作者：莫鸿辉,潘佩光,黄衍寿,洪永敦,王艳红
【摘要】 【目的】探讨冠心病(chd)痰瘀证候与载脂蛋白e(apoe)血清水平及其基因多态性的关系。【方法】选择符合中医痰瘀证型的chd患者(chd组)97例,其中又分为痰证组30例、瘀证组32例、痰瘀证组35例。另选择健康人群35例设为正常对照组。检测所有样本的apoe血清水平,提取全血dna,用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(pcrrflp)技术检测apoe基因型,采用spss 110软件进行相关性分析。【结果】传统危险因素中糖尿病、吸烟、低密度脂蛋白胆固醇(ldlc)和高密度脂蛋白胆固醇(hdlc)等指标chd组明显高于正常对照组(p<005)。chd组及组内各型的apoe血清水平均高于正常对照组(p<001)。chd组内各证型间比较,痰瘀证apoe血清水平明显高于痰证和瘀证(p<001),瘀证apoe血清水平也高于痰证(p<005)。chd组e3/3基因型频率低于正常对照组(p<005),而e3/4基因型频率明显高于正常对照组(p<001)。chd组e4等位基因频率高于正常对照组(p<005)。痰证的e3/4基因型和e4等位基因频率高于痰瘀证、瘀证(p<005),而e3/3基因型及e3等位基因在痰证中的频率低于痰瘀证及瘀证(p<005)。www.133229.cOM【结论】apoe可能是chd独立预测因子之一,其血清水平升高与chd痰瘀证关系密切。apoe e4等位基因和chd密切相关,其中e3/4基因型可能是chd及其痰证的主要易感基因之一。
【关键词】 冠状动脉疾病;载脂蛋白e;基因多态性;痰瘀证
冠心病(chd)是威胁人类健康的重要疾病。既往研究识别了多种冠心病危险因素,但仍有约50%的chd患者不能以已知危险因素解释[1],因而进一步深入探讨其病因势在必行。目前,chd病因研究主要集中在两个方面：继续从宏观水平寻找危险因素及从微观水平探讨chd发病的遗传易感机理。
随着分子生物学理论和技术的发展,chd基因机制的研究也日益受到重视,chd是一种复杂的多基因遗传病这一观点也日益为人们所接受,这将为从分子水平上治疗chd开辟新的途径。载脂蛋白e(apoe)是一种多功能蛋白,是胆固醇和脂蛋白代谢的关键调节蛋白之一[2],与chd的关系密切,其功能与结构和基因表达密切相关,因此,研究apoe基因多态性与chd的相关性已成为热点[3-4]。本研究通过观测chd患者与健康人之间、chd患者痰瘀各证型之间apoe血清水平及其基因多态性的异同,以期能进一步揭开中国人apoe基因多态性与chd关系,指导chd中医临床诊治。现将结果报道如下。
1研究对象与方法
11研究对象观察病例均为2006年1月～2007年6月广州中医药大学第一附属医院心内科收治的chd患者(chd组),均符合中医痰瘀证型的辨证标准,共97例,其中男58例,女39例;平均年龄(6297±1261)岁。97例痰瘀证型chd患者又分为痰证组(30例)、瘀证组(32例)、痰瘀证组(35例)。另选择同期医院门诊体检且与chd组年龄、性别相匹配的健康者35例(设为正常对照组),其中男18例,女17例;平均年龄(6651±1264)岁。chd组和正常对照组均为无血缘关系的中国广东地区汉族人,2组性别、年龄等基本资料比较,差异无显著性意义(p>005),具有可比性。
12诊断标准chd诊断按国际心脏病学会和协会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题组制定的《缺血性心脏病命名和诊断标准》[5]。中医诊断参照《中医病证诊断疗效标准》[6]中胸痹心痛的辨证标准。排除标准：感染性疾病及非感染性炎症疾病患者;严重心力衰竭,美国纽约心脏病协会心功能3级或以上患者;严重肝功能不全(谷丙转氨酶达正常上限2倍以上);严重肾功能不全需透析者;肿瘤患者;造血系统疾病患者。
