作者：程淑意,陈云波,王奇,梁伟雄,温泽淮
【摘要】 【目的】 探讨蛇床子素(osthole,ost)拮抗β淀粉样蛋白2535(aβ2535)毒性损伤、保护神经细胞的作用及其与核因子κb (nfκb)活化机制的关系。 【方法】 以原代培养的大鼠星形胶质细胞(astrocytes, as)为靶标建立阿尔茨海默病(alzheimers disease,ad)细胞模型。采用cck8(cell counting kit8)法检测细胞活力,进行aβ2535造模浓度、时间以及ost预处理最适宜浓度的选择。经aβ2535和ost干预后,采用激光共聚焦显微镜检测分析异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(fitc/pi)双重标记的nfκb与其抑制蛋白(iκbα)在细胞内的激活程度, 结合形态学观察分析ost对星形胶质细胞的保护作用。 【结果】 ost可拮抗aβ2535的神经毒性作用,尤其以低浓度(001～1 μmol/l)为佳,随着浓度的升高,对细胞的保护作用呈减弱趋势。40 μmol/l的aβ2535作用于as 24 h可过度活化nfκb的表达(p <001),激活iκbα发生磷酸化及降解(p<001)。www.133229.COm低浓度的ost可显著抑制nfκb的过度活化(p<001),上调细胞核内iκbα的表达(p<001)。【结论】 ost抑制aβ2535的神经毒性作用，延缓ad发生发展的作用机理可能与nfκb活化机制有关。
【关键词】 蛇床子素/药理学;阿尔茨海默病/中药疗法;星形胶质细胞/病理学;细胞培养
蛇床子是伞形科一年生草本植物蛇床[cnidium monnieri(l)cusson]的成熟果实,蛇床子素(osthole,ost)是从蛇床子中提取的一种天然香豆素。研究表明[15],ost对机体多个系统均具有较好的作用,尤其在中枢神经系统方面,如改善学习记忆、抗衰老、镇静抗炎等。ost防治疾病的作用机制以及核因子κb(nuclear factor kappa b,nfκb)作为一种重要的核转录因子在此机制中所起的作用尚属未知。本研究通过观察ost保护星形胶质细胞(astrocytes,as)的作用及其与nfκb信号传导通路之间的联系,初步探讨ost在细胞学领域防治阿尔茨海默病(alzheimers disease, ad)的作用机制。现将结果报道如下。
1材料与方法
11实验动物新生24 h内的spf级sd大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供[合格证号：scxk(粤)20030001]。
12主要试剂和仪器蛇床子素(购自中国药品生物制品检定所,批号：110822200305),β淀粉样蛋白2535 (aβ2535) 冻干粉(购自首都医科大学宣武医院神经生化室),cck8(cell counting kit8)试剂盒(购自株式会社同仁化学研究所)，高级dmem(高糖)培养基(gibco公司),特级胎牛血清(hyclone公司),胰蛋白酶粉末(amresco公司),nfκb p65兔抗鼠抗体(calbiochem公司),nfκb抑制蛋白(iκbα)兔抗鼠抗体(中山金桥公司),羊抗兔异硫氰酸荧光素(fitc)igg(invitrogen公司),碘化丙啶(pi)和rna酶a(sigma公司)。aeg120型电子天平(日本岛津),wtb150型 co2培养箱(德国binder),多功能自动酶标仪(瑞士tecan),德国leica的倒置显微镜、激光共聚焦显微镜以及图像分析软件。
13星形胶质细胞的培养和ad细胞模型的建立[6]本实验室前期研究采用新生24 h内的spf级sd大鼠已成功建立了纯化的原代星形胶质细胞(as)体外培养技术,经鉴定其细胞纯度达到95%以上。同时采用四甲基偶氮唑盐(mtt)法检测细胞毒性，实验结果显示,40 μmol/l的aβ2535作用于纯化培养的as,能较好地模拟ad细胞病理损伤。
