【关键词】 子宫内膜异位症;卵巢肿瘤;pten;基因,ras
【摘要】 目的 探讨第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(pten)、kras蛋白表达与卵巢子宫内膜异位症(内异症)恶变的关系。方法 应用免疫组化方法检测21例内异症相关卵巢癌、10例不典型内异症及23例内异症病人pten、kras蛋白表达，同时结合内异症相关卵巢癌临床病理学参数，分析其在内异症恶变过程中作用。结果 内异症相关卵巢癌组pten蛋白表达阳性率低于内异症组，差异有显著性(p=0.011); 内异症相关卵巢癌组kras蛋白阳性表达率高于不典型内异症组及内异症组，差异均有显著性(p=0.002、0.023)。pten、kras蛋白表达与内异症相关卵巢癌的分化程度、临床分期具有相关性(p=0.007～0.047)，而与年龄、病理类型无相关性(p>0.05)。结论 pten蛋白表达缺失可能是卵巢内异症恶变过程中的早期事件，而kras蛋白的过表达可能与卵巢内异症的恶变有关，pten、kras的异常表达可能均参与了卵巢内异症的恶变过程。
【关键词】 子宫内膜异位症;卵巢肿瘤;pten;基因,ras
abnormal expressions of pten and kras in malignant transformation of endometriosis fu zhumei, dai shuzhen, yao qin, et al (department of obstetrics and gynecology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china); [abstract] objective to investigate the association of abnormal expressions of pten and kras in the process of malignant transformation of endometriosis. methods the protein expressions of pten and kras were detected with immunohistochemistry in 21 cases of endometriosisassociated ovarian cancers (eaocs), 10 of atypical endometriosis (aems) and 23 of endometriosis. the role of pten and kras in malignant transformation of endometriosis was analyzed in combination with the pathological and clinical data of eaocs. results the positive rate of pten expression in eaocs was significantly lower than that in endometriosis (p=0.011). the positive rate of kras expression in eaocs was significantly higher than that in aems and endometriosis (p=0.002,0.023). the expressions of pten and kras were significantly associated with the differentiation and clinical stage of eaocs (p=0.007-0.047), but was not related to patient’s age and pathology type (p>0.05). conclusion reduction of pten protein expression might be an early event in malignant transformation of endometriosis,while overexpression of kras might be associated with the process of malignant transformation of endometriosis. both pten and kras might be involved in malignant transformation of endometriosis.
[key words] endometriosis; ovarian neoplasms; immunohistochemistry; pten; genes, ras