13观察指标观察chd组与正常对照组的基线资料,各组apoe血清水平,apoe基因型与等位基因频率在chd不同中医证型中的分布情况。
131chd组与对照组基线资料比较两组的性别、年龄、吸烟、饮酒、家族史、合并症、体质量指数(bmi)及血脂水平。
132标本收集与模板dna制备研究对象入院后次日凌晨6时进行采血，采集其空腹非抗凝外周静脉血3 ml,标本置于-70℃冰箱保存。使用试剂：dna分子标准dl2000 marker(大连宝生物公司产品),qiaamp dna blood mini kit(qiagen公司产品),taq dna polymerase 、dntps(均为北京索奥公司产品)。外周血白细胞dna的提取具体步骤(操作方法按照试剂的说明书进行)：取15 ml离心管,注明名字;管底加蛋白酶k(protease k)20 μl,全血200 μl, buffer al 200 μl,混匀后56℃水浴10 min;取无水乙醇200 μl加入管中,混匀,转移入spin column,8 000 r/min 离心5 min;弃滤液,用spin column转移入清洁收集管中,加浓缩洗涤缓冲液1(aw1)500μl,8 000 r/min离心5 min;弃滤液,用spin column转移入另一清洁管中,加浓缩洗涤缓冲液2(aw2)500 μl,8 000 r/min离心5 min;弃滤液,用spin column转移入已标名字的15 ml离心管中,加buffer ae或蒸馏水200 μl,8 000 r/min离心5 min;-20℃保存备用。
133聚合酶链反应——限制性片段长度多态性(pcrrflp)检测和基因定型采用pcrrflp方法鉴定apoe基因的基因型。pcr引物序列为5’aacaactgaccccggtggcg3’(正义链),5’atggcgctgaggccgcgctc3’(反义链)。反应总体积为50 μl,其中包括：10倍pcr buffer 5 μl,10 mmol dntps 1 μl,上下游引物各10 pmol(2 μl),taq酶3 u(15 μl),模板 5 μl,不足体积用灭菌去离子水加至50 μl。混匀后离心 ,加无菌石蜡油覆盖液面,置于pe9700 pcr扩增仪。反应条件：93℃热启动10 min,93℃ 3 min预变性,55℃退火温度,共35个循环,72℃延伸10 min。扩增产物用限制性内切酶hhai(mbi公司产品)37℃酶切2 h后,取10 μl酶切产物用20 g/l的琼脂糖凝胶进行电泳。根据消化片段大小即可检出apoe基因的6种基因型,分别如下：(1)e2/2：91bp、83bp;(2)e2/3：91bp、83bp、48bp、35bp;(3)e3/3：91bp、48bp、35bp;(4)e2/4：91bp、83bp、72bp、48bp、35bp;(5)e3/4：91bp、72bp、48bp、35bp;(6)e4/4：72bp、48bp、35bp。图1中可见e2/3、e3/3及e3/4基因型。
1、3: e2/3;2:e3/4;4、5、6、7:e3/3
图1apoe基因型图谱
figure 1agarose gel electrophoregram
of apoe genotypes
134血清apoe水平测定采集研究对象入院后次日凌晨6时的空腹非抗凝外周静脉血2 ml,3 500 r/min离心15 min,分离血清,-20℃保存;以及收集细胞培养后上清液,-20℃保存,应用酶联免疫吸附剂测定法(elisa法)测定apoe含量。酶联板内、板间变异系数均<10%。
14统计学方法应用spss 110统计软件包进行数据的统计分析。基因型和等位基因频率采用频率计数法计算,研究对象基因型与hardy weinberg平衡定律的符合程度、组间基因型与等位基因频率的比较均采用卡方检验,不同等位基因间临床和生化特征的比较采用t检验或卡方检验,比值比(odds ratio,or)、交互作用采用logistic回归分析,相关性检验采用秩相关回归分析。检验水平α=005。
