【摘要】 目的：观察松弛素样因子(rlf)基因在大鼠卵巢动情周期和排卵过程中的表达，探讨rlf在大鼠卵巢功能中的作用。方法：采用rtpcr方法。结果：成年大鼠整个动情周期卵巢中都有rlfmrna的表达，在动情前期、动情期卵巢表达较强 ,动情间期和动情后期卵巢较弱。pmsg hcg处理的未成年大鼠于排卵时rlfmrna的表达降低。结论：rlf与卵泡发育、排卵、黄体形成和退化密切相关。
【关键词】 rlf；大鼠；动情周期；排卵
作者简介：张承玉，女，讲师，硕士，从事生理学教学与生殖内分泌研究工作，email：zcy6668815yahoo.com.cn 松弛素样因子（relaxinlike factor,rlf）是新近发现的insulinlike factor3（insl3）基因的产物，属于胰岛素—胰岛素样生长因子—松弛素（insulin–igf–relaxin）家族[1]。因rlf主要表达于两性生殖腺，所以已经逐渐成为生殖生理领域研究的又一热点。目前国外对rlf的研究主要集中在雄性动物，且对啮齿动物研究较少，国内鲜有rlf的实验性报道。本实验旨在观察rlfmrna在大鼠动情周期和外源性激素诱导的模型大鼠排卵过程中表达的动态变化，以探讨rlf在大鼠卵巢功能中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物以及主要试剂：健康雌性wistar大鼠由哈尔滨医科大学第二临床医学院实验动物中心提供，自然光照，水食任取。wWw.133229.cOM孕马血清（pmsg）（天津实验动物中心产品），注射用绒促性素（hcg）（宁波市激素制品厂产品），trizol rna提取试剂（gibcol brl产品），引物（上海捷倍思公司产品），takara逆转录试剂盒、tag酶、dntp、pcr buffer、marker（宝生物工程有限公司产品）。
1.2动情周期以及排卵：健康成年雌性wistar大鼠250±10 g，经阴道涂片确定动情周期：动情前期，动情期，动情后期，动情间期，每一时期取材3只，断头处死大鼠，取卵巢，经197℃速冻，放入冻存管于-70℃保存，用于总rna提取。排卵：25日龄健康雌性wistar大鼠（60g～70g），颈部皮下注射pmsg50iu/只，促进卵泡发育，pmsg48 h后，颈部皮下注射hcg25iu/只，分别于hcg0h、4h、8h、12h、24h、48h取卵巢，每组取材3只，处理同前。
1.3 rtpcr
1.3.1rna的提取以及逆转录：参照文献方法[2]，应用gibco brl公司trizol rna提取试剂，分别提取样品的总rna。通过紫外分光光度仪测定提取的rna样品在波长260nm和280nm处的吸光度(a)，使二者的比值(a260/a280)保持在1.80～1.985之间，符合蛋白污染容许容量(1.8～2.0)，根据a值计算出总rna浓度。用takara的逆转录试剂盒将rna逆转录为cdna；扩增的引物序列：rlf：caacgacatctcctgcac/ttgacacacaccacctgag；gapdh：tccaccaccctgttgctgta/accacagtccatgccatcac。
1.3.2pcr以及结果分析：总反应体系均为20ul；pcr反应的条件：rlf：94℃4min；94 ℃ 30 s；59.5 ℃30 s；72 ℃30 s 38个循环72 ℃5 min。gapdh做内参照[3]。pcr扩增产物用含溴化乙锭（eb）的1.5%琼脂糖凝胶（1(tae）电泳检测。凝胶图像分析系统扫描各电泳带的灰度值，计算rlf与gapdh的灰度值的比值，即为样品rlfmrna的表达水平。
2 结果
2.1 动情周期大鼠卵巢rlfmrna的表达
rtpcr结果显示：在整个动情周期大鼠卵巢都有rlfmrna的表达，且呈周期性变化：于动情前期和动情期表达增强；动情后期和动情间期表达减弱（图1）。
2.2 大鼠卵巢rlfmrna的表达与排卵的关系
rtpcr结果显示：hcg刺激0 h、4 h、8 h时，大鼠卵巢rlfmrna水平逐渐增高，呈时间依从性；而hcg刺激12 h时大鼠卵巢rlfmrna水平降低；hcg刺激24 h、48 h时，大鼠卵巢rlfmrna表达又开始增强（图2）。
3 讨论
卵巢是个复杂的内分泌器官，卵泡的发育、成熟、排卵、黄体的形成、退化，不仅受下丘脑—垂体—卵巢轴的调节，也和卵巢内一些局部调控因子的调节有关。rlf是新近发现的主要由性腺产生的调控因子，其在哺乳动物生殖中的作用越来越受到关注。
在雄性，rlf主要是由睾丸 leydig细胞表达， 在其它组织图2 用rtpcr方法检测rlfmrna在假孕大鼠卵巢中表达的相对强度
