姜黄素对喉癌hep2细胞的诱导凋亡作用及细胞周期的影响
【关键词】 姜黄素;喉癌细胞;ao染色法;凋亡;细胞周期
【摘要】 目的 探讨姜黄素对人喉癌hep2细胞的诱导凋亡作用及其对细胞形态及细胞周期各时相的影响。方法 hep2细胞暴露于含姜黄素(0～25 μmol/l)的培养基中，分别培养24 h及48 h，用吖啶橙染色法(ao染色法)检测对细胞形态的影响;用流式细胞术检测对细胞周期各时相及凋亡率的影响。结果 ao染色法显示，姜黄素可诱导hep2细胞形态发生明显变化，呈时间剂量依赖性;fcm结果显示，姜黄素可使hep2细胞s期细胞数明显减少，并诱导细胞出现典型的凋亡峰，凋亡率呈时间剂量依赖性。结论 姜黄素可诱导喉癌hep2细胞呈典型的凋亡形态，诱发凋亡峰，使hep2细胞阻滞在g2/m期。
【关键词】 姜黄素;喉癌细胞;ao染色法;凋亡;细胞周期
姜黄素作为一种植物多酚，主要来源于姜科姜黄属植物，姜黄是其主要活性成分，具有抗感染、 抗炎、 抗凝、 抗氧化、 清除自由基等作用〔1～3〕。近年有研究表明，姜黄素还具有抗肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、大肠癌、胰腺癌和乳腺癌等〔4～8〕作用。喉癌是头颈外科一种比较常见的恶性肿瘤，近年来的发病率有上升的趋势;虽然对于喉癌的临床治疗手段不断改进，但其治疗效果仍不尽人意，尤其是晚期喉癌，所以有待于开发研究出更行之有效的抗喉癌的药物。wwW.133229.COm目前国内外关于姜黄素对喉癌的抑制作用及其作用机制的研究报道甚少。本研究探讨了不同浓度姜黄素是否对人喉癌(hep2)细胞具有诱导凋亡作用，及其对细胞形态、细胞周期进程及凋亡率的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞与试剂
人喉癌hep2细胞购于上海细胞生物研究所。 rpmi1640培养基购于gibco/brl公司。姜黄素(curcumin)购自美国sigma公司，用二甲基亚砜(dmso)溶解后配成50 mmol/l的贮存液置于-20℃冰箱保存，实验时稀释至所需浓度。吖啶橙(ao)及碘化丙啶(pi)购于北京鼎国生物技术公司。倒置荧光显微镜为olmpus公司产品。coulter epics xl流式细胞仪为美国贝克曼库尔特公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
喉癌细胞株hep2于含5%胎牛血清(fbs，北京鼎国生物技术公司产品，经56℃ 30 min灭活)，100 u/ml 青霉素及100 μg/ml 链霉素的rpmi1640培养液中单层细胞培养;37℃ 5%co2孵箱中培养传代，每次传代均以0.25%胰蛋白酶消化、洗涤1次，更换新培养基。传代浓度为5×105/ml。
1.2.2 一般形态学观察
采用倒置显微镜观察细胞生长状况及形态学改变。取对数期生长的hep2细胞以1×106细胞数接种于培养瓶中，5%fbs的rpmi1640培养液培养24 h后，更换成无血清的rpmi1640培养液同步化培养24 h，最后再更换成5%fbs的rpmi1640培养液，并加入终浓度为(12.5、25 μmol/l)的姜黄素，同时设不加姜黄素的阴性对照(加入溶剂dmso)，培养48 h后，在倒置显微镜下观察并照相。
1.2.3 细胞凋亡荧光染色检测
采用ao染色法观察姜黄素对hep2细胞形态的影响。取对数期生长的hep2细胞以4×104细胞数接种于24孔板中小载玻片上，5% fbs的rpmi1640培养液培养24 h后，更换成无血清的rpmi1640培养液同步化培养24 h，最后再更换成5% fbs的rpmi1640培养液，并加入终浓度为12.5 μmol/l及25 μmol/l的姜黄素，每组药物浓度设5个复孔，同时设不加姜黄素的阴性对照(加入溶剂dmso)培养48 h后，取出载玻片，磷酸盐缓冲液(pbs)洗2次，滴加0.01% ao，在荧光显微镜下观察细胞形态并照相。
1.3 流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡
取对数期生长的hep2 细胞以1×106细胞数接种于培养瓶中，5%fbs的rpmi1640培养液培养24 h后，更换成无血清的rpmi1640培养液同步化培养24 h，最后再更换成5%fbs的rpmi1640培养液，并加入终浓度为(6、12.5、25 μmol/l)，每组药物浓度设5个平行样，同时设不加姜黄素的阴性对照(加入溶剂dmso)。分别培养24、48 h后，收集培养瓶内全部细胞，用pbs 洗涤2 次后，以冷的70 %乙醇固定，4℃条件下过夜，离心除去固定液并以pbs 洗1次，所得细胞以pi溶液〔pi 按50 mg/l溶于pbs，体积分数0.1 %的tritonx100、0.1 mmol/l的乙二胺四乙酸(edta)及50 mg/l的rnase a〕，于室温避光染色30 min，即可上机分析。染色细胞的dna 含量数据以流式细胞仪进行采集并通过软件进行分析处理。