2结果
21chd组与正常对照组基线资料比较表1结果表明：传统危险因素中糖尿病、吸烟、低密度脂蛋白胆固醇(ldlc)和高密度脂蛋白胆固醇(hdlc)等指标chd组高于正常对照组(p<005),但高血压病史、体质量指数(bmi)以及性别、年龄、饮酒、家族史等方面2组比较差异均无显著性意义(p>005)。
22chd组内痰证、瘀证及痰瘀证患者基线资料比较表2结果表明：chd组内痰证、瘀证及痰瘀证患者基线资料比较,性别、年龄、糖尿病、吸烟、ldlc、hdlc、高血压病史和bmi等各项指标差异均无显著性意义(p>005)。表1chd组与正常对照组基线资料比较表2chd组内痰证、瘀证及痰瘀证基线资料比较
23各组间apoe血清水平比较表3结果显示： chd组以及组内各型的apoe血清水平均高于正常对照组(p<001),但chd组内各证型间比较,痰瘀证apoe血清水平明显高于痰证和瘀证(p<001),瘀证apoe血清水平也高于痰证(p<005)。表3各组间apoe血清水平比较(±s)
24apoe基因多态性与chd的关系2组共观察到6种基因型及3种等位基因,分别是e3/3型、e3/4型、e2/3型、e2/4型、e4/4型、e2/2型和e2、e3、e4。正常对照组中,e3/3型、e3/4型、e2/3型、e2/4型、e4/4型、e2/2型频率分别为690%、115%、171%、29%、0%、0%。而在chd组中,e3/3型、e3/4型、e2/3型、e2/4型、e4/4型、e2/2型频率分别为526%、312%、140%、11%、11%、0%。两组均未见e2/2基因型。经检验,各等位基因频率符合hardy weinberg遗传平衡定律,表明各等位基因已达到遗传平衡,具有群体代表性。由于e2/2基因型分布频率少于1%,因此在分组统计时将其忽略。
chd组和正常对照组apoe基因型和等位基因频率的分布比较见表4。chd组e3/3基因型频率明显低于正常对照组(p<005),而e3/4基因型频率明显高于正常对照组(p<001),e2/3在两组间差异无显著性意义(p>005)。chd组e4等位基因频率明显高于正常对照组(p<005),or值为4065,95%ci分别为0996～7126,表明e4等位基因变异与chd发病显著相关。而e3、e2等位基因在两组间差异无显著性意义(p>005)。
25apoe基因型与等位基因频率在chd不同中医证型中的分布比较表5结果显示：带有e3/4基因型和e4等位基因的chd患者数在痰瘀证、瘀证中明显低于痰证(p<005),而带有e3/3基因型及e3等位基因在痰瘀证及瘀证中的频率则明显高于痰证(p<005)。表4chd组和正常对照组apoe基因型和等位基因频率的分布比较表5apoe基因型与等位基因频率在chd患者不同中医证型中的分布比较
3讨论
31apoe血清水平与chd及其证型关系在众多发病因素中,高脂血症尤其是高胆固醇血症与chd关系最密切。apoe主要由肝脏、脑组织合成,是胆固醇和脂蛋白代谢的关键调节蛋白之一,与高脂血症及chd关系密切[2]。动物实验发现[7]缺乏apoe的大鼠有自发性的总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)水平升高和hdlc水平的下降,并有粥样斑块形成的典型改变。wilson等[8]的研究显示apoe可能导致个体间血脂水平的差异,并可能与高脂血症和冠心病发生有关。本研究结果显示chd组与正常对照组间的apoe血清水平的差异有显著性意义(p<001), 提示apoe血清水平升高与chd发病有关,apoe可能是chd独立预测因子之一,与既往报道相符。
