【摘要】 【目的】采用混合效应线性模型评价不同毒性剂量雄黄在大鼠体内的血砷浓度变化及对其肝肾功能的影响。【方法】选用sd大鼠分别单次灌服3738、1869、0935g/kg雄黄，测定不同剂量组大鼠药后各时间点/段血砷浓度及尿n乙酰βd氨基葡萄糖苷酶(nag)、碱性磷酸酶(akp)活性，血清天门冬氨酸氨基转移酶(got)、丙氨酸氨基转移酶(gpt)、肌酐(cr)、尿素氮(bun)活力，并采用混合效应线性模型对其进行统计分析。【结果】大鼠单次灌服不同剂量雄黄，尿akp、nag活力，血清bun、got活力的改变有显著的剂量依赖关系，并与血砷浓度变化有显著的线性关系。【结论】在本研究剂量范围内，雄黄中的砷可造成肾小管上皮细胞及肝脏的损伤，但未影响到肾脏的排泄能力。
【关键词】 雄黄/毒性;砷/血液;肝肾功能;混合效应线性模型;大鼠
雄黄(realgar)为硫化物类矿物雄黄族雄黄，具有燥湿、杀虫、解毒之功效，既可单独使用也可在复方中配伍使用。现代药理研究显示[1]，雄黄具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用，临床上多用于治疗急性早幼粒细胞白血病、慢性粒细胞白血病、带状疱疹、脓疱疮、溃疡性黑色素瘤、淋巴结核等疾病。雄黄是一种常见的含砷矿物药，而砷(as)是一种常见的环境毒物和已知的人类致癌物[2]。近年来动物实验和人群流行病学调查均表明砷可引起不同程度的肝肾功能损伤[3-4]。wWW.133229.Com现就毒性剂量下，雄黄在大鼠体内血砷浓度变化的毒代动力学及对大鼠肝肾功能的影响进行研究，以期为雄黄的合理、安全使用提供实验依据。现将研究结果报道如下。
1材料与方法
11仪器afs920型双道原子荧光光度计(中国北京吉天仪器公司产品)，as2型高性能砷空心阴极灯(中国北京有色金属研究总院产品)，mk1型光纤压力自控微波溶样系统(中国海新科微波技术应用研究所产品)，echo lcd型全自动生化分析仪(意大利lagotech仪器公司产品)，uv260型紫外可见光分光光度计(日本shimadaz公司产品)。
12主要试剂as标准溶液：1000μg/ml，5%h2so4介质，国家标准溶液gsb g 6202790，国家钢铁材料测试中心配制;丙氨酸氨基转移酶(gpt)试剂盒，上海科华东菱诊断用品有限公司，批号：20070112;天门冬氨酸氨基转移酶(got)试剂盒，上海科华东菱诊断用品有限公司，批号：20070122;肌酐(cr)试剂盒，上海科华东菱诊断用品有限公司，批号：20070320;尿素氮(bun)试剂盒，上海科华东菱诊断用品有限公司，批号：20061222;碱性磷酸酶(akp)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20070208; n乙酰βd氨基葡萄糖苷酶(nag)试剂盒，上海太阳生物技术有限公司，批号：67115。
13受试动物sd大鼠，雌雄各半，体质量(300±50)g，清洁级，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：0026252。
14受试药雄黄由广州药材公司购得，批号：20040612。经氢化物发生原子荧光法(hgafs)测定其中as2s2的含量为9829g/kg，符合《中华人民共和国药典》[5]规定;经测定可溶性砷为(4990±0223)g/kg，其中可溶性砷中的三价砷为(2429±0195)g/kg。
15给药剂量和方法sd大鼠分为3组，分别一次性灌胃雄黄高剂量3738g/kg、中剂量1869g/kg、低剂量0935g/kg，灌胃量为10ml/kg。给药前12h禁食，不禁水。
16样品采集
161采血时间点及方法分别于药前，药后0、005、015、025、05、075、1、2、3、4、6、8、12、24、32、48、56、72、80、96、168h眶后静脉丛采血约10ml。
张娟，等.雄黄中砷对大鼠肝肾功能的影响第4期2010年第27卷广州中医药大学学报162分组每个剂量组32只大鼠随机分为4组，每组8只，第1组在药后005、075、4、24、72h采血，第2组在药后015、1、6、32、80h采血，第3组在药前、药后0、025、2、48、96、168h采血，第4组在药后05、3、8、12、56h采血。血样经2400r/min离心10min分离血清，于-70℃冰箱保存待测。
