摘 要：目的：探讨大肠杆菌热稳定肠毒素的检测方法与效果。方法：采用三种方法检测大肠杆菌的热稳定肠毒素。结果：酶联免疫吸附实验与双向琼脂扩散实验的LT检出率与实验灵敏度比乳鼠罐胃实验要高，而且酶联免疫吸附实验能同时测定十几个样品。结论：三种方法检测大肠杆菌热稳定性肠毒素，其中酶联免疫吸附实验方法特异性强、重复性好；双向琼脂扩散实验是测定LT的经典方法，敏感性较高；乳鼠实验被认为是测定ST 的常规方法，但其检出不高且受很多因素制约。
关键词：LT肠毒素；大肠杆菌；免疫佐剂；疫苗
不耐热肠毒素（Heat-labile enterotoxin，LT）是产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）产生的一种对热敏感的毒素，是引起旅游者腹泻、婴幼儿严重性甚至致命性腹泻和某些家畜腹泻的主要原因之一[1]。LT有LT-I和LT-Ⅱ两型，前者由ETEC遗传因子大质粒编码产生，后者由染色体DNA编码产生。LT是由1个分子量约28 kD的A亚基（IJTA）和5个分子量约为12 kD的B亚基（LTB）构成的六聚体（Mr 90 kD）。LTA具有ADP-核糖基转移酶活性，可使胞内cAMP水平升高，细胞液体及电解质流失，进而导致腹泻。五聚体的B亚单位包含有细胞表面神经节甘脂（GM1）结合位点，通过LTB与GM1的结合，LT得以进入胞内并进而发挥毒性。LT具有良好的免疫原性，LT含有引起LT-特异性抗体应答的大部分优势抗原表位，两者均能有效地启动机体产生局部和全身的T细胞和B细胞免疫应答，还能使T、B细胞产生长期的记忆反应。已经证明，不同地区分离的ETEC致病菌株产生的LT之间的免疫原性完全相同，并与霍乱弧菌肠毒素有一定抗原关系。人源和动物来源的ETEC的LT基因也有很多同源性[2]。因此，选择一种快速、灵敏、合适的方法检测大肠杆菌的LT具有重要的生物学意义。目前测定LT的方法很多，如酶联免疫吸附实验、乳兔口服实验、兔皮肤蓝斑试、双向琼脂扩散实验、乳鼠罐胃实验，大白鼠空肠灌注法、被动免疫溶血抑制实验、固相放射免疫法等。为探索测定大肠杆菌IT的简便方法，提高测定的效率，笔者主要采用酶联免疫吸附实验、双向琼脂扩散实验、乳鼠罐胃实验三种具有代表性的方法，对猪源大肠杆菌的不同菌株做了热敏感肠毒素的检测实验。
1 资料与方法
1.1 一般资料：菌株：LT标准阳性菌株由微生物室分离鉴定并保存，血清型有O8，O11，O20，O39等。食品来源：健康成年猪肉购自某市集贸市场。培养基：改良明卡培养基，Elek氏培养基，自制。仪器：DSHZ-300型多用途水浴恒温振荡器、高速冷冻离心机（型号TGL-16G）、HZQ XlOO型振荡培养箱、WZ-2A型磁力搅拌器。
1.2 方法
1.2.1 产毒培养：将实验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6 ml改良明卡汤培养基内，37℃振荡培养过夜。加入20 000 IU/ml的多粘菌素B 0.05 ml，于37℃，1 h，离心4 000 r/min，15 min，分离上清液，加入0.1%硫柳汞0.05 ml，镜检无菌后。于4℃保存待用。
1.2.2 酶联免疫吸附实验检测LT：先在产肠毒素大肠杆菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管，加入包被液0.5 ml，混匀后全部吸出于3.6 ml包被液中混匀，以每孔100 μl量加入到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第1孔留空作对照，于4℃冰箱湿盒中过夜。将板中溶液甩去，用洗涤液I洗3次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。每孔加100 μl封闭液，于37℃水浴中1 h。用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。每孔分别加各冲实验菌株产毒培养液100 μl，37℃水浴中1 h。用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。先在酶标LT抗体管中加0.5 ml稀释液，混匀后全部吸出于3.6 ml稀释液中混匀，每孔加100 μl，37℃水浴中1 h。用洗涤液Ⅱ洗3次，操作同上。每孔（包括第1孔）各加基质液100 μl，室温下避光作用5～10 min，加入终止液50 μl。以酶标仪在波长492 nm下测定吸光度OD值，待测标本OD值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。
1.2.3 双向琼脂扩散实验检测LT：将被检菌株按五点环形接种于Elek氏培养基上。以同样操作，共做两份，于36℃培养48 h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36℃经5～6 h，使肠毒素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5 mm处的中央，挖1个直径4 mm的圆孔，并用1滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30 μl，用已知产LT和不产毒菌株作对照，于36℃经15～20 h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。
1.2.4 乳鼠罐胃实验检测LT：将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内，于36℃培养24 h，以3 000 r/min离心30 min，取上清液经薄膜滤器过滤，加热60℃ 30 min，每毫升滤液内加入2%伊文思蓝溶液0.02 ml。将此滤液用塑料小管注入1～4日龄的乳鼠胃内0.1 ml，同时接种3～4只，禁食3～4 h后用三氯甲烷麻醉，取出全部肠管，称量肠管（包括积液）重量及剩余体重。肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性，0.07～0.09为可疑。
2 结果
2.1 LT的测定情况：对实验菌株分别采用酶联免疫吸附实验、双向琼脂扩散实验、乳鼠罐胃实验三种方法测定LT，结果见表1。从表中可以看出：酶联免疫吸附实验与双向琼脂扩散实验的LT检出率比乳鼠罐胃实验要高，而且酶联免疫吸附实验能同时测定十几个样品。
表1 三种实验方法对实验菌株LT的测定
菌株 阳性对照 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 |
酶联免疫吸附 # ++ # # # # # # # + # |
双向琼脂扩散 # + + + # # ++ ++ ++ ++ ++ |
乳鼠罐胃 # + # + + + # - - + - |
方法 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 |
酶联免疫吸附 # ++ ++ + + |
双向琼脂扩散 # - - - - |