中医学认为,chd所表现的“胸痹”、“心痛”、“怔忡”等病症,主要是因年老脏衰、饮食不当、劳逸失度及外邪内侵等引起。由以上诸因素所产生的多种病理产物如痰浊、水饮、瘀血等,导致了心脉痹阻和胸痹心痛。以往的证候调查已证实,chd病变程度严重的患者以痰浊证和血瘀证为多见。痰浊血瘀是chd的重要病机已成为共识[9],且痰浊血瘀与脂质代谢紊乱密切相关。本研究结果显示,chd血瘀组(瘀证组)及痰瘀互结组(痰瘀证组)apoe血清水平较痰浊组(痰证组)增高(p<005),考虑与apoe介导的脂质代谢异常在chd血瘀组及痰瘀互结组患者中表现更为显著有关。
32apoe基因多态性与chd发病的关系
321广东省汉族人群apoe基因多态性的分布人类apoe有3种主要的异构体(e2、e3和e4),其间的差异仅在于112位和158位上的单个氨基酸不同。e2的112位和158位均为半胱氨酸(cys),e3的112位是精氨酸(arg)，158位是cys,而e4的112位和158位均为arg。这种因单个氨基酸不同造成的异构体是由apoe基因多态性决定的。在人群中3种不同的apoe等位基因分布频率不同,因而决定了不同人群中apoe表型的频率差异[10-15]。本研究通过pcrrflp法分析了35例广东地区健康成人apoe基因多态性分布,发现此类人群中apoe基因多态性分布符合hardy weinberg遗传平衡定律,达到遗传平衡,具有群体代表性,可以代表广东地区汉族人群,提示了本研究的可靠性。
322apoe基因多态性与冠心病的关系apoe基因中e4等位基因的频率在各国人群中有很大差异,而chd的发病率也有很大差异。芬兰chd发病率居世界首位,其人群中e4等位基因频率也最高,达227%[9]。亚洲人群发病率相对较低,e4等位基因频率也低[13,16-17]。e4等位基因频率较高的患者中，tc、ldlc水平也较高,而tc、ldlc均是chd的易患因素,提示e4等位基因与chd存在一定的相关关系。如马洪盛等[18]随机选择潍坊地区汉族人88例chd患者与75例健康成人,研究apoe基因多态性与chd的相关性,结果表明apoe基因多态性与血脂代谢及chd的发生密切相关。e4等位基因是chd发病的遗传易感因子,e2等位基因是预防chd发生的保护因子,认为apoe基因多态性可能通过影响apoe水平而实现chd致病作用。杨丽霞等[19]的研究也显示apoe e4等位基因可能是冠心病的遗传易感因子。王学铭等[20]研究表明apoe e3/4基因型频率升高是chd发病的重要危险因素。潘家华等[21]的研究表明e4等位基因是影响血清tc、ldlc水平的重要遗传因素之一,并可进一步导致冠状动脉粥样硬化及chd的发生,是chd发病的重要危险因素。
本研究在此基础上,通过分析97例chd患者及35例健康对照者与apoe基因多态性关系,发现e4等位基因和chd密切相关,与其他基因型比较,e4等位基因携带者患chd的风险较其他等位基因高,提示apoe基因多态性与广东汉族人chd关系密切,而e4等位基因可能是chd发病的遗传易感基因。
33apoe各基因型及等位基因分布与冠心病证型关系如上所述,apoe e4等位基因的携带者更易于发生脂质代谢紊乱,与此基因多态性相关的各种疾病如冠心病、老年痴呆、高血压、糖尿病等,均与中医学的痰瘀有关。因此,对apoe基因多态性与痰瘀证候的关系进行研究,有利于认识痰瘀证候的病因病机。本研究结果表明：apoe等位基因e4携带者更倾向于发生痰证,表明e4等位基因,特别是e3/4基因型可能是chd及其痰证的主要易感基因之一。
本研究初步显示：apoe血清水平升高与chd痰瘀互结证关系密切,apoe基因多态性与广东汉族人chd关系密切,e4等位基因可能是chd发病的遗传易感基因。因此,通过检测apoe血清水平及其基因型,对chd的早期发现、早期预防意义重大,同时也有助于指导chd中医临床诊治。
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