【关键词】 半枝莲黄酮;去卵巢大鼠;学习记忆;雌二醇;体重;输卵管/子宫指数;脾脏/胸腺指数
【摘要】 目的 研究半枝莲黄酮(sbf)对去卵巢大鼠记忆障碍的影响。方法 3月龄雌性大鼠摘除卵巢10个月，通过去卵巢大鼠的学习记忆能力、体重及输卵管/子宫、脾脏和胸腺指数和血清中雌二醇(e2)含量的检测，评价sbf对去卵巢大鼠记忆障碍的影响。结果 与假手术组相比，摘除卵巢使大鼠的学习记忆能力降低、体重明显增加、输卵管/子宫、脾脏和胸腺指数皆显著降低、血清中雌二醇的含量下降。而sbf 17.5、35和70 mg/kg对去卵巢大鼠上述异常变化均有不同程度的改善。结论 sbf能够降低去卵巢大鼠的学习记忆障碍，改善免疫、内分泌异常变化，该作用可能有利于临床老年性痴呆病的治疗。
【关键词】 半枝莲黄酮;去卵巢大鼠;学习记忆;雌二醇;体重;输卵管/子宫指数;脾脏/胸腺指数
【abstract】 objective to detect the improvement of scutellaria barbata flavonoid (sbf) on impaired memory of ovariectomy rats. methods three month yeas old female rats was executed ovariectomy (ovx). after 10 months, the learning and memory ability, body weight gain, oviduct/uterus, spleen and thymus index, serum estradiol were detected to evaluate the rat′s memory. results compared with sham group, learning and memory ability was decreased, body weight was increased, oviduct/uterus, spleen and thymus indexes, serum estradiol were decreased in ovx rats. 17.5, 35 and 70 mg/kg sbf could improve above indexes changes in various degree. conclusions sbf can decrease the impaired memory of ovx rats, improve immune and endocrine abnormal changes, which is beneficial to the treatment of clinical senile dementia.
【key words】 scutellaria barbata flavonoid; ovariectomy rats; learning and memory; estradiol; weight; oviduct/uterus; spleen/thymus index
绝经后妇女雌激素替代疗法可以降低罹患老年性痴呆(ad)的风险，明显改善ad患病妇女的记忆和认知障碍;然而雌激素长期应用会引起诸多不良反应，尤其是乳腺癌和子宫内膜癌的发病率非常高。WWW.133229.cOm黄酮类化合物具有雌激素样作用，被称为植物雌激素，可以通过补充机体内源性雌激素水平发挥雌激素样作用，具有改善记忆障碍药理学活性。半枝莲的主要化学成分是黄酮类化合物，且以野黄芩苷为主，提示从半枝莲中提取的黄酮类化合物可能会通过提高内源性雌激素水平发挥改善记忆障碍的作用。本研究利用大鼠去除卵巢导致衰老模型观察半枝莲黄酮(sbf)对学习记忆、免疫、内分泌系统异常改变的作用，为其能够开发为新的抗痴呆中药制剂奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂
健康雌性sd大鼠60只(200～220 g，三月龄)，河北医科大学实验动物中心提供;倍美力，爱尔兰惠氏药厂提供; 血清雌二醇(e2)化学发光免疫分析定量试剂盒，潍坊市康华生物技术有限公司提供;sbf(81.78%)由实验室制备。
1.2 方法
1.2.1 实验过程