如附睾，前列腺，丘脑下部也有rlf的转录。在雌性，rlf显示有更广泛的分布。卵巢是 rlf的主要来源，此外在绒猴的子宫基质，不同物种的胎盘，甲状腺和乳腺等组织都有rlf的表达[4]。本实验用rtpcr方法观察到在整个动情周期中大鼠卵巢均有rlfmrna的表达，且呈周期性变化。于动情前期（此期相当于人类月经周期的卵泡期，卵泡加速生长）和动情期（此期相当于排卵期，卵泡发育成熟并排卵）表达增强，动情后期（此期相当于黄体期，黄体生成并逐渐成熟）和动情间期（此期相当于月经期，黄体退化并向卵泡期转换）表达减弱，此结果显示大鼠卵巢rlf的表达可能与卵泡发育成熟，早期黄体生成有关，rlf减少可能参与黄体退化过程。已有报道，敲除rlf基因将导致小鼠卵泡闭锁，动情周期也从正常的67天延长为14～20天[5]，并且发现其卵泡及黄体凋亡率更高，还有研究发现敲除该基因的雌性小鼠不孕，主要原因是影响了卵泡的发育和动情周期的缘故[6]。以往的研究和我们的实验结果相符。需要指出的是本实验结果与ross bathgate等[7]报道的牛动情周期中卵巢rlf的表达趋势正好相反，提示rlf在动情周期卵巢的表达存在种属差异。
为研究rlfmrna与排卵的关系，我们对未成年大鼠用pmsg刺激48 h，分别于hcg刺激0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h取卵巢，检测rlfmrna的表达水平。rtpcr结果显示卵泡进一步发育即排卵前期（hcg刺激0 h、4 h、8 h）卵巢rlfmrna水平逐渐增高，呈时间依从性排卵后即早期黄体形成时（hcg刺激24 h、48 h）rlfmrna表达又开始增强，与上述动情周期结果一致。有实验显示rlf的表达与优势卵泡的选择有关[8]。我们前期的工作已证明rlfmrna在大鼠卵巢颗粒细胞和黄体细胞都有表达，也提示rlf可能参与雌性大鼠卵泡的发育，并与黄体功能的维持相关[9]。我们的实验结果表明排卵时（即hcg刺激12 h时）rlfmrna水平降低，提示卵巢rlfmrna水平的降低可能参与诱发排卵。但rlfmrna与排卵的确切关系，还需要更多的实验加以证明。
对rlf的研究才刚刚起步，虽然rlf在卵巢中确切的作用还不是很清楚，但大量的研究说明rlf作为性腺产生的调控因子参与很多物种的卵泡发育、排卵、黄体的形成和退化过程。有关其作用的分子机制尚有待于进一步研究。
【参考文献】
1 adham im, burkhardt e, banahmed m, et al. cloning of a cdna for a novel insulinlike peptide of the testicular leydig cells[j]. j biol chem，1993, 268(35): 26668-26672.
2 yang yunxia, feng yun, wang boyao，wu qi.pcrbased sitespecific mutagensis of fall39 and its biologic activities[j].acta pharmacological sinica.2004；25(2)：239-242.
3 刘辽，郝杰，杨云霞.黄酮类化合物柚皮苷抑制hacat细胞株rantes产生的研究[j]．四川生理科学杂志，2008, 30(1): 8-10.
4 ivell r, hartung s, anandivell r,et al. insulinlike factor 3: where are we now[j].ann n y acad sci,2005, 1041(2): 486-496.
5 nef s, parada lf. cryptorchidism in mice mutant for insl3[j]. nat genet，1999，22(2): 295-299.
6 zimmermann s, steding g, emmen jm,et al.targeted disruption of the insl3 gene causes bilateral cryptorchidism[j]. mol endocrinol , 1999,13(3): 681-691.
7 bathgate r, moniac n, bartlick b, et al.expression and regulation of relaxinlike factor gene transcripts in the bovine ovary: differentiationdependent expression in theca cell cultures[j]. biol reprod, 1999,61(4):1090-1098.
8 irvingrodgers hf, bathgate rad, ivell r, et al. dynamic changes in the expression of relaxinlike factor (insl3), cholesterol sidechain cleavage cytochrome p450, and 3 hydroxysteroid dehydrogenase in bovine ovarian follicles during growth and atresia[j]. biol reprod，2002，66(4): 934-943.
