摘 要：目的：探讨实时荧光定量PCR在肝炎尤其是乙型肝炎（乙肝）检测中的应用。方法：对450例急、慢性乙肝患者，采用经酶联免疫吸附试验检测血清，并按血清学标志分为三组，并对所用患者血清实时荧光定量PCR检测。结果：不同血清学标志模式的实时荧光定量PCR检测阳性率分别为95.95%、31.47%、52.20%，三组之间差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论：实时荧光栋梁PCR检测可以为乙肝病毒感染诊断、治疗及预后判断提供客观依据。但对于病毒非复制感染不能有效检测，不可在肝炎检测中完全替代血清标志物检测。
关键词：实时荧光定量；PCR；乙型肝炎
肝炎是全球人类健康的最大威胁，全球感染乙型肝炎（乙肝）约有4亿人，而我国的感染率更高约为9.09%，感染者超过1亿[1]。病毒通过对机体免疫系统及感染肝细胞的攻击，引发肝炎和肝细胞坏死，若控制不及时、有效就会引发肝硬化、肝癌。因此，对肝炎进行及时有效的检测，准确掌握病毒复制情况及肝炎治疗进展，具有非常重要的意义。传统检测肝炎的酶联免疫吸附试验虽能够检测病毒的感染和传染性，却无法反应乙肝病毒（HBV）的复制水平，而实时荧光定量PCR可以根据基因水平（DNA）来判断乙肝病毒的复制状况，帮助临床诊断乙肝感染水平和疗效。广东省深圳市药品检验所通过对血清学标志不同的乙肝患者的血清进行检测，以了解不同血清模式的患者中乙肝病毒复制水平。
1 资料与方法
1.1 一般资料：2008年10月～2010年4月我院共接诊急、慢性乙肝患者450例，其中男230例，女220例，年龄15～58岁，平均（40.9±21.1）岁，入院诊断符合《病毒性肝炎防治方案》（2000年）[2]。经酶联免疫吸附试验对乙肝患者的血清进行检测，并按血清学标志分为三组：A组中HBsAg、HBeAg及抗HBc呈现阳性；B组中HBsAg及抗HBc、抗HBe呈现阳性；C组中HBsAg及抗HBc呈现阳性。三组中抗HBs均为阴性。
1.2 实时荧光定量PCR检测方法：采用上海复星HBV DNA（乙肝病毒基因）定量检测试剂盒及ABI7300美国荧光定量PCR分析仪进行检测。采集患者1.5 ml静脉血，注入无菌离心管中并在室温下放置2 h后再在低温4℃下静置1 h，然后实施5 min的8 000 r/min离心，吸取血清200 μl放入另一无菌离心试管，提取DNA、进行PCR分析。若每毫升拷贝达5.0×102及以上即为阳性。
1.3 统计学方法：对每组HBV DNA阳性数和阳性率进行统计，并采用μ检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
不同血清学标志模式的实时荧光定量PCR检测阳性率分别为A组95.95%、B组31.47%、C组52.20%，三组之间差异均有统计学意义（P＜0.01）。具体HBV DNA含量结果见表1。
表1 不同血清模式组中HBV DNA含量及阳性率对比[例（%）]
组别 | 例数 | HBV DNA含量（拷贝/ml） | 阳性率（%） | |||||
＜5.0×102 | ≥5.0×102 | 5.0×103 | 5.0×104 | 5.0×105 | ＞5.0×106 | |||
A组 | 148 | 6（4.05） | 4（2.70） | 35（23.65） | 50（33.78） | 31（20.95） | 22（14.87） | 95.95 |
B组 | 143 | 98（68.53） | 10（6.99） | 14（9.79） | 12（8.39） | 4（2.80） | 5（3.50） | 31.47 |
C组 | 159 | 76（4.78） | 10（6.29） | 17（10.69） | 32（20.13） | 16（10.06） | 8（5.03） | 52.20 |
3 讨论
实时荧光定量PCR检测具有较高的特异性和灵敏度，可多重反应并且拥有准确、实时、无污染的特点，被广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因检测等研究中。不仅可以对病毒定性，还可以准确、快速的对病毒核酸进行定量，进而能够对病毒数量在疾病治疗过程中的消长规律进行研究，并可治疗效果及可能出现耐药性进行评估。
HBV DNA标志着病毒复制的存在，与肝病传染和活动相关，本组研究中其A组阳性率达95.95%，与相关文献报道相似，并且比B、C组明显高出很多，同时A组组内患者血清的HBV DNA也有较大差异，有69.05%超出5.0×104拷贝/ml，表示乙肝病毒正处于复制活跃期。B组复制数据降低，但仍有31.47%的患者血清HBV DNA含量≥5.0×104拷贝/ml，证明病毒DNA复制没有停止。C组是HBsAg病毒携带者或急性肝炎患者，阳性率明显比B组高，比A组低。B、C组乙肝病毒复制处于非活跃状态。实时荧光栋梁PCR检测可以对病毒携带者地传染性及携带水平进行直接有效的反应，是乙肝病毒传染性、复制活动性及携带量检测的可靠性指标，可以为乙肝病毒感染诊断、治疗及预后判断提供客观依据。
本组研究中A组中HBV未达到理论上的100%，可能部分病患治疗后乙肝病毒复制受到抑制或发生变异产生假阴性有关，但血清学标志却可以仍表达为阳性[3]。说明PCR仅能够检测复制的病毒，对于病毒非复制感染不能有效检测，因而不可在肝炎检测中完全替代血清标志物检测。
4 参考文献
[1] 梁晓峰,陈园生,王晓军,等.中国3岁以上人群乙型肝炎血清流行病学研究[J].中华流行病学杂志,2005,26(9):655.
[2] 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学会.病毒性肝炎防治方案[J].中华肝病学杂志,2000,8(2):324.
[3] 李金明.实时荧光PCR技术[M].北京:人民军医出版社,2007:17.