60只雌性大鼠，其中52只摘除卵巢作为手术组，其余8只作为假手术组，手术组大鼠注射10%水合氯醛330 mg/kg麻醉，在背部下躯干1/3处离开脊柱两侧各1～2 cm作纵向切口，钝性分离进入腹腔，在肾脏下方拉出一脂肪团，继续分离可找出一团丝线状不规则呈粉红色组织即为卵巢，丝线在卵巢根部结扎输卵管，剪掉两侧卵巢，术后腹腔注射青霉素10万u/kg;假手术组仅切除同样大小的脂肪组织而不摘除卵巢，每月记录体重。术后10个月，手术大鼠随机分为模型组、3个剂量实验药物组和阳性对照药组，并分别予sbf 17.5，35和70 mg/kg和倍美力0.065 mg/kg 35 d，假手术组和模型组予等体积的生理盐水，1次/d，连续给药至第31天，各组大鼠在腹腔注射sbf、倍美力或生理盐水60 min后，进行水迷宫学习能力测试，连续测试5 d(继续给药)。水迷宫测试结束后，在手术后第36天，各组大鼠在给药物60 min后，称体重，乙醚麻醉，断头取血3 500 r/min 离心20 min，分离血清，-20℃冻存，用于雌二醇含量的测定;同时剥离胸腺、脾脏和输卵管子宫称重，计算器官指数。
1.2.2 学习记忆能力测试
大鼠学习记忆能力采用大鼠morris水迷宫行为实验法，给药第31天，各组大鼠在给药60 min后，进行水迷宫学习能力测试。正式测试前1 d，令每只大鼠在迷宫中熟悉180 s，第二天开始正式实验。大鼠面向池壁在起始点放入水中，记录大鼠自放入水到达平台的时间(潜伏期)。如果大鼠在180 s内找到平台，让大鼠在平台上呆20 s;如大鼠在180 s内未找到平台，可将大鼠人为的放到平台上并使其在平台上呆20 s。让大鼠离开迷宫休息10 s，再进行下一个点的测试。起始点的选择：第一点是从两个离平台远的起点选择之一，第二点是从两个离平台近的起点选择之一，大鼠连续测试5 d(继续给药)，以2次/d游泳潜伏期均值作为当日的学习成绩。在最后1 d的学习能力测试结束后，撤去平台，让每只大鼠在迷宫中游泳120 s，大鼠在穿越平台放置区域的次数和游泳时间作为衡量大鼠记忆保持的能力，在此区域穿越平台的次数越多，游泳时间越长，说明大鼠记忆保持能力越强。
1.2.3 体重增长率及脏器指数的测定
实验动物手术前及处死称体重，按公式计算：体重增长率=(处死前体重-手术前体重)/手术前体重×100%。实验动物处死后，迅速摘取胸腺、脾脏和输卵管/子宫，称湿重，按公式计算：器官指数(g/kg)=脑器重量/动物体重。
1.2.4 血清e2浓度的测定
-20℃冻存的大鼠血清，室温融化采用竞争抑制法测定血清中e2的浓度。操作步骤按试剂盒的说明书进行。
1.3 统计学分析
采用 spss11.5统计软件进行处理，结果用x±s表示，组间多样本均数间比较采用单因素方差分析(oneway anova);两样本均数比较用snk检验。
2 结 果
2.1 sbf对去卵巢大鼠学习能力的影响
水迷宫测试随训练天数的增加各实验组大鼠找到平台的时间均逐渐缩短，与假手术组比较，模型组的潜伏期显著延长(p<0.01)，表明摘除卵巢对雌性大鼠空间记忆学习能力产生影响;与模型组相比，sbf 17.5、35和70 mg/kg明显缩短去卵巢大鼠潜伏期，且该作用呈剂量依赖性关系(p<0.05，p<0.01);阳性对照药倍美力(0.065 mg/kg)也表现出类似的作用，见表1。5 d的学习能力测试结束后，撤去平台，测试大鼠的记忆保持能力。与假手术组相比，模型组穿越平台的次数显著降低(p<0.01)，而ig药物sbf 17.5、35、70 mg/kg和倍美力0.065 mg/kg 35 d均能不同程度地增加大鼠在平台放置区的穿越次数。同时，模型组在平台放置区的游泳时间比假手术组明显降低(p<0.01)，sbf 17.5、35和70 mg/kg均能翻转这个降低;0.065 mg/kg倍美力也能表现出类似的改善作用，见图1。
2.2 sbf对去卵巢大鼠体重的影响
所有大鼠在手术前体重相近，手术后10个月，给药36 d，与假手术组相比，模型组的体态较胖，体重显著增加(p<0.01)，sbf 35、70 mg/kg和倍美力0.065 mg/kg均能不同程度地抑制大鼠体重的增加，体重增加率与模型组相比具有显著性差异(p<0.05，p<0.01)，见表2。
2.3 sbf对去卵巢大鼠器官指数的影响
