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青霉胺对巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶的影响的

2015-07-24 09:33 来源:学术参考网 作者:未知

 动脉粥样硬化是一种发生在血管壁的慢性炎症过程[1],在高血脂、高血压、遗传、年龄等全身因素和血流动力、毒素、病毒等局部因素作用下,内皮细胞损伤,低密度脂蛋白(LDL)渗出到内皮下聚集并氧化变性,刺激局部内皮细胞表达黏附因子趋化因子配体2(chemokine ligand 2,CCL-2)等促进血液中单核细胞等的黏附和渗出,并分化为巨噬细胞[2]。巨噬细胞在动脉粥样硬化过程中发挥关键作用,一方面其吞噬LDL转化为泡沫细胞,并坏死形成脂质核;另一方面巨噬细胞是粥样斑块中细胞成分的主要部分,可分泌多种细胞因子及NO等改变局部环境,影响斑块的稳定和疾病的发展[3]。诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)是炎症的重要标志,其可催化产生大量NO,NO在免疫应答中有着复杂而且呈双面性的作用,同时NO供体也是应用多年的冠心病治疗药物,NO在免疫应答中的双面性作用对动脉粥样硬化病程有什么样的影响?本研究通过观察S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺(S-nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine,SNAP)对RAW 264.7巨噬细胞内iNOS mRNA和蛋白表达的影响,旨在探讨NO对巨噬细胞的影响及其在动脉粥样硬化发展过程中的作用,为临床治疗冠状动脉粥样硬化提供新的依据。
  1 材料与方法
  1.1 主要试剂
  RAW 264.7单核巨噬细胞购自中国科学院上海细胞库,高糖DMEM培养基(美国HyCLone公司)。新生胎牛血清购于杭州四季青生物有限公司。SNAP购自美国Sigma公司。PCR引物合成、RNA提取及逆转录试剂盒均由大连宝生物试剂公司提供。兔抗小鼠NOS2多克隆一抗(sc-650)购自Santa公司,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购于Raygene 公司。
  1.2 方法
  1.2.1 细胞培养及实验分组 RAW 264.7巨噬细胞用含10 %胎牛血清的高糖DMEM培养基,置于37℃、5%CO2培养箱内培养,0.25%胰酶消化、传代,2~3代后处于对数生长期的RAW 264.7细胞用于实验。实验分组:①空白对照组:完全培养基;②不同浓度SNAP组:分别加入30、100、300、400、500 μmol/L的SNAP,作用于巨噬细胞24 h。
  1.2.2 RT-PCR检测iNOS mRNA的表达 收集各组细胞,按照RNA提取试剂盒说明提取总RNA,测定总RNA的量及纯度。取2 μl(500 ng)总RNA逆转录合成cNDA,再取2 μl逆转录产物采用SYBR Ⅱ嵌合荧光法直接进行PCR循环。iNOS的引物序列:上游引物5′-GCTGAACTTGAGCGAGGA,下游引物3′-ACTCAGTGCCAGAAGCTGGA,产物长度185 bp;β-actin的引物序列:上游引物5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC,下游引物3′-ATGGAGCCACCGATCCACC,扩增长度171 bp。两步扩增法:条件为:一个循环95℃ 10 s;40个循环,95℃ 5 s,60℃ 31 s。结束后进行溶解曲线分析,通过观察溶解曲线是否为单一峰评价PCR反应产物的特异性,每个反应设置2个复孔。所有RT-PCR实验至少重复3次。RT-PCR统计分析采用2-ΔΔCt法,ΔΔCt=各组ΔCt(目的基因-管家基因Ct)-对照组ΔCt(目的基因Ct-管家基因Ct)。
  1.2.3 Western blotting检测iNOS蛋白的表达 收集各组细胞,加入裂解液裂解细胞,提取总蛋白。用BCA法进行蛋白定量。用6%SDS-聚丙烯胺凝胶进行电泳分离、每孔的上样量为100 μg,转膜,5%脱脂牛奶封闭1 h后,用一抗iNOS(1∶300)或β-Actin(1∶10000),4℃过夜,PBST洗膜10 min×3次,加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000),室温孵育1 h,PBST洗膜15 min×3次。把膜放于WEST PICO 2 min,压片,显影,检测特异性蛋白条带。用软件ImageJ进行灰度分析,将各组的iNOS分别于内参β-Actin的光密度值进行比较,两者的比值代表iNOS蛋白的表达。
  1.3 统计学分析
  采用SPSS 18.0进行统计学分析,所有数据采用x±s表示,实验数据组间比较采用单样本或两样本t检验,两样本t检验时检验方差齐性,总体方差不齐时采用Cochran﹠Cox法,以P<0.05为差异有统计学意义。
 2 结果
  2.1 巨噬细胞形态
  显微镜下RAW 264.7巨噬细胞以类圆形或多边形为主,有1个或两个伪足伸出(图1)。
