作者：韦翠萍，刘丹丹，唐立海，刘亮锋，赖平，王艳，叶木荣
【摘要】 【目的】观察牛大力水提液对小鼠免疫功能的影响。【方法】选用spf级km小鼠，通过计算小鼠脾脏指数、胸腺指数、廓清指数和采用血清溶血素试验法、二硝基氯苯诱导小鼠迟发型变态反应试验法，观察高、中、低剂量牛大力(剂量分别为20、10、5 g·kg-1·d-1)对正常小鼠免疫调节的影响。通过测定免疫抑制小鼠(灌胃给予40 mg·kg-1·d-1醋酸泼尼松)脾脏指数、胸腺指数以及廓清指数，观察高、中、低剂量牛大力(剂量同前)对免疫低下小鼠免疫调节的影响。【结果】牛大力对正常小鼠脾脏指数、胸腺指数以及廓清指数均无显著性影响，但能不同程度地增加免疫低下小鼠的脾脏指数、胸腺指数及廓清指数(p<005或p<001)。牛大力能显著提高小鼠血清溶血素含量(p<005)，不同程度抑制小鼠迟发型皮肤过敏反应，但差异无显著性意义(与模型组比较，p>005)。【结论】牛大力能不同程度地提高正常小鼠和免疫功能低下小鼠的免疫功能。
【关键词】 牛大力/药理学;免疫功能低下/中药疗法;溶血素/血液;疾病模型，动物;小鼠
牛大力(radix millettiae speciosae)，载于《陆川本草》，为蝶形花科植物美丽崖豆藤milletia speciosa champ的干燥根。wWW.133229.CoM功能清肺止咳，清凉解毒，用于治疗咳血，痢疾，温病身热口渴，头昏等。本实验观察了不同剂量牛大力水提液对小鼠免疫功能的影响，现报道如下。
1材料与方法
11动物spf级km小鼠,体质量18～22 g，雌雄各半;spf级豚鼠，体质量250～300 g，均由广州中医药大学实验动物中心提供。合格证号：scxk粤20030001。
12药物与制备醋酸泼尼松片由广东华南药业有限公司生产(批号：071104)。牛大力购于广州致信中药饮片有限公司(批号：070701),制备方法：取牛大力干燥药材，用10倍体积的蒸馏水浸泡1 h，加热煮沸2 h，趁热过滤，残渣再加6倍体积的蒸馏水，加热煮沸1 h，合并2次滤液，浓缩至1 g /ml浓度备用，用时加蒸馏水稀释至所需浓度。
13试剂与仪器二硝基氯苯(dncb)由上海试剂一厂生产(批号：20000101)，丙酮由天津市红岩化学试剂厂生产(批号：2006730)。unico7200型光栅分光光度计由尤尼柯上海仪器有限公司提供，ldz5型离心机由北京医用离心机厂生产，anke tgl16g型高速离心机由上海安亭科学仪器厂生产，wgp450型隔水式电热恒温培养箱由上海跃进医疗器械厂生产。
14牛大力对正常小鼠免疫器官质量的影响[1-2]取km小鼠60只，随机分为5组：空白组，醋酸泼尼松组(剂量为40 mg·kg-1·d-1)，牛大力高、中、低剂量组(剂量分别为20、10、5 g·kg-1·d-1)。每天灌胃给药1次，连续给药12 d。末次给药1 h后，将小鼠脱颈椎处死，称体质量，取脾脏和胸腺，用电子天平称质量，计算脾脏和胸腺指数(w)：w脾=m脾/mbody，w胸腺=m胸腺/mbody。