子宫内膜异位症(内异症)是妇科常见病和多发病，虽为良性病变，但却有浸润、破坏周围组织、远处转移及易复发等恶性特点，而且有一定比例的内异症可发生组织学改变，成为癌症[1]。WwW.133229.coM目前，内异症恶变的发病机制尚不十分清楚。已有研究证实，癌基因的激活或抑癌基因的失活与其发生有一定相关性。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(pten)为一种抑癌基因，在多种人类恶性肿瘤中均存在该基因的突变或缺失。kras癌基因是一种由点突变方式激活而致细胞癌变的原癌基因，不受细胞类型和分化阶段限制，是研究基因调控的中心基因，也是人类肿瘤中最常被激活的原癌基因。本研究应用免疫组织化学方法分别检测了卵巢内异症、卵巢不典型内异症和内异症相关卵巢癌组织pten、kras蛋白表达，旨在探讨二者在卵巢内异症恶变过程中的作用。
1 材料和方法
1.1 标本及其来源
收集青岛大学医学院附属医院与青岛市市立医院1992—2007年收治的内异症相关卵巢癌手术标本21例，包括内异症相关卵巢子宫内膜样癌13例，内异症相关卵巢透明细胞癌8例，21例中1例符合sampsonscott内异症恶变诊断标准;病人平均年龄为51.2岁(39～70岁);根据2000年figo标准进行临床分期，ⅰ期7例，ⅱ期5例，ⅲ期9例。不典型内异症标本10例，病人平均年龄为38.5 岁(28～50岁)。内异症组织 23例，病人平均年龄为50.2岁(33～62岁)。所有病人术前均未接受放疗、化疗或性激素治疗，所有组织标本均经病理学检查证实。标本经40 g/l甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。
1.2 主要试剂
兔抗人kras多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，根据产品说明，配制抗体工作浓度为1∶100。鼠抗人pten单克隆抗体(工作液)及sp试剂盒、dab显色液等购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 pten、kras蛋白表达检测
采用免疫组化pv9000二步法，按试剂盒说明书进行操作。用pbs代替一抗作阴性对照，已知乳癌阳性片作阳性对照。
1.4 结果判定标准
pten蛋白主要定位于细胞核和(或)细胞浆，出现棕黄色颗粒状染色为阳性;kras蛋白主要定位于细胞浆中，细胞浆呈棕黄色染色为阳性。按照shimizu等[2]方法综合染色强度和阳性细胞百分率确定表达水平。①染色强度：无染色或染色不清为0分;浅黄色为1分;棕黄色为2分;深棕色或褐色为3分。②阳性细胞百分率：阳性细胞为胞浆或胞核中出现黄色或棕褐色颗粒，阳性细胞数<10%为0分;10%～25%为1分;26%～50%为2分;>50%为3分。每张切片计分等于以上二项分数的乘积：0～1分为阴性(-)，≥2分为阳性(+)。
1.5 统计学处理
采用spss 15.0及ppms 1.5[3]统计学软件进行数据处理，数据间比较采用fisher精确概率法检验，相关性采用spearman等级相关分析。p<0.05为差异有显著性意义。
2 结 果
2.1 各组pten、kras蛋白表达比较
内异症相关卵巢癌组pten蛋白表达阳性率低于内异症组，差异有显著性(p=0.011)，而与不典型内异症组相比差异无显著性(p=0.458);内异症相关卵巢癌组kras蛋白阳性表达率高于不典型内异症组和内异症组，差异有显著意义(p=0.002、0.023)。见表1。
2.2 pten和kras表达与内异症相关卵巢癌临床病理参数的关系
内异症相关卵巢癌组织中pten蛋白的表达随临床分期的增高及分化程度的降低而降低，差异有统计学意义(p=0.024);kras蛋白表达与内异症相关卵巢癌的分化程度以及临床分期有关，临床分期愈高、分化程度愈低其阳性表达率愈高(p=0.007、0.047);而与病人年龄及组织病理学类型无关(p=0.397、1.000)。见表2。表1 各组pten、kras蛋白表达比较(例)组 别npten表达-+kras表达-+内异症组23419194不典型内异症组104682内异症相关卵巢癌组21129714表2 pten和kras表达与内异症相关卵巢癌临床病理参数的关系(例)临床病理参数npten表达-+kras表达-+年龄(岁) <5095445 ≥50127539临床分期 ⅰ～ⅱ124875 ⅲ98109组织类型 子宫内膜样癌137649 透明细胞癌85335分化程度 g1～g2145977 g377007
2.3 内异症相关卵巢癌组pten与kras蛋白表达的关系
8例kras阳性表达的内异症相关卵巢癌组织中，6例pten蛋白表达阳性;而5例kras蛋白表达阴性的内异症相关卵巢癌组织中，2例pten蛋白表达阳性，两者之间无明确的相关性(r=0.139，p>0.05)。
3 讨 论
pten是迄今发现的惟一具有双重磷酸酶活性的抑癌基因，当pten发生基因突变、缺失或失活时，pten蛋白表达下调或活性改变，其抑制肿瘤细胞增殖、黏附、迁移及血管生成的能力减弱，从而促进肿瘤的发展。目前对pten与内异症恶变关系的研究尚处于探索阶段。jing等[4]对内异症相关卵巢子宫内膜样癌、癌旁内异症病灶以及典型卵巢内异症3组病变组织进行杂合性缺失(loh)检测，结果显示9p、11q和22q的loh发生率较高，并且3组病变的loh发生率依次递减。本研究结果显示，pten在内异症相关卵巢癌组的阳性表达率低于不典型内异症组和内异症组，提示pten的缺失在内异症发生恶变过程中具有一定作用。obata等[5]对81例卵巢癌研究显示，pten突变主要发生在临床ⅰ期和(或)病理ⅰ级的病人，表明pten失活是卵巢癌发生的早期事件。martini等[6]对46例ⅲ～ⅳ期内异症病人研究结果类似，并同时指出pten蛋白表达水平下降可被视为卵巢内异症恶性转化的标志之一。本研究结果显示，pten蛋白表达与内异症相关卵巢癌病人的年龄、病理类型无关，与内异症相关卵巢癌的临床分期和分化程度有关，随着肿瘤临床分期的增加和分化程度的下降，pten蛋白表达亦相应下降。根据这一结果我们推测，pten蛋白表达缺失可能是内异症恶变过程中的早期事件，亦可能是内异症恶变的机制之一，这与郑庆梅等[7]从分子水平研究所得结论相一致。