17检测指标准确量取04～06ml血清于聚四氟乙烯溶样杯中，加入浓硝酸2ml，室温下放置2h进行预反应，然后进行微波消化，05、10mpa压力下各加热2min，冷却后开启消解罐。将聚四氟乙烯溶样杯置于电热板上加热，赶尽no2和过剩的hno3，加水定容至10ml，稀释一定倍数，测定样品中血砷浓度。取第3组药前、药后0、025、96、168h血清，用于got、gpt、cr、bun测定;收集第1组大鼠0～96h各时间段尿液用于尿nag、akp的测定。
18统计学方法采用sas 913 统计分析软件(sas. . institute inc.， cary， nc， usa.)进行混合效应线性模型的分析。混合效应线性模型：yijk=β0j+β1j×arsenicij+b0i+εijk
变量说明：y代表待测指标(akp、nag、bun、got、cr、gpt);i=1，2，3，分别代表雄黄高、中、低剂量组;j=1，2，3，分别代表待测指标不同测量点;k=1，…8，代表第k次重复测量;arsenicij代表第i个剂量组，在第j次测定待测指标时间点，平均血砷浓度去空白变化值;β0j代表在第j次采血测量指标的时间段内，血砷浓度变化为零时，待测指标的去空白的测量值(即截距)，单位与待测指标的单位相同;β1j代表在第j次采血测量指标的时间段，单位血砷浓度上升时，待测指标平均上升的值(即斜率)，单位为“待测指标/血砷浓度”;β0j和β1j共同表达固定效应，即血砷浓度变化对待测指标的影响;b0i代表不同剂量组的随机效应，即不同剂量对待测指标与血砷浓度之间关系的影响;εijk代表随机误差。
2结果
21大鼠单次灌服雄黄后各剂量组血砷浓度—时间关系结果见图1。大鼠单次灌服雄黄后，总砷在血清中吸收较快，分布、清除较缓慢，整个药—时过程中出现2个峰。高、中、低剂量组吸收半衰期[t1/2(ka)]分别为146、0716、1542h;分布半衰期[t1/2(α)]分别为773、9437、8895h;消除半衰期(t1/2β)分别为1721、24285、24234h;达峰时间tmax分别为3、6、1h。
22血砷浓度对尿酶活性的影响结果见图2和表1。为比较各时间段尿酶活力和血砷浓度的关系，故将各时间段内所测得各时间点血砷浓度进行平均，得到血砷的时间段数据。图2-a、b中上面的3个图从左到右分别是低、中、高剂量雄黄组在10个时间段(time1)的akp、nag活力，下面的3个图从左到右分别是低、中、高剂量雄黄组在10个时间段(time1)的血砷浓度去空白的变化值。其中time1=1、2、…10分别代表0～2h、2～6h、6～12h、12～24h、24～32h、32～48h、48～56h、56～72h、72～80h、80～96h。图中折线是对图中的数据点的平均值的连接。
固定效应参数估计随机效应参数估计时间段j截距(β0j)斜率(β1j)剂量组截距(b0i)0～2h1272819-01142①低剂量组-379752～6h2187564-004413①6～12h3184853-002216①12～24h4247017-006233①24～32h514502800662①中剂量组00180132～48h615745000667①②48～56h722359600153①③56～72h8256725-00466①高剂量组3779572～80h91926170227①④80～96h1027544207704①⑤注：①表示血砷浓度和akp之间有显著的线性关系(p=00134);②表示32～48h时间段斜率显著比0～2h时间段高01809(p=00094);③表示48～56h时间段斜率显著比0～2h时间段高01295(p=00103);④表示72～80h时间段斜率显著比0～2h时间段高03412(p=00107);⑤表示80～96h时间段斜率显著比0～2h时间段高08846(p<00001)
