【关键词】 肝纤维化；荔枝核总黄酮；转化生长因子β1；结缔组织生长因子
【摘要】 目的 研究荔枝核总黄酮（tfl）在胆总管结扎诱导的大鼠肝纤维化模型中的治疗效果及其作用机制。方法 雄性sd大鼠100只，随机分为假手术组、模型组、水飞蓟素（sil）组、tfl大剂量组（200 mg·kg-1·d-1）和tfl小剂量组（100 mg·kg-1·d-1）。采用胆总管结扎制备肝纤维化大鼠模型。4周后处死大鼠，放射免疫法（ria）检测大鼠血清中透明质酸(ha)、层粘蛋白(ln)及ⅲ型前胶原(pcⅲ)的水平；he染色和masson染色观察大鼠肝组织病理改变；采用酶联免疫吸附法（elisa）检测大鼠血清中结缔组织生长因子(ctgf)的水平；免疫组化检测ctgf 及转化生长因子β1(tgfβ1)在肝组织内的表达。结果 与模型组大鼠比较, sil和tfl大剂量治疗后大鼠血清中ha、ln和pcⅲ的水平显著降低（p< 0.01）；肝组织内纤维化程度降低,肝小叶结构趋于正常；tfl大剂量给药组和sil组血清ctgf水平均显著低于模型组（p<0.05）；2组大鼠肝组织ctgf及tgfβ1表达明显降低(p < 0.05)。结论 tfl能有效地减轻胆总管结扎诱导的肝纤维化大鼠的肝损伤及纤维化程度,其机制可能与抑制肝内ctgf 和tgfβ1 表达有关。Www.133229.coM
【关键词】 肝纤维化；荔枝核总黄酮；转化生长因子β1；结缔组织生长因子
effect of total flavone of litchi chinensis sonn on the expression of tgfβ1 and ctgf of hepatic fibrosis in rats
zhao yongzhong,xiao xuhua,qi zhiping,et al.
department of gastroenterology,affiliated hospital of guilin medical college, guangxi,guilin 541001, china
【abstract】 objective to investigate the effect and action mechanism of total flavone of litchi chinensis sonn（tfl）on rat model of liver fibrosis induced by bile duct occlusion.methods one hundred male sd rats were randomly divided into five groups: sham operation group, model group, silymarin (sil) treatment group (50mg·kg-1·d-1), highdose tfl group(200mg·kg-1·d-1),lowdose tfl group(100mg·kg-1·d-1) group. bile duct occlusive fibrosis model was prepared by bile duct ligation, whereas the sham operation group was used as controls. after 4week treatment, the rats were killed.the serum levels of hyaluronic acid (ha), laminin(ln), ⅲ procollagen(pcⅲ) were determined by ria, and the liver histopathological changes were observed by light microscopy after he and masson staining. the serum levels of connective tissue growth factor (ctgf) were detected by elisa.the expression of ctgf and transforming growth factorβ1 (tgfβ1) in liver tissue was observed by immunohistochemical staining. results as compared with model group, the serum levels of ha、ln and pcⅲ were significantly decreased (p< 0. 01),and the liver fibrosis was significantly improved in the rats treated by highdose tfl and sil; the serum levels of ctgf were obviously decreased (p<0.05 ) and the expressions of tgfβ1 and ctgf were decreased in the liver of the rats which were given highdose tfl
(p<0.05). conclusion tfl may play a protective role in liver injury, which can inhibit liver fibrosis induced by bile duct ligation. the mechanism may be attributed to its effect of downregulating ctgf and tgfβ1.