15牛大力对正常小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响[1-3]分组及给药方法同14。于末次给药1 h后，各鼠尾静脉注射50 g/l中华墨汁生理盐水液10 ml/kg，于注射墨汁后2 min及12 min，用毛细玻璃管从小鼠眼眶后静脉丛取血2～3滴，吸20 μl溶于1 g/l na2co3 3 ml溶液中，摇匀，于分光光度计680 nm处测吸光度(d)值，计算廓清指数(ik)∶ik=(logd2-logd12)/(t12-t2)(d2、d12分别为2 min、12 min时的吸光度，t12、t2分别为时间12 min、2 min)。
16牛大力对免疫低下小鼠免疫器官质量的影响[4]取km小鼠60只，随机分为5组：空白组，模型组，牛大力高、中、低剂量组，给药剂量同14项下。除空白组外，其他各组小鼠上午灌胃给予40 mg·kg-1·d-1醋酸泼尼松，空白组给予等容积的蒸馏水，下午牛大力组小鼠灌胃给予相应药物，空白组和模型组灌服等容积的蒸馏水，连续12 d。末次给药1 h后，处死小鼠，按14项下方法计算脾脏指数与胸腺指数。
17牛大力对免疫低下小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响[4-5]分组及给药方法同16项下。按15项下方法检测ik。
18牛大力对鸡红细胞致小鼠血清溶血素抗体形成的影响[6]在鸡血中加入5倍体积的灭菌alsever溶液，离心洗涤，用生理盐水配成体积分数5%生理盐水鸡红细胞混悬液。补体的制备：将2只豚鼠心脏采血，离心后分离血清，用10倍生理盐水稀释。取km小鼠72只，随机分为6组：空白组，模型组，醋酸泼尼松组(剂量为40 mg·kg-1·d-1)，牛大力高、中、低剂量组(给药剂量同14项下)。除空白组外，各组小鼠先腹腔注射体积分数5%生理盐水鸡红细胞混悬液02 ml进行免疫，然后灌胃给药1次，连续12 d。末次给药后1 h，眼眶静脉取血，3 000 r/min离心10 min，取30 μl血清用生理盐水稀释100倍，取稀释后的血清1 ml，与体积分数5%生理盐水鸡血细胞混悬液05 ml、体积分数10%补体05 ml混合,在37℃恒温箱中保温30 min后，0℃冰箱中止反应，然后离心，取上清液于分光光度计540 nm处比色，测d值，另设不加血清的空白对照，取其上清液作为比色时调零的基准。
19牛大力对dncb致小鼠迟发型皮肤过敏反应的影响[1，7]取km小鼠60只，随机分为5组：模型组，醋酸泼尼松组，牛大力高、中、低剂量组(给药剂量同14项下)。首次给药后，用脱毛剂(硫化钡加水调成稀糊状)脱去背部颈毛，次日于脱毛的颈部皮肤上滴100 g/l dncb丙酮溶液20 μl/只致敏。小鼠每天灌胃给药1次，连续14 d。末次给药后1 h，各鼠脱去腹部毛后滴25 g/l dncb丙酮溶液30 μl/只进行攻击。24 h后,尾静脉注射10 g/l伊文斯蓝溶液10 ml/kg。30 min后，脱颈椎处死小鼠，剪取腹部蓝染皮肤，剪碎，用1∶1丙酮和生理盐水混合液5 ml浸泡24 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液于分光光度计 610 nm处比色，测定d值。
110统计学方法采用spss 115统计软件进行分析。用单因素方差分析进行统计学显著性分析。组间差异显著性采用单因素方差分析中的lsd方法进行多重比较检验。
2结果
21牛大力对正常小鼠脾脏指数、胸腺指数及廓清指数(ik)的影响表1结果显示，牛大力高、中、低剂量组对正常小鼠脾脏指数、胸腺指数及ik无显著性影响，与空白组比较差异均无显著性意义(p>005)。表1牛大力对正常小鼠脾脏指数、胸腺指数及廓清指数的影响