14蛇床子素对ad细胞模型活力的影响
141ad细胞模型的建立将纯化培养的as接种到96孔板上,培养至细胞长满孔底80%左右,吸弃旧的培养液,以终浓度为40 μmol/l的aβ2535作用于星形胶质细胞24 h后,倒置显微镜下观察细胞的生长状态和形态变化。
2010年第27卷广州中医药大学学报程淑意，等.蛇床子素对aβ2535诱导的星形胶质细胞nfκb活化机制的影响第1期142蛇床子素对ad细胞模型活力的影响将纯化培养的星形胶质细胞按25×104～3×104/孔的密度接种到96孔板中,并随机分为7组：正常组,模型组,001 μmol/l ost组,01 μmol/l ost组,1 μmol/l ost组,10 μmol/l ost组,100 μmol/l ost组,6孔/组。24 h后倒置显微镜下见细胞长出突触并呈相互融合状态后，给ost各浓度组加药,分别于加药后12、24、48 h时,除正常组外,其他各组均加入终浓度为40 μmol/l的aβ2535继续培养24 h。在所有实验孔中加入cck8液10 μl,置培养箱中继续培养1 h,可见橙黄色结晶物(即甲臢)形成,采用酶标仪测各孔吸光度(d)值,检测波长为450 nm。
15nfκb和iκbα活性的检测
151实验分组将纯化培养的星形胶质细胞按1×105/ml的密度接种于6孔板(内置已用多聚赖氨酸包被的盖玻片),按1 ml/孔、2孔/组分为7组：正常组,01 μmol/l ost组,05 μmol/l ost组,25 μmol/l ost组,125 μmol/l ost组,ost对照组(05 μmol/l ost),模型组。每孔补充完全培养液至25ml,置培养箱中继续培养。细胞爬片至合适的时间后,除正常组和模型组外其他各组分别加入相应浓度的ost,作用于细胞24 h之后,除正常组和ost对照组外其他各组均加入终浓度为40 μmol/l aβ2535,继续培养。
152细胞固定细胞爬片以甲醛固定,磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗,体积分数70%冷乙醇浸泡,-20℃固定24 h。检测iκbα时参照文献[7]方法,于aβ作用30 min后进行细胞固定。检测nfκb p65时参照文献[6]方法,于aβ2535作用24 h后进行细胞固定。
153免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察将细胞爬片以冷pbs冲洗,用含羊血清、tritonx100的pbs室温作用30 min。吸弃上清液后,不洗,加入一抗,4℃过夜。用冷pbs充分冲洗,用pbsnan3 1 ∶200稀释的二抗,37℃作用1 h,pi染液避光室温下复染20 min。用冷pbs充分冲洗。每张切片任选20个细胞,以leica confocal图像分析软件检测核区与胞浆区的荧光值(fn/fc)。
16统计学方法采用spss 110软件包进行数据的统计分析。
2结果
21ad细胞模型的建立镜下观察见星形胶质细胞出现明显的毒性损伤,表现为细胞突触减少或回缩,细胞变圆,其表面斑点和沉积物增多,生长迟滞。
22蛇床子素对aβ2535诱导的ad细胞模型活力的影响表1结果显示,低浓度(001～1 μmol/l)ost各组与模型组在不同时点比较差异均有显著性意义(p<001),尤其在作用24 h时,其保护作用最佳。而随着浓度的增加和时间的延长,其保护作用明显减弱,甚至出现毒性作用。 表1不同浓度和时点ost对aβ2535诱导的ad细胞模型活力的影响
