作者：何青莲 ,熊敏,李云英 石灵春 ,谭敏,李华
【摘要】 【目的】 观察诱生型一氧化氮合酶(inos)在脉冲噪声暴露白色和杂色豚鼠耳蜗中的表达,以探讨黑色素对耳蜗损伤的保护作用机理。【方法】将白色和杂色豚鼠暴露于脉冲噪声,复制耳蜗损伤的模型。采用免疫组织化学的方法观察inos在两组豚鼠耳蜗的表达。 【结果】inos在两组脉冲噪声暴露豚鼠耳蜗中均呈阳性表达,以血管纹和螺旋神经节的表达较强,而且inos在白色豚鼠耳蜗的表达显著强于杂色豚鼠。【结论】耳蜗黑色素拮抗耳蜗损伤的作用可能是通过抑制耳蜗inos表达来实现的。
【关键词】 耳蜗/损伤;耳蜗/病理学;脉冲噪声;黑色素;疾病模型，动物;豚鼠
一氧化氮(nitric oxide, no)有多种生物学作用,由l精氨酸在一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, nos)的催化作用下产生。有研究表明诱生型nos(inos)参与噪声的耳蜗损伤机制[1],而黑色素对杂色豚鼠耳蜗的损伤有拮抗作用[2]。目前有关黑色素拮抗豚鼠耳蜗损伤的机理尚不清楚[3],本研究应用免疫组织化学方法观察inos在脉冲噪声暴露损伤白色和杂色豚鼠耳蜗的表达,以探讨黑色素是否通过抑制inos的表达而拮抗耳蜗损伤。WWW.133229.cOM现报道如下。
1材料与方法
11实验动物选用健康白色红目豚鼠(白色组)和杂色豚鼠(杂色组)各8只,耳镜检查鼓膜正常,耳廓反射灵敏。豚鼠来源于广东省医学实验动物中心,3月龄,体质量250 g左右,雌雄兼用,合格证号：0017410。
12主要试剂与仪器抗inos抗体、链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物(sabc)免疫组化试剂盒(sa1022)均为sigma公司产品。86式自动步枪来源于广东省军区军训靶场，pathfinder i型听功能测试仪(nicolet公司)。
13造模方法[4-5]脉冲噪声发生源为86式自动步枪,脉冲噪声发生环境为军训靶场,将豚鼠置于距步枪口15 cm处,测得该处声压为170 db。步枪连续激发6发,每次激发间隙10 s。
14听觉脑干诱发电位(abr)检测abr阈值采用听功能测试仪记录,短声刺激,声音由耳机通过与豚鼠外耳道耦合的塑料小管输入,以第3波为基准测反应阈,测定脉冲噪声暴露前后听阈值。两组豚鼠在脉冲噪声暴露前及暴露后24 h行abr检测。
15取材最后1次检测abr后,豚鼠在全麻下开胸,以磷酸盐缓冲液(pbs)心脏灌流,在灌流液清亮时,改用40 g/l多聚甲醛灌注固定5 min。迅速取下双侧颞骨,将耳蜗置于4℃、40 g/l多聚甲醛液中,在解剖显微镜下摘除镫骨,用细针于蜗顶钻一小孔,轻轻以40 g/l多聚甲醛灌流耳蜗,耳蜗在40 g/l多聚甲醛固定12 h以上,pbs漂洗数次,100 g/l乙二胺四乙酸(edta)脱钙,石蜡包埋,切片,每片厚度6 μm。
16免疫组织化学染色两组豚鼠耳蜗切片以二甲苯及酒精脱石蜡后,tris缓冲盐溶液(tbs)漂洗10 min×3次,体积分数2%双氧水处理20 min。tbs漂洗10 min×2 次后,2 g/l triton处理10 min。tbs漂洗10 min×2次,50 g/l胎牛蛋白封闭60 min。加抗inos抗体(以8 g/l胎牛蛋白稀释为1∶800,sigma公司,从兔血清制备)，在4℃冰箱过夜。加入二抗(羊抗兔, 用tbs稀释为1∶400)1 h,tbs漂洗后加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(strephrp,用tbs稀释为1∶100)1 h,tbs漂洗10 min×4次后,用二氨基联苯胺(dab)显色液显色,显色在光镜下控制进行。阴性对照以8 g/l胎牛蛋白代替抗inos抗体,以庆大霉素损伤豚鼠肾脏切片为阳性对照。inos在两组豚鼠耳蜗的表达强度以+～+++表示进行半定量分析[6]。
17统计学方法采用spss 115软件进行数据的统计学分析。
2结果
21两组豚鼠abr听阈变化由表1可知,两组豚鼠在脉冲噪声暴露后abr比较差异具有显著性意义(p<001),杂色豚鼠的平均听阈比白色豚鼠约低17 db左右。表1两组豚鼠abr听阈变化比较
22两组豚鼠耳蜗inos表达比较
inos在两组豚鼠耳蜗反应均呈阳性,而且在耳蜗的各转都呈阳性,inos在白色豚鼠耳蜗的表达明显强于杂色豚鼠。在corti氏器,支持细胞如：hensen细胞、deiter细胞、内外柱细胞、边缘细胞inos反应均呈阳性。感觉细胞(内、外毛细胞)inos染色呈阳性,外毛细胞染色较强,内毛细胞染色较弱。蜗神经的inos染色在光镜下呈阴性。图1结果显示：白色豚鼠耳蜗血管纹和螺旋神经节细胞inos反应均呈强阳性 (图1-a,b),杂色豚鼠耳蜗血管纹和螺旋神经节细胞inos反应均呈弱阳性 (图1-c,d)。inos在两组豚鼠耳蜗的表达强度见表2。表2两组豚鼠inos耳蜗表达强度比较
3讨论
噪声能导致耳蜗的损伤,噪声引起耳蜗的损伤包括机械性和代谢性两种机制,一般认为先有机械性损伤,之后继发代谢性损伤。杂色豚鼠耳蜗黑色素能拮抗噪声对耳蜗的损伤作用,但是黑色素拮抗耳蜗损伤的作用机理不清楚[3]。研究证实inos是参与噪声耳蜗损伤的主要病理因素之一[1]。本研究结果表明在脉冲噪声损伤时inos在杂色豚鼠耳蜗的表达强度显著低于白色豚鼠耳蜗的强度,证明杂色豚鼠耳蜗黑色素通过代谢途径抑制inos活性,从而拮抗豚鼠耳蜗的损伤。inos在脉冲噪声损伤耳蜗中表达阳性,尤以血管纹和螺旋神经节细胞为甚。inos在正常的组织中不表达,一旦在病理因素的刺激下表达则持续催化产生大量no[7],而大量no则对组织产生损伤作用。另外,no与过氧化物反应产生过氧亚硝酸盐[8-9],过氧亚硝酸盐能迅速解离氢氧根自由基,亦导致细胞损伤。同时,no能激活n-甲基-d-天冬氨酸受体的负反馈机制,而导致内耳的神经阻滞[10]。豚鼠耳蜗在暴露脉冲噪声后血管纹和螺旋神经节inos的表达较强,从而产生大量no而损伤血管纹和螺旋神经节细胞。血管纹是整个耳蜗包括内外毛细胞及支持细胞能量的主要来源[11],血管纹的损伤导致耳蜗功能的失调。螺旋神经节细胞是听觉传导路的一级神经原,其损伤导致听觉传导的阻滞。综上所述,脉冲噪声能引起耳蜗inos的表达,而杂色豚鼠耳蜗黑色素通过代谢途径抑制inos活性,从而拮抗脉冲噪声耳蜗的损伤。
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