22牛大力对免疫低下小鼠脾脏指数、胸腺指数及廓清指数的影响表2结果显示，与空白组比较，模型组小鼠的脾脏指数、胸腺指数与廓清指数均显著降低(p<001)，表明醋酸泼尼松致免疫低下模型成功。牛大力高、中、低剂量组均能显著提高免疫低下小鼠的脾脏指数，与模型组比较差异有显著性意义(p<001)。牛大力低、中剂量组能显著提高免疫低下小鼠的胸腺指数 (p<005或p<001)，而高剂量组与模型组比较差异无显著性意义(p>005)。牛大力高、中剂量组均能显著提高模型小鼠的廓清指数(p<005)。表2牛大力对免疫低下小鼠脾脏指数、胸腺指数及廓清指数的影响
23牛大力对鸡红细胞所致小鼠血清溶血素抗体形成的影响表3结果显示，小鼠经鸡红细胞免疫后，血清溶血素抗体增多，即模型组血清d值显著高于空白组(p<001)。与模型组比较，牛大力中、低剂量组均能显著增加血清溶血素含量(p<005)，牛大力高剂量组有增加血清抗体的趋势，但与模型组比较差异无显著性意义(p>005)。表3牛大力对鸡红细胞所致小鼠血清溶血素抗体形成的影响
24牛大力对dncb致小鼠迟发型皮肤过敏反应的影响表4结果显示，牛大力高、中、低剂量组均能不同程度抑制小鼠迟发型变态反应，但与模型组比较差异无显著性意义(p>005)。表4牛大力对dncb致小鼠迟发型皮肤过敏反应的影响
3讨论
机体免疫功能状态对很多疾病有重要影响。研究表明清热药能增强免疫能力，抑制变态反应。胸腺是t淋巴细胞分化成熟的中枢免疫器官，脾脏则是体内最重要的外周免疫器官，也是t、b淋巴细胞定居和接受抗原刺激后产生免疫应答的重要场所，它们与机体的细胞免疫和体液免疫密切相关，在免疫功能低下时常有胸腺和脾脏萎缩，体积变小[8]。本实验结果表明，在醋酸泼尼松致小鼠形成免疫抑制的条件下，牛大力水提液能增加小鼠胸腺和脾脏指数，但对正常小鼠的胸腺指数、脾脏指数无显著性影响。
本实验选用小鼠炭粒廓清实验，观察牛大力对正常小鼠及免疫低下小鼠非特异性免疫的影响。中华墨汁作为颗粒状异物静脉注射进入血循环，能迅速被单核吞噬细胞清除[9]。本实验结果表明，牛大力水提液对正常小鼠的廓清指数无显著性影响，但可使醋酸泼尼松所致免疫低下小鼠的廓清指数显著增加，即单核吞噬细胞功能明显增强。说明牛大力能增强机体的非特异性免疫功能。
本实验选用血清溶血素实验，观察牛大力对特异性免疫的影响。经鸡红细胞免疫的小鼠，可产生溶血素即抗鸡红细胞抗体，这种抗体在体外与鸡红细胞、补体一起温育，即可使鸡红细胞溶解，释放出血红蛋白，使溶液成红色，根据颜色的深浅，可反映红细胞溶出量的多少，而红细胞溶血与血清中抗体含量有关，测定其上清液的光密度，则可间接判断血清中抗体形成的数量[10]。本实验结果表明，牛大力水提液能增加血清溶血素含量，以中、低剂量组效果显著，说明牛大力能增强机体的特异性免疫功能。
dncb是一种小分子半抗原,可透过上皮与角蛋白及胶原蛋白结合为全抗原,从而刺激t淋巴细胞致敏,使实验动物对此类物质产生过敏性。当dncb 第2次攻击时,t 淋巴细胞与抗原反应释放淋巴因子而引起组织损伤,继而形成迟发性皮肤过敏反应[11]。本实验结果表明，牛大力水提液能一定程度抑制dncb引起的小鼠迟发型皮肤过敏反应,抑制t淋巴细胞介导的特异性细胞免疫应答。
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