1.4 统计学分析
用spss13.0统计软件进行分析，实验数据取x±s表示，采用方差分析和t检验。
2 结 果
2.1 一般形态学观察结果
对照组细胞贴壁生长，几乎无脱落。镜下见细胞呈多边形，胞质饱满，轮廓清楚，细胞生长旺盛，相邻细胞生长融合成片。经姜黄素处理48 h后，肉眼可见各处理组均有细胞逐渐变圆由瓶壁脱落，悬浮在培养液中。光镜下见细胞逐渐变圆，体积缩小，细胞质内可见较多颗粒，颜色加深，呈深褐色，核颜色也加深，折光性减弱。上述细胞改变随药物浓度的增加而增加。见图1。
2.2 ao染色法观察姜黄素对hep2细胞形态的影响
正常对照组细胞贴壁形态完整，具有伪足，呈不规则的多边形;细胞核dna为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的rna为橘黄或橘红色荧光;细胞处于完全贴壁状态，细胞生长旺盛，细胞密度大。12.5 μmol/l的姜黄素作用48 h组，部分位置因细胞不再贴壁而使细胞明显密度减小，部分细胞的伪足已收缩，细胞质萎缩，细胞核相对较大，出现凋亡小体。25 μmol/l的姜黄素作用48 h组，细胞伪足都已收缩，细胞近卵圆形，细胞质萎缩，有凋亡小体，甚或见黄绿色碎片。有的细胞坏死，细胞质内黄绿色或橘黄色荧光均可见减弱或消失。见图2。
2.3 姜黄素对hep2细胞周期分布及细胞凋亡的影响
姜黄素可影响hep2细胞株的细胞周期分布，在终浓度为6、12.5、25 μmol/l的姜黄素分别作用于hep2细胞24 h及48 h后，与溶剂对照组相比，s 期细胞比例减少，g2/m期细胞比例增加，阻滞在g2/m期，且有显著差异(p<0.05);随姜黄素浓度增加，阻滞增强。48 h作用组阻滞更为明显，差异有统计学意义(p<0.05)。此外，药物作用组出现细胞亚二倍体峰(ap凋亡峰)，而对照组不存在，24 h作用组各浓度姜黄素诱导的细胞凋亡率分别为3.06%、6.74%、10.9%; 48 h作用组各浓度姜黄素诱导的细胞凋亡率分别为3.83%、8.89%、13.7%。表明随着姜黄素浓度的增加，诱导凋亡效果越明显。见表1，图3。表1 姜黄素对hep2细胞周期与凋亡率的影响图1 倒置显微镜下观察姜黄素对喉癌hep2细胞形态的影响(×40)图2 吖啶橙荧光染色法观察姜黄素对喉癌hep2的诱导凋亡作用及对细胞形态的影响(×40)图3 流式细胞仪检测不同浓度姜黄素对hep2细胞的诱导凋亡作用
3 讨 论
近年来研究表明，姜黄素作为中药姜黄的主要活性成分，还有抗肿瘤的作用。本实验针对姜黄素对人喉癌hep2细胞的诱导凋亡作用及其对细胞形态、细胞周期时相及凋亡率的影响展开研究。本研究利用碱性荧光染料ao能透过胞膜，嵌入细胞核dna，使之发出明亮的黄绿色荧光;使旺盛有丝分裂细胞的染色体产生浅黄绿色荧光;与rna和酸性黏多糖类结合显桔黄色荧光的原理，从形态学的角度检测到终浓度为12.5 μmol/l及25 μmol/l的姜黄素作用48 h后，对hep2细胞产生的诱导凋亡作用。从结果可见对照组中，细胞形态正常，而姜黄素作用组中细胞数明显减少，出现胞浆浓缩，核dna浓缩致密在核膜内侧的早期凋亡细胞，细胞膜呈泡状膨出，核碎裂形成凋亡小体的晚期凋亡细胞，染色增强，荧光更为明亮。通过此实验结果表明，终浓度为12.5 μmol/l及25 μmol/l的姜黄素作用48 h内可诱导喉癌hep2细胞呈典型的凋亡形态，且呈时间剂量依赖性。同时以上结果与一般形态学观察结果也是相一致的。
有文献表明〔9，10〕，姜黄素可通过诱发肿瘤细胞凋亡等达到抗肿瘤作用。也有研究表明〔11，12〕，姜黄素影响肿瘤细胞周期时相可能也与其抗肿瘤作用也密切相关，将有利于肿瘤的放、化疗。本研究中通过流式细胞仪检测发现：①终浓度为6～25 μmol/l的姜黄素作用过的hep2细胞出现了明显的凋亡峰，且呈剂量依赖性，由此可见姜黄素可引起喉癌细胞凋亡，可能是其抗肿瘤作用机制之一。②从对细胞周期时相的影响来看，终浓度为6～25 μmol/l的姜黄素对hep2细胞的作用主要表现为阻滞在g2/m期，且呈时间剂量依赖性。正常细胞周期按照由g1sg2m期的顺序进展，但是通过这种阻滞作用使肿瘤细胞无法进入下一增殖周期，姜黄素通过影响细胞周期分布而影响细胞的代谢和功能，导致细胞重新分化，达到抑制细胞增殖的目的，这可能是其抗肿瘤机制的另一方面。本实验结果与某些报道证实的姜黄素可通过干扰正常的纺锤体的形成使肿瘤细胞不能正常的有丝分裂，从而发生g2/m期的阻滞是一致的〔12，13〕。并且有研究表明g2/m是肿瘤放疗最敏感时相，姜黄素使肿瘤细胞阻滞在g2/m期，将使对射线相对抗拒的肿瘤细胞转变成相对敏感亚群，使得杀伤作用提高〔14〕。