【key words】 epatic fibrosis; total flavone of litchi chinensis sonn; transforming growth factor beta 1; connective tissue growth factor
荔枝核又名荔仁或荔核，是无患子科植物荔枝的干燥成熟种子。荔枝核总黄酮（tfl）是荔枝核中具有药理活性的主要成分之一，其作用涵盖了清除自由基、抗氧化、抗病毒、抗炎保肝等多个方面［1-4］。新近研究显示tfl治疗可以减轻病毒性肝炎时肝组织炎症和肝纤维化程度［5］。本研究通过观察tfl对胆管阻塞性肝纤维化大鼠模型治疗后血清及组织学变化及对结缔组织生长因子（ctgf）及转化生长因子β1（tgfβ1）表达的影响以探讨tfl的抗纤维化作用及可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
雄性sd大鼠100只, 清洁级, 体重(250 ±20)g,桂林医学院实验动物中心提供。 ctgf elisa 酶联免疫试剂盒购自尚柏生物医学技术有限公司。大鼠ctgf多克隆抗体为美国santa cruz公司产品。tgfβ1多克隆抗体为武汉博士德公司产品。即用型sp试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。大鼠肝纤维化诊断试剂盒，包括透明质酸(ha)、层粘连蛋白(ln)以及ⅲ型前胶原(pcⅲ)放射免疫分析测定盒，均购自上海海研医学生物技术有限公司。
1.2 药物
tfl：原材料购自桂林市七星公园药材市场，由桂林工学院有机化学教研室加工提取，经检测tfl含量为852 g/kg，将其粉末状物用蒸馏水稀释为40 g/l和20 g/l两种溶液；水飞蓟素（sil）胶囊：购自德国马博士大药厂，每颗胶囊含sil 140 mg。将胶囊内粉末状药品用蒸馏水稀释为10 mg/ml。
1.3 模型制作与分组
参见文献［5］制备胆管阻塞性肝纤维化大鼠模型，100只大鼠随机分为5组，每组20只。（1）模型组：打开腹腔，游离胆总管并双重结扎后于节间切断。制备模型后第2天用0.9%氯化钠溶液灌胃，每日1次，每次5 ml/kg。（2）假手术组：打开腹腔并游离胆总管，不结扎不切断胆总管。术后第2天用0.9%氯化钠溶液灌胃，剂量用法同上。（3）sil组：制备模型后第2天起用sil灌胃（50 mg·kg-1·d-1［6］），每日1次。（4）tfl大剂量组：制备模型后第2天起用tfl灌胃（200 mg·kg-1·d-1），每日1次。（5）tfl小剂量组：tfl（100 mg·kg-1·d-1），用法同上。5组大鼠4周后抽取下腔静脉血, 取大鼠肝脏组织, 置于甲醛中固定制备石蜡标本。
1.4 观察指标
1.4.1 放射免疫分析（ria）检测血清ha、ln、pcⅲ含量。
1.4.2 elisa法检测血清ctgf水平。
1.4.3 肝脏病理形态学观察：5组标本分别作he和masson染色观察组织学改变和胶原纤维分布。肝纤维化病理学分级参照文献［7］标准判定。
1.4.4 免疫组织化学检测：以免疫组化sp法检测tgfβ1和ctgf的表达。以细胞膜或细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片在高倍镜(×400)下随机选择5个视野,采用imageproplus6.0（ipp6.0）软件进行图像分析,以iod(积分光密度)的sum值作为蛋白的表达强度。
1.5 统计学分析
应用spss 11.5统计软件，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，多组间均数两两比较应用snk法（q检验）。纤维化积分采用秩和检验，tgfβ1与ctgf相关关系用直线相关分析，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
实验过程中共有12只大鼠死亡，所有死亡动物均不进入数据统计。
2.2 肝病理学检查结果
与假手术组比较，模型组可见弥漫增生的胆小管，大量的胶原沉积汇管区周围，正常肝小叶结构少见，病理分期以ⅲ～ⅳ期为主；tfl大剂量给药组和sil组的肝组织he染色和masson染色均显示肝纤维化程度明显改善，有少量胆小管增生，无胶原沉积，肝小叶结构趋于正常，病理分期以ⅰ～ⅱ期为主。5组肝纤维化分期结果详见表1。表1 5组大鼠肝纤维化分期结果（略）注: 与模型组比较，*p<0.01