表1-a中固定效应参数估计说明，血砷浓度和akp活力之间存在显著的线性关系(p=00134)。从表中对应的参数估计可以看出，在实验的前期，即2～24h各时间段的斜率比0～2h低，血砷浓度变化对akp的影响基本是下降或接近水平。由此说明，在实验前期， 随着血砷浓度变化，akp下降，随时间推移下降幅度在变小;但是在后面的32～48h、48～56h、72～80h和80～96h时间段， 其斜率显著高于0～2h时间段(均p<002)，效应的参数估计分别是00667、00153、0227、 07704。即在实验的后期，随着血砷浓度变化，akp上升，随时间推移上升的幅度变大;通过随机效应参数估计可以看出，雄黄给药剂量对akp的影响是高剂量的akp比群体平均剂量高出37795;中剂量基本与群体平均剂量类似，只高出001801;低剂量比群体平均剂量低37975。表1-bnag活力和血砷浓度混合效应线性模型的参数估计
固定效应参数估计随机效应参数估计时间段j截距(β0j)斜率(β1j)剂量组截距(b0i)0～2h160789-00285①低剂量组-098732～6h235021-000779①6～12h329539-000225①12～24h46080403-001974①24～32h579626-003027①中剂量组0319032～48h653897001335①②48～56h762183001847①③56～72h8118877①⑥-007899①高剂量组0668372～80h96976701212①④80～96h10100844①⑦06471①⑤注 ：①表示血砷浓度变化和nag活力之间有显著的线性关系(p=00094);②表示32～48h时间段斜率显著比0～2h时间段高004185(p=00113);③表示48～56h时间段斜率显著比0～2h时间段高004697(p=00001);④表示72～80h时间段斜率显著比0～2h时间段高01497(p<00001);⑤表示80～96h时间段斜率显著比0～2h时间段高06756(p<00001);⑥表示56～72h时间段截距显著比0～2h时间段高58088(p=00099);⑦表示80～96h时间段截距显著比0～2h时间段高40055(p=00348)
表1-b中固定效应参数估计说明，血砷浓度变化和nag活力之间存在显著的线性关系(p=00094)。 从表中可以看出2～32h各时间段的斜率比0～2h时间段低，因此，在实验的前期，血砷浓度变化对nag的影响基本是下降的，即随着血砷浓度变化，nag下降。但是在后面的32～48h、48～56h、72～80h和80～96h时间段， 其斜率显著高于0～2h时间段 (均p<002)，对应的参数估计分别是001335、001847、01212、 06471。即在实验的后期，随着血砷浓度变化，nag上升，随时间推移上升的幅度变大;通过随机效应参数估计可以看到，雄黄给药剂量对nag的影响是给药高剂量的nag比群体平均剂量高06683;中剂量比群体平均剂量高出03190;低剂量比群体平均剂量低-09873。
23血砷浓度对血生化指标的影响结果见图3、表2和表3。为比较各时间段血生化指标和血砷浓度的关系，故将各时间段内所测得各时间点血砷浓度进行平均，得到血砷的时间段数据。图3-a、b、c、d上面的3个图从左到右分别是低、中、高剂量组在3个时间段(time2)的血bun、got、cr、gpt值;下面的3个图从左到右分别是低、中、高剂量组在3个时间段(time2)的血砷浓度去空白的变化值。其中time2=1、2、3 分别代表 0～025h、025～96h、96～168h。图中的折线是对图中数据点平均值的连接。表2bun活力和血砷浓度混合效应线性模型的参数估计
变量参数估计标准误差p 值固定效应截距-012360253406406血砷浓度变化: 斜率0007028000203800009①低剂量组截距-032720437704570中剂量组截距034340451104489随机效应高剂量组截距174220503800009②注：①表示血砷浓度与bun有显著线性关系，斜率估计0007028显著大于零(p=00009);②表示高剂量组的截距显著比群体平均剂量的截距高17422(p=00009)
由表2的固定效应可见，血砷浓度变化和bun有显著的线性关系(p=00009)。 随着血砷浓度升高，bun升高。因为通过运用似然比检验可知，血砷浓度变化—时间段的交互作用是不显著的，说明在不同的时间段，血砷浓度变化和bun之间呈现相同的显著的线性关系;随机效应说明剂量对bun的影响表现为高剂量的bun比群体平均剂量显著升高，增高量是3个剂量组中最大的，为17422(p=00009);中剂量比群体平均剂量高03434;低剂量比群体平均剂量低03272。不同剂量对固定效应，即对“血砷浓度变化与bun之间的相关关系”的影响不显著。表3got活力和血砷浓度固定效应及随机效应参数估计