23各组对ad细胞模型nfκb和iκbα活性的影响表2结果显示,模型组nfκb及iκbα的fn/fc值与正常组比较差异均有显著性意义(p<001),ost对照组fn/fc与正常组比较差异无显著性意义(p>005)。ost各浓度组fn/fc与模型组比较差异均有显著性意义(p<005或p<001),尤其以01 μmol/l和05 μmol/l浓度的作用为好。图1(彩图见第101页)结果显示:正常组中绿色荧光主要位于胞浆区,仅有极少部分进入红色核区,ost对照组与正常组基本一致,说明正常情况下,蛇床子素对细胞中的nfκb表达无明显作用，而模型组中绿色荧光较多地进入红色核区,致使核区显示黄色。蛇床子素各浓度组红色核区中的绿色荧光均较模型组少,但随浓度的增高,红色核区中的绿色荧光有增多的趋势,且以125 μmol/l组最多。图2(彩图见第101页)结果显示：正常组中绿色荧光较多进入红色核区,使核区显示黄色,说明正常as内的iκbα可能处于高表达状态。ost对照组与正常组的表达情况基本一致。模型组中绿色荧光主要位于胞浆区,仅有极少量进入红色核区。蛇床子素各浓度组红色核区中的绿色荧光均较模型组多,但随浓度的增高,红色核区中的绿色荧光有减少的趋势。表2各组对ad细胞模型中nfκb和iκbα活性的影响
3讨论
ad是一种中枢神经系统进行性、退行性疾病,其病理表现虽以神经元的退变丧失、纤维缠结、空泡变性为主,但近年来对星形胶质细胞(as)的研究发现,其在ad发病过程中起着越来越重要的作用。众所周知,aβ是ad老年斑的核心组成部分,生理条件下的aβ主要是由as生成,并能适度活化as内的nfκb,对aβ周围的神经元起到保护作用。而在病理条件下,大量沉积的aβ不仅能诱导as内nfκb过度活化,释放炎症因子、增加载脂蛋白e(apoe)的表达、产生氧化应激反应,而且随着时间的延长,还导致aβ附近as数量明显减少,沉积的aβ明显下调神经元内nfκb的活性表达,致使神经元对aβ的毒性变得异常敏感,两种途径共同作用,促使神经元出现死亡,从而加速ad的发生、发展及恶化[8]。iκbα是nfκb的抑制蛋白,正常状态时与nfκb结合成非活性的复合物穿梭于胞浆与胞核之间。当细胞受到外界因素刺激时,则引起一系列连锁的酶促反应,使iκbα发生磷酸化并与nfκb解离,nfκb随之活化并转入核内,发挥调节基因转录表达的功能。虽然不同的外界刺激通过作用于不同的iκbα,引起nfκb有差别的活化,但几乎所有已知nfκb诱导物均能通过iκbα的降解迅速而短暂地活化nfκb。而活化的nfκb又能够上调iκbα的mrna水平,促使合成新的iκbα进入细胞核与nfκb结合返回细胞质中,从而保证nfκb活化过程的适时终止[9]。
本研究结果显示,40 μmol/l的aβ2535作用于as 30 min后,标记iκbα的绿色荧光抗体大量出现在胞浆区,说明aβ2535能诱导as内的iκbα迅速磷酸化并与nfκb解离。而40 μmol/l的aβ2535作用于as 24 h后,标记nfκb p65的绿色荧光抗体由胞浆区大量进入红色的胞核区。形态学方面,此时的as在细胞数量和轴突数目上都有明显减少,毒性损伤较大。
本研究结果初步表明：在ad病理损伤中,ost通过上调as中iκbα的表达,抑制nfκb的过度表达,起到保护细胞的作用。既往研究表明,低剂量的aβ可激活神经元内的nfκb,作为重要的抗凋亡因子对神经元起保护作用，而高剂量时则下调nfκb活性,诱导细胞凋亡[10]。低浓度的人参皂苷rg1可上调ad海马神经元细胞模型中nfκb的表达,延长其存活时间,减低死亡率[11]。本研究也发现ost对as的保护作用与其浓度有关,低浓度(01 μmol/l和05 μmol/l)的ost对as的保护作用更好,其机制可能是ost通过抑制aβ诱导的iκbα过度磷酸化,减弱nfκb在as内的过度活化表达而保护as,提高神经元细胞抵抗aβ的能力,为ost治疗ad提供了新证据,确切机制有待进一步研究。
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