综上所述，姜黄素可诱发人喉癌hep2细胞凋亡，并呈典型的凋亡形态，使其阻滞在g2/m期。这些发现是对姜黄素抗癌特性的突破性认识，拓展了对姜黄素抗癌机制的研究;使得作为天然活性物质的姜黄素，在具有其毒、副作用小，价格低廉，药源充足等优点的前提下，将在抗喉癌方面具有更广阔的开发前景。但目前，对姜黄素诱导喉癌细胞凋亡的分子机制研究还有待进一步深入，例如对细胞周期蛋白、caspase蛋白等与细胞凋亡相关因子的研究。
【参考文献】
1 麦镇江.姜黄素的药理作用研究进展〔j〕.中药材，2004;27(9)：698701.
2 lin jk.molecular targets of curcumin〔j〕.adv exp med biol，2007;595：22743.
3 bharat ba，anushree k，manoj sa，et al.curcumin derived from turmeric(curcuma longa)：a spice for all seasons〔m〕.phytopharraaceut cancer chemopreven，crc press llc,2005：34950.
4 maheshwari rk，singh ak，gaddipati j，et al.multiple biological activities of curcumin：a short review〔j〕.life sci，2006;78(8)：20817.
5 aoki h，takada y，kondo s，et al.evidence that curcumin suppresses the growth of malignant gliomas in vitro and in vivo through induction of autophagy:role of akt and erk signaling pathways〔j〕.mol pharmacol，2007;72(1)：2939.
6 张丽娟，陆 茵.姜黄素抗肿瘤机制研究进展〔j〕.中国中医药信息杂志，2008;15(4)：1002.
7 milacic v,banerjee s,landispiwowar kr,et al.curcumin inhibits the proteasome activity in human colon cancer cells in vitro and in vivo〔j〕. cancer res，2008;68(18)：728392.
8 bill ma，bakan c,benson dm,et al.curcumin induces proapoptotic effects against human melanoma cells and modulates the cellular response to immunotherapeutic cytokines〔j〕.mol cancer ther，2009;8(9):272635.
9 黄珈雯.姜黄素的抗肿瘤作用研究进展〔j〕.甘肃中医，2008;21(1)：556.
10 刘晓真，张宏颖.姜黄素与肿瘤细胞作用的分子机制〔j〕.大连医科大学学报，2008;30(5)：4658.
11 mehta k，pantazis p，mc queen t,et al.antiproliferative effect of curcumin(diferuloylmethane)against human breast tumor cell lines〔j〕. anticancer drugs,1997;8(5)：47081.
12 田慧军,王笛乐.姜黄素诱导人结肠癌细胞株sw480凋亡及其bcl2表达相关性研究〔j〕.肿瘤防治研究，2006;33(3)：1857.
13 holy jm.curcumin disrupts mitotic spindle structure and induces micronucleation in mcf7 breast cancer cells〔j〕.mutat res，2002;518(1):7184.
14 张晓智，韩苏夏，杨玉琮，等.姜黄素对食管癌细胞系放射敏感性的影响及其机理〔j〕.西安交通大学学报(医学版)，2003;24(4)：3778.