固定效应参数估计随机效应参数估计时间段j截距(β0j)斜率(β1j)剂量组截距(b0i)0～025h1685904-02120低剂量组-39761025～96h22171104①②③-14316④⑤中剂量组18382596～168h3671529-15821高剂量组-144063注：①表示025～96h时间段的截距显著大于零(p=00382);②表示0～025h时间段的截距显著比025～96h时间段低-14852(p =00009);③表示96～168h时间段的截距显著比025～96h时间段低-14996(p=00006);④表示025～96h时间段的斜率显著小于零(p<00001);⑤表示0～025h时间段斜率显著比025～96h时间段高12196(p=00003)
从表3中的固定效应参数估计可见， 在开始的0～025h时间段，血砷浓度变化对got基本是接近的，对应的参数估计是-02120(p﹥005);在中间的025～96h时间段， 斜率显著(p<00001)，截距也显著比0～025h、96～168h时间段高14852(p=00009)、14996(p=00006)，表中对应的斜率估计是-14316。在实验的中期，got很高，随着血砷浓度变化，got大幅下降，到后期截距回到671529，got回到实验前期的水平。即在不同的时间段，血砷浓度变化和got之间呈现出不同的显著的线性关系;表中的随机效应参数估计说明了剂量对got的影响表现为高、中、低剂量比群体平均剂量分别低144063、高183825、低39761，但不同剂量对固定效应，即对“血砷浓度变化与got活力之间的相关关系”的影响不显著。根据统计分析，结果显示cr和gpt与血砷浓度变化之间无显著相关性。
3讨论
大鼠单次灌胃给药雄黄的毒代动力学实验中剂量的选择是以前期急性毒性实验所得半数致死量(ld50)为根据而设定的，分别设定1/2 ld50、1/4 ld50、1/8 ld50为毒代动力学实验高、中、低剂量组，其中高、中、低剂量间呈比例关系，低剂量组是临床等效剂量的10倍[6]。
尿酶活性在急性肾脏功能损害评价指标中最敏感， nag和akp主要反映肾小管上皮细胞的功能情况，而重金属主要损害近段肾小管，因此考虑该2项指标可能对评价大鼠单次灌服毒性剂量雄黄的肝肾毒性更为敏感[7]。
bun是从蛋白质的正常代谢中产生的废物随尿排出，因而其在血中的升高通常说明肾的损害。由于bun含量受营养情况和肝脏毒性的影响，而后者可为许多药物共有的作用结果，因此，在评价肾功能损害程度方面还要综合血清肌酐检查。cr是肌酸代谢的产物，可完全经肾小球滤过，随尿排出，血清肌酐常用来评价肾脏的排泄能力[7]。
肝脏血清酶学最常用的检测指标是gpt和got。血清转氨酶活性的高低与肝细胞受损的程度一致，gpt存在于肝细胞胞质水溶性部分，存在于细胞质水溶性部分及线粒体中。肝细胞损害严重时，不仅胞质中的酶释放出来，而且线粒体中的酶液也释放出来，故测定血清转氨酶有助于对肝毒性的估计及毒性反应观察和判断[7]。
在本实验中，sd大鼠分为3组，给予高、中、低不同剂量雄黄。3组数据互相独立，但是对于各剂量组内的大鼠，由于血量有限，先分组获得稀疏数据再结合，由此得到的血砷和各生化指标是纵向的重复测量数据[8]，同一个剂量组的数据存在一定程度的相关性。 在分析这些数据时，不能运用简单的线性回归，因为线性回归独立偶然误差的假设在相关数据分析上是不成立的，所以采用混合效应线性模型[9-12]可以正确地把这些相关性进行估计。而且，这部分实验的目的除了考察生化、尿酶活性各指标是否和血砷浓度变化有关系外，还有一个重要问题，就是高、中、低剂量对这种关系有什么影响?混合效应线性模型可以通过不同剂量组随机效应，考察剂量对生化、尿酶活性各指标和血砷关系的影响。
本实验中固定效应是血砷浓度变化，随机效应是剂量组。因为不同剂量组之间数据是独立的，而同一剂量组内的数据是相关的。运用似然比检验进行初步的数据统计处理，对相关系数阵和方差进行选择。剂量组作为随机效应除了正确地考察数据相关性外，还揭示了其对测定指标、血砷关系的影响。该统计模型通过固定效应，即药后不同时间段和血砷浓度，预测出在群体中运用平均剂量时待测指标的变化。同时，通过随机效应，预测出各个剂量组在群体中待测指标值的增减;通过随机效应的显著与否说明不同剂量组之间这种相关关系的差异。