卵巢摘除明显抑制大鼠输卵管和子宫的生长，大体观察发现，卵巢摘除大鼠输卵管比假手术组明显变细、子宫明显缩小;与假手术组大鼠相比，去卵巢大鼠输卵管子宫指数降低了384.45%(p<0.01)。而sbf能够明显改善卵巢摘除对输卵管子宫生长的影响，输卵管子宫指数比模型组分别增加了10.24%(p>0.05)、16.63%(p>0.05)和42.42%(p<0.05)，并呈剂量依赖性关系。倍美力也能改善去卵巢大鼠的输卵管子宫指数，比模型组增加67.78%(p<0.01)，其改善作用强于sbf，见表2。表1 sbf对去卵巢大鼠在morris水迷宫训练潜伏期的影响图1 sbf对去卵巢大鼠在morris水迷宫操作探索实验的影响 卵巢摘除使大鼠的脾脏明显萎缩，与假手术组相比，模型组的脾脏指数降低了20.51%(p<0.05)。17.5、35和70 mg/kg sbf能不同程度地减小卵巢摘除大鼠脾脏的萎缩，分别增加了11.23%(p>0.05)、17.50%(p>0.05)和22.40%(p<0.05)，并呈现剂量依赖性关系;倍美力0.065 mg/kg也能表现出一定的正向调节，脾脏指数增加了18.37%(p>0.05)，但未见有显著性差异，见表2。
卵巢摘除使大鼠的胸腺也明显缩小，与假手术相比，模型组胸腺指数降低了133.38%(p<0.01);17.5、35和70 mg/kg sbf能不同程度地降低卵巢摘除大鼠胸腺的萎缩，使胸腺指数分别增加了10.76%(p>0.05)、27.16%(p>0.05)和43.78%(p<0.05)，并呈剂量依赖性关系。倍美力0.065 mg/kg也能表现出类似的改善作用，使胸腺指数增加了23.79%(p>0.05)，但未表现出统计学意义，见表2。
2.4 sbf对去卵巢大鼠血清e2含量的影响
术后10个月，给药36 d，去卵巢大鼠血清中e2含量与假手术组相比显著降低(p<0.01)。17.5、35和70 mg/kg/d sbf能不同程度的提高去卵巢大鼠血清中e2的含量，并呈现剂量依赖性关系，0.065 mg/kg倍美力能够显著提高血清中e2的浓度，与模型组相比有统计学意义(p<0.01)，且作用高于sbf，见表2。表2 sbf对去卵巢大鼠血清e2、体重、卵巢/子宫指数、脾脏和胸腺指数的影响
3 讨 论
本实验发现大鼠去卵巢11个月，显著降低大鼠学习记忆能力。在水迷宫学习能力测试中，到达平台的潜伏期明显增加;在探索实验中穿越平台的次数和在平台放置区的游泳时间明显减少，这些改变与文献报道一致〔1～4〕。一系列研究发现ad的发生与雌激素缺乏密切相关，且发现雌激素的影响是多途径多环节的〔5〕。临床上应用雌激素替代疗法降低或延缓ad的发生〔6〕，本研究利用雌激素倍美力灌胃给去卵巢大鼠，发现倍美力显著改善去卵巢大鼠学习、记忆能力障碍，提示认知水平的降低与雌激素水平下降有关。然而雌激素替代疗法长期应用会引起譬如子宫癌、乳腺癌等诸多不良反应，因此，雌激素替代疗法很难作为延缓中老年妇女衰老和ad的发生的方法应用于临床。本实验表明sbf具有改善衰老大鼠记忆降低的作用，且该作用可能与黄酮类化合物对神经细胞保护作用有关。
研究表明神经内分泌功能失调伴随着器官与功能的衰退〔7〕。性腺的萎缩和生殖功能的减退是老年人内分泌功能异常改变的重要标志。且有研究发现ad的发生亦可能与雌激素介导的神经内分泌免疫调节网络的平衡失调密切相关〔8〕。妇女绝经后，由于卵巢萎缩，雌激素分泌水平显著下降。雌激素参与和调节体内一系列代谢，能够抑制脂蛋白脂肪酶的活性，降低脂肪合成;诱导激素敏感性脂肪酶的活性或通过增加肾上腺素的脂解作用来间接地增加脂肪的分解;促进脂肪酸的β氧化，从而降低脂肪的沉积〔9〕。另外，雌激素缺乏对垂体的抑制作用减弱，导致下丘脑和垂体功能亢进及植物神经功能紊乱，致使食欲亢进、进食增多而引起肥胖。同时脂代谢伴随着大量自由基生成，雌激素能够直接的清除自由基，并能作用于血管壁，使血管壁释放抗氧化活性物质间接清除氧自由基和降低脂质过氧化。因此围绝经期的妇女，由于体内雌激素水平下降，易出现肥胖和体内氧化水平增加。国内有研究报道，在雌性动物衰老的过程中，与生殖内分泌免疫系统相关的器官重量也逐渐减轻〔10〕。体内卵巢激素水平的下降，对输卵管/子宫的影响较为明显〔11〕，补充外源性雌激素可显著增加输卵管/子宫重量。本研究发现，与假手术组相比，卵巢摘除10个月大鼠，体重增加率明显升高，胸腺，脾脏和输卵管/子宫显著萎缩，血清中e2水平明显降低;而sbf使去卵巢大鼠体重增加率明显降低，胸腺，脾脏和输卵管/子宫指数以及血清中e2水平明显增加，该作用呈剂量依赖性关系。sbf对去卵巢大鼠上述指标的改善作用可能源于增加机体雌激素水平，调节脂代谢和神经内分泌免疫功能。而雌激素倍美力也表现出同样的作用，且作用高于sbf。