kras癌基因为原癌基因，在正常组织中有一定表达，kras癌基因只有经过突变后才能转化成致癌基因，在组织中出现异常的表达。otsuka等[8]检测37例卵巢透明细胞癌的kras基因表达，有6例发生突变，其中有3例癌组织旁可见异位子宫内膜和不典型内异症，后利用激光纤维切割法分别取异位内膜、不典型内异症和癌组织处细胞进行dna分析，结果显示，kras突变仅存在癌组织中，异位内膜和不典型内异症组织中无kras基因突变。本研究结果显示，kras在内异症相关卵巢癌中的表达高于不典型内异症和内异症组，差异具有统计学意义;不典型内异症组与内异症组的kras蛋白表达不同，但两者差异无显著性。由此我们认为，内异症恶变可能是由内异症经不典型增生逐渐发展而来的。本研究还显示，在内异症相关卵巢癌组织kras的表达随临床分期的增加、分化程度的下降有增加趋势。推测kras基因突变可能是内异症恶变过程的一个重要环节，kras蛋白表达增加可能预示着肿瘤恶性程度增高。
pten失活可以通过mapk通路引起kras信号转导增强，从而导致肿瘤的发生。dinulescu等[9]研究显示，在同时伴有pten缺失和kras表达的小鼠中，7周内就可以发生卵巢子宫内膜样癌的浸润和广泛转移。本研究结果显示，在内异症相关卵巢癌组织中，pten和kras蛋白表达之间无明显的相关性，可能是由于多种因素共同参与了内异症恶变的过程，从而导致细胞通过不同的途径获得其生存优势所致。
综上所述，pten和kras的异常表达与卵巢子宫内膜异位症恶变密切相关。pten表达减少或kras过度表达在内异症恶变过程中发挥着重要作用，但其具体机制尚有待于进一步研究。
【参考文献】
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[2]shimizu m, saith y, ith h. immunohistochemical staining of haras oncogene product in normal, benign and malignant human pancreatic tissues[j]. hum pathol, 1990,66(3):468473.
[3]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件ppms 1.5的组成和应用特点[j]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.
[4]jing x. allelotyping of endometriosis with adjacent ovarian carcinoma reveals evidence of a common lineage[j]. cancer re, 1998,58:17071712.
[5]obata k, morland s j, watson r h, et al. frequent pten/mmac mutations in endometrioid but not serous or mucious epithelial ovarian tumors[j]. cance res, 1998,58(10):20952098.
[6]martini m, ciccarone m, garganses g, et al, possible involvement of hmlh1, p16 (ink4a) and pten in the malignant transformation of endometriosis[j]. cancer, 2002,102(4):398406.
[7]郑庆梅,戴淑真,罗兵. pten基因在卵巢子宫内膜异位症组织中的表达[j]. 齐鲁医学杂志, 2004,19(4)：294296.
[8]otsuka j, okuda t, sekizawa a, et al. kras mutation may promote carcinogenesis of endometriosis leading toovarian clear cell carcinoma[j]. med electron microsc, 2004,37(3):188192.
[9]dinulescu d i, ince t a. the role of kras and pten in the development of mouse models of endometriosis and endometrioid ovarian cancer[j]. nat med, 2005,11(1)：6370.