2.3 5组大鼠血清ha、ln、pcⅲ的变化及血清ctgf水平
tfl大剂量组、假手术组和sil组血清ha、ln、pcⅲ均显著低于tfl小剂量组和模型组（p<0.01），且tfl大剂量组和sil组之间血清ha、ln、pcⅲ水平差异无统计学意义（p>0.05）。tfl大剂量组、假手术组和sil组血清ctgf与模型组比较差异有统计学意义（p<0.05），tfl大剂量组和sil组之间血清ctgf表达水平差异无统计学意义（p>0.05）。见表2。表2 5组大鼠血清ctgf、ha、ln、pcⅲ变化 较（略）注：与模型组比较,*p<0.05；与模型组、tfl小剂量组比较,#p<0.01
2.4 ctgf、tgfβ1 在各组大鼠肝组织中的表达
假手术组: ctgf、tgfβ1 在正常肝细胞内几乎无表达,汇管区基质及间质细胞胞浆内有少量ctgf 表达,tgfβ1在上述部位的表达较ctgf稍强。模型组:肝内tgfβ1 、ctgf 表达明显增强,阳性细胞数目明显增多,主要见于小叶周围扩大的纤维组织内的成纤维细胞、窦周细胞、炎性细胞等间质细胞内,阳性物质主要集中在胞浆,胞膜上也有少量表达。tfl大剂量组和sil治疗组: ctgf、tgfβ1 在肝组织内的表达量减少,接近正常肝组织水平,阳性程度弱于模型组。ctgf、tgfβ1 在不同实验组中相对含量见表3。3组大鼠肝组织ctgf、tgfβ1 的表达分别见图1、2。表3 5组大鼠肝组织ctgf、tgfβ1免疫组化半定量结果（略）注：与模型组比较,*p<0.05
2.5 ctgf 与tgfβ1 的相关性分析
免疫组化检测二者呈正相关（r=0.628，p< 0.05）。
3 讨论
肝纤维化是各种病因引起的慢性肝病共有的病理改变,是发展到肝硬化的中间环节,其核心是肝脏中细胞外基质（ecm)合成与降解失衡，导致ecm在肝脏内过度沉积［8］。因此，阻止肝纤维化的发展具有重要的临床意义。
肝纤维化受到多种细胞因子的调节,例如tgfβ1、il1等,其中tgfβ1最为重要,是目前已知的最重要的致肝纤维化的细胞因子之一［9，10］。其突出作用是增加合成的同时减少其蛋白降解,改变ecm合成和降解的正常平衡。ctgf被认为是tgfβ1发挥生物学效应的下游因子, 在肝纤维化过程中,ctgf由tgfβ1及其受体诱导激活的肝星状细胞（hsc），胆管上皮细胞及损伤肝细胞合成和分泌,介导tgfβ1促进ecm的合成、抑制ecm分解的作用,从而导致ecm的过度沉积［11,12］。在纤维化病变中,ctgf和tgfβ1大多表现为协同表达增加,以增加促纤维化效应［12］。我们的研究结果显示,同假手术组相比,模型组在出现组织学异常的同时伴有tgfβ1和ctgf表达增高,这进一步支持了二者在肝纤维化发病机制中的作用。而且各组ctgf 与tgfβ1 在肝内表达的增强程度呈正相关,并与病理上肝纤维化程度平行,证实这两种细胞因子在肝纤维化发生及进展中有协同作用。
tfl为荔枝核中提取的一种生物类黄酮，是荔枝核中具有药理活性的主要成分之一。新近研究表明荔枝核高、低剂量组均能明显降低cci 4 急性肝损伤模型小鼠血清丙二醛含量，而血清的超氧化物歧化酶活性升高，提示荔枝核提取物具有明显的抗氧化和抗炎保肝作用［4］。有资料证实经荔枝核制剂治疗后，慢性乙型肝炎患者肝纤维化不同程度改善，血清肝纤维化指标ha、ln大幅降低，说明荔枝核制剂可能具有良好的抗肝纤维化作用［13］。
本实验结果显示，tfl大剂量组和sil组肝脏组织学病变比模型组明显改善，肝组织的胶原含量降低。同时，血清纤维化指标也明显下降。这表明，tfl具有抗纤维化作用，且作用与sil相当。但在tfl小剂量治疗组未见大鼠肝组织病变有明显改善，表明的抗纤维化作用需达一定的药物浓度。同时发现，tfl大剂量组肝组织tgfβ1和ctgf的表达较模型组均有明显下降，同时血清ctgf水平降低。提示tfl可能通过下调tgfβ1和ctgf的表达进而减少ecm的合成、促进ecm分解，最终达到抗纤维化的作用。
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