shiizaki等〔12〕通过具有高敏感的生化实验发现治疗绝经后紊乱的许多中草药中含有植物雌激素，只是大多数中草药的雌激素活性是很微弱的。研究发现，许多黄酮类化合物因分子结构与雌激素相似，通过与雌激素受体结合表现出雌激素样生物活性，缓解与激素相关疾病，可促进和诱导淋巴细胞的转化与增殖，维持自身免疫稳定性和巨噬细胞的吞噬能力，增加体内免疫功能。与药物雌激素相比，植物雌激素可以用来保护血管弹性，降低血管疾病的危险性，减少癌症的发生。据此推测sbf可能具有弱雌激素活性，可通过强化低雌激水平所致的正反馈调节作用而促进下丘脑和垂体分泌促性腺激素，以有效调节内分泌异常和增强机体免疫力。
本研究结果表明，sbf对去卵巢大鼠学习记忆障碍的改善可能源于对神经内分泌老化的有效调节。长期服用sbf有助于缓解中老年妇女由于雌激素缺乏而引起的ad，为sbf开发成为新的抗痴呆药物提供了可靠的实验依据。
【参考文献】
1 陈 霁,贡岳松,张均田.17β雌二醇和人参总皂苷对去卵巢大鼠记忆障碍的改善作用〔j〕.中国药学杂志，2001;36(8)：5226.
2 leuner b，mendolialoffredo s，shors tj.high levels of estrogen enhance associative memory formation in ovariectomized females〔j〕. psychoneuroendocrinology，2004;29(7)：88390.
3 常燕琴，朱家恩，白延斌，等.补骨脂对去卵巢大鼠体重及脂代谢的影响〔j〕.时珍国医国药，2007;18(12)：28801.
4 杨 茗，季 晖，戴胜军，等.菝葜皂苷元对去卵巢大鼠内分泌及抗氧化功能的影响〔j〕.中草药，2007;38(2)：2457.
5 mattson mp，guo q，robinson n.estrogens stabilize mitochondrial function and protect neural cells against the proapoptotic action of mutant presenilin1〔j〕.neuroreport，1997;8(17)：381721.
6 santiago p，isabel c，carman m.the central nervous system and hr〔j〕.int j fertil，2000;45(1):1321.
7 谢启文.现代神经内分泌学〔m〕.上海：上海医科大学出版社，2000：38498.
8 miller db，ali sf，o′callaghan jp,et al.the impact of gender and estrogen on striatal dopaminergic neurotoxicity〔j〕.ann n y acad sci，1998;844:15365.
9 misso ml，murata y，boon wc,et al.cellular and molecular characterization of the adipose phenotype of the aromatasedeficient mouse〔j〕. endocrinology，2003;144(4)：147480.
10 张 涛，叶少剑，陈晓青，等.中药复方对去卵巢大鼠内分泌免疫功能的调节〔j〕.时珍国医国药，2002;13(8):44950.
11 phamdang ml，clement r，mercier i,et al.comparative effects of tamoxifen and angiotensin ⅱ type1 receptor antagonist therapy on the hemodynamic profile of the ovariectomized female rat〔j〕.can j physiol pharmacol，2003;81(9)：9159.
12 shiizaki k，goto k，ishige a,et al.bioassay of phytoestrogen in herbal medicine used for postmenopausal disorder using transformed mcf7 cells〔j〕.phytother res，1999;13(6)：498503.
