊抗鼠igg，于37℃温育20分钟, 0.01 mol/l tbs洗3次；滴加试剂sabcap，于37℃放置20分钟, 0.01 mol/l tbs洗4次，水洗1次；bcip/nbt用0.01 mol/l tbs(ph 9.0～9.5)按1∶20稀释混匀后加至涂片，37℃显色10～30分钟,镜下控制反应时间，水洗；核固红轻度复染，水洗，干燥后水溶性封片剂封片。
1.2.3 图像分析 每张片子选3个视野，固定窗口面积，每视野计数不少于100个细胞，计算阳性细胞的总积分值及细胞数，再计算单个细胞的平均透光率积分光密度值（iod值），iod值越高表明表面分子表达量越高。用spss 10.0统计软件对上述数据做统计学分析，并用t检验求出均值及标准差，以示细胞表面各种分子的表达量。
2 结果
2.1 rg1及rh1对dc表达cd44、icam1和cd11c的影响 见表1。从表1可看出，与对照组相比，rg1及rh1均能促进dc表达cd44分子（p<0.001），rh1 100、10 μg/ml的作用与同剂量的rg1组相比略弱（p<0.05～0.01）；与对照组相比，rg1、rh1可显著促进dc表达icam1的能力（p<0.01），rg1的作用比rh1略强，但仅中剂量组（10 μg/ml）有显著性差异(p<0.05)；rg1、rh1各剂量组均可促进dc表达cd11c(p<0.001),且与同剂量的rg1相比，rh1 10、1 μg/ml的作用略强（p<0.05～0.01）。
2.2 rg1及rh1对dc表达hladr、cd25及eselectin的影响 见表2。从表2可以看出，与对照组相比，rg1及rh1均可显著促进dc表面hladr的表达（p<0.001）,与同剂量的rg1组相比，rh1 10、1 μg/ml的作用更强（p<0.05～0.01）；rg1、rh1可明显促进dc 表达cd25分子（p<0.001）,各剂量组间无显著性差异；rg1及rh1对dc表达eselectin无明显影响。
表1 rg1及rh1对树突状细胞表达cd44、icam1和cd11c的影响（略）
tab.1 effect of rg1 and rh1 on the expression of cd44,icam1 and cd11c on dc
note:1) p<0.001 vs control；2) p<0.05, 3) p<0.01 vs the same concentration of rg1.
表2 rg1及rh1对树突状细胞表达hladr、cd25及eselectin的影响（略）
tab.2 effect of rg1 and rh1 on the expression of hladr,cd25 and eselectin on dc
note:1) p<0.001 vs control；2) p<0.05, 3) p<0.01 vs the same concentration of rg1.
3 讨论
hladr为mhcⅱ类分子，是成熟dc表面高表达的一类重要分子，是dc抗原递呈的物质基础［7］。rg1、rh1使dc表面hladr分子表达增加，将增强其抗原递呈能力。成熟的dc还高表达cd11c、cd44和icam1，作为dc表面的归巢受体，在dc的移行及介导免疫应答中有极其重要的意义［8，9］。在dc和t细胞的相互作用中，是由双向的icam1——cd11a/cd18所介导的。dc和t细胞黏附后，使dc表面的hladr分子与t细胞的cd4分子靠近并相互作用，从而促进t细胞抗原受体与mhcⅱ类分子抗原肽复合物的结合，激发t细胞合成和释放增殖反应所必需的介质［10］。从实验结果可知，rg1、rh1可促进dc高表达cd11c、cd44和icam1可促进dc与t细胞的黏附，进而促进t细胞的增殖，该结果与我们以前的实验结果相符［5］。
cd25是il2受体的α链，有研究表明，cd25在dc表面的表达增加说明dc处于激活状态，标志着dc发育的成熟［10］。因此，将cd25作为dc成熟的一个表面标志［11］。从实验结果可知，rg1、rh1可促进dc表达cd25，提示rg1、rh1有促进dc成熟的作用。
eselectin是选择素家族成员,在炎症、自身免疫性疾病、肿瘤细胞转移以及淋巴细胞归巢等过程中起重要作用，是较早为人们所认识的与中性粒细胞和血管内皮细胞黏附有直接关系的黏附分子之一［12］。eselectin主要分布于活化的毛细血管后微静脉内皮细胞膜上，在未激活的内皮细胞及小动脉内皮细胞上一般不表达。在dc表面的eselectin还未见报道，本实验结果显示，dc表面有很低量的eselectin表达，且在rg1及rh1的刺激下无明显变化。
本实验结果表明，rg1、rh1均可促进hladr、 cd25、cd11c、cd44和icam1的表达，但rg1、rh1同剂量组相比作用各有不同，在对hladr和cd11c分子表达上，rh1 10、1 μg/ml比同剂量组的rg1强，但在对cd44和icam1的表达上，rh1高、中剂量组则弱于同剂量的rg1。虽然两种化合物的各剂量组没有一定的线性规律，但我们以前的研究结果表明，口服这两种化合物经肠内菌代谢后均可被吸收入血，本研究的结果提示他们的药理作用是相同的, 可能有协同作用，尚待进一步研究。
dc刺激t细胞活化需要第一、二信号系统的同时存在，即tcr识别由dc表面mhc分子抗原肽复合物和两种细胞间协同刺激分子的相互作用，本实验证明，rg1、rh1能够增加dc表面第一，二信号系统重要分子hladr和icam1的表达及增加介导细胞间黏附的分子cd25、cd11c、cd44的表达， 这些分子表达的增加,有利于dct细胞簇的形成及抗原的递呈，从而导致dc免疫功能的增强［5］。
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