结果显示：血砷浓度变化和尿akp、nag之间存在显著的线性关系，随着血砷浓度的变化、时间的推移，尿酶上升的幅度变大(药后32～48h后均p<002)。不同剂量对akp、nag的影响以高剂量最高，中剂量次之，低剂量最低。血砷浓度变化—时间段的交互作用和nag之间的关系是显著的，但和akp之间的关系并不显著。
血清生化指标中bun和got活力与血砷浓度变化有显著的线性关系，而cr含量、gpt活力与血砷浓度变化的关系不显著。bun随着血砷浓度升高而升高，但其与血砷浓度变化—时间段的交互作用不显著，不同剂量对bun的影响也不显著;血砷浓度变化—时间段的交互作用和got之间呈现不同的显著的线性关系，在实验的开始阶段(药后0～025h)，血砷浓度变化对got的影响基本上是略下降或接近水平的，中间阶段(药后025～96h)随血砷浓度升高，got大幅下降，实验后期(药后96～168h)got回到实验前期的水平，不同剂量对got的影响不显著。
本实验结果表明在本研究剂量范围内雄黄可造成肾小管上皮细胞的损伤及肝脏损伤，但没有影响到肾脏的排泄能力。尿酶akp、nag活力，血生化bun、got活力的变化与血砷浓度之间有显著的剂量依赖关系。通过实验研究可以调整雄黄用量，使其在临床上能够合理安全使用。
【参考文献】
[1]杜贵友，方文贤.有毒中药现代研究和合理应用[m].北京：人民卫生出版社，2003：889.
[2]national research council(nrc).national research council report∶arsenic in the drinking water[m]. washington: national academy press，1999：101.
[3]李国明，刘社清，张雪静.雄黄对小鼠肾脏形态学的研究[j].河北医药，2002，24(1):60.
[4]santra a，maiti a，das s，et a1.hepatic damage caused by chronic arsenic toxicity in experimental animals[j]. j toxicol clin toxicol，2000，38：395.
[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[s].北京:化学工业出版社，2005：236.
[6]郝琨，柳晓泉，王广基.临床前毒代动力学研究进展[j].中国药科大学学报，2004，35(3):198.
[7]王宁生.中药毒性与临床前评价[m].北京：科学出版社，2004: 78，77，55.
[8]余松林. 重复测量资料分析方法与sas程序[m].北京:科学出版社，2004：1.
[9]胡良平.如何比较重复测量结果[j].中华预防医学杂志， 2003， 37(4):294.
[10]wang m，borders b e， zhao d. an empirical comparison of two subjectspecific approaches to dominant heights modeling: the dummy variable method and the mixed model method [j]. forest ecology and management， 2008， 255(7):2659.
[11] pinheiroc j， bates d m. mixedeffects models in s and splus [m]. new york: springer， 2000：8.
[12] jolling k， perez ruixo j j，hemeryck a， et al. mixedeffect modeling of the interspecies pharmacokinetic scaling of pegylated human erythropoietin [j]. eur j pharm sci，2005， 24(5)：465.