  A
  B
  图1 显微镜下RAW 264.7巨噬细胞
  A.10×10倍倒置显微镜下未贴壁巨噬细胞照片;B.10×20倍倒置显微镜下贴壁巨噬细胞照片
  2.2 SNAP对RAW 264.7巨噬细胞iNOS mRNA表达的影响
  不同浓度SNAP作用于RAW 264.7巨噬细胞24 h后与空白对照组比较,各干预组iNOS mRNA的表达均明显下降(P<0.05)(图2)。
  图2 SNAP对RAW 264.7巨噬细胞iNOS mRNA表达的影响
  与对照组比较,*P<0.05
  2.3 SNAP对RAW 264.7巨噬细胞内iNOS蛋白含量的影响
  与空白对照组比较,不同浓度(30、100、300 μmol/L)SNAP组iNOS蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),且降低和浓度相关(图3、4)。
  图3 SNAP对RAW 264.7巨噬细胞内iNOS蛋白的影响
  1.对照组;2.30 μmol/L SNAP干预组;3.100 μmol/L SNAP干预组;4.300 μmol/L SNAP干预组
  图4 SNAP对RAW 264.7巨噬细胞内iNOS蛋白含量的影响
  与对照组比较,*P<0.05
  3 讨论
  巨噬细胞分泌的NO是炎症过程中的重要物质[4],本实验证实其在发挥杀菌及杀死肿瘤细胞的作用的同时,可以抑制巨噬细胞自身iNOS mRNA基因转录,降低iNOS的合成而发挥负反馈作用。
  NO在体内是一种参与了多种病理生理过程的信号信使分子,包括神经传递、炎症、免疫反应及心血管系统生理病理[4]。NO除了扩张血管作用外对动脉粥样硬化的影响是多方面的[5],Martinet等[6]证实NO可以选择性促进巨噬细胞凋亡而使动脉粥样斑块更加稳定。体内的一氧化氮合酶(NOS)可以将L-精氨酸转化为NO和瓜氨酸,其可分为构成型一氧化氮合酶(constitutive nitric oxide synthase,cNOS)和iNOS。cNOS在机体内持续结构性的表达,包括内皮细胞型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase,eNOS)和神经型一氧化氮合酶(neuronal nitricoxide synthase,nNOS)[7]。iNOS分布广泛,炎症因子、LPS、细菌内毒素等刺激后在多种组织、细胞中都可以检测到,包括巨噬细胞、单核细胞、肺泡 上皮细胞等,在炎症或免疫应答过程中IFN-γ、TNF-α、LPS、内毒素等诱发巨噬细胞高表达iNOS产生大量的NO,NO是脂溶性小分子物质,渗透性强,是炎症反应局部内重要的活性物质[8],其在杀灭肿瘤细胞、入侵的微生物等的同时,也能抑制淋巴细胞增殖、TNF-α、IFN-γ炎症介质的分泌而发挥负向免疫调节功能,并可造成自身组织的损伤[4]。Assreuy等[9]的实验证实NO可以直接抑制iNOS活性。本实验进一步证实NO可抑制iNOS基因的转录及iNOS蛋白的表达,而不是仅仅抑制iNOS酶活性发挥负反馈作用。
  iNOS基因位于17号染色体,由26个外显子、25个内含子组成,约37 kb大小作用是由于其抑制IFN-γ等炎症因子分泌引起还是直接作用于基因序列引起?可能两者都有关,因为有实验报道NO可以引起核苷酸序列破坏。不管怎样,其具体机制还需要更多的研究。
  动脉粥样斑块内存在大量的免疫细胞,以巨噬细胞为主,在正常的动脉血管壁内监测不到NO,但在动脉粥样斑内存在较高浓度的NO[12-13]。我们的研究证实NO可以抑制巨噬细胞iNOS的表达,这种负反馈机制可能是调节局部炎症平衡的机制之一。同时巨噬细胞可分为不同亚型,其作用不同甚至相反,主要有促炎型的M1亚型及修复型的M2亚型[3,14],iNOS也是M1亚型的分化标志[15],NO抑制巨噬细胞iNOS的表达,可能会促进巨噬细胞向M2亚型分化。有实验利用人颈动脉斑块切片,观察到在粥样斑块肩部M1Φ占明显优势,只有少数有限的M2Φ存在,在斑块内部和纤维帽处两型之间没有明显差别[16]。推测粥样斑块内巨噬细胞亚型分化的调整,改变了粥样斑块的稳定性,最终影响动脉粥样硬化的病程[3,17]。
  已有实验报道NO除了扩血管作用外,对动脉粥样硬化病程的作用是多样的[5-6],本实验证实NO能抑制巨噬细胞iNOS的表达而发挥负反馈作用,这种作用可能也会影响动脉粥样硬化病程,这方面还需要进行更多的研究。
  [参考文献]
  [1] Hansson GK.Atherosclerosis——an immune disease:the Anitschkov Lecture 2007[J].Atherosclerosis,2009,202(1):2-10.
  [2] Libby P,Ridker PM,Hansson GRK.Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis[J].Nature,2011,473(5):317-325.
  .J Innate Immun,2012,4(5-6):498-508.

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