【关键词】 人参皂苷；帕金森病；神经干细胞；室管膜下区
【摘要】 目的：探讨人参皂苷rg1促进帕金森病模型小鼠原位神经干细胞增殖分化的作用。方法:c57bl/6小鼠随机分成正常组、模型组和人参皂苷rg1治疗组。采用mptp腹腔注射建立帕金森病小鼠模型，利用免疫组化单标和双标技术观察人参皂苷rg1对小鼠侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖分化的影响。结果：人参皂苷rg1治疗5 d，侧脑室室管膜下区的5溴脱氧尿苷(brdu)、神经上皮干细胞蛋白(nestin)阳性细胞较模型组明显增多，并可见大量从背外侧角沿胼胝体排列的brdu、nestin阳性细胞；人参皂苷rg1治疗20 d，brdu/nestin双标细胞的数量较模型组明显增多。结论：人参皂苷rg1可促进帕金森病模型小鼠脑内神经干细胞的增殖和迁移。
【关键词】 人参皂苷；帕金森病；神经干细胞；室管膜下区
帕金森病(parkinson’s disease,pd)是一种常见的中老年神经系统变性疾病，其标志性病理变化为中脑黑质多巴胺能神经元的缺失[1]。近年来随着神经干细胞(neural stem cells,nscs)研究的深入，利用内源性神经干细胞定向增殖、分化为多巴胺能神经元已成为治疗帕金森病研究的热点。Www.133229.coM研究发现人参皂苷rg1(ginsenoside rg1,rg1)对mptp诱导pd鼠黑质神经元凋亡有阻断作用，对帕金森病小鼠sn da能神经元具有明显的保护作用[2]；在体内人参皂苷rg1能否刺激帕金森病模型动物脑原位nscs的增殖及分化鲜见报道。本研究采用1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶(1ethyl,4phenyl1,2,3,6 tetrahydropyridine,mptp)制作小鼠帕金森病模型，利用免疫组化和免疫双标技术观察脑内室管膜下区(subependymal ventricular zone,svz)nscs的增殖变化以及人参皂苷rg1的干预作用，为中药防治pd提供更多的实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 选用健康雄性c57bl/6小鼠，体重(17±5)g，购自北京维通利华公司动物实验中心。许可证号：sxk京(2004-2006)。
1.1.2 实验试剂 mptp购自美国sigma公司，批号：095k1166；人参皂苷rg1(批号为07032-9812，纯度＞98 %)购自昆明制药厂；兔抗小鼠神经上皮干细胞蛋白(neuroepithelial stem protin,nestin)抗体、5溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,brdu)抗体和蛋白酶k均购自武汉博士德生物工程有限公司；免疫组化abc试剂盒、碱磷酶标记链亲合素、碱磷酶底物nbt/bcip显色浓缩液、dab试剂盒、磷酸缓冲液(pbs)和枸橼酸缓冲液均购自北京中杉生物技术有限公司。
1.1.3 实验仪器 ae160电子天平购自瑞士mettler公司；fs/fas5030石蜡切片机购自德国letiz公司；pw/dg20007恒温培养干燥箱购自中国重庆实验设备厂；olympus bx61显微镜购自日本olympus株式会社。
1.2 实验方法
1.2.1 pd小鼠模型的建立 每天腹腔注射生理盐水配制的0.3%mptp 30 mg·kg-1，连续5 d。
1.2.2 分组及处理动物随机分为正常组6只，不作任何处理；模型组12只，造模后不作任何处理；人参皂苷rg1治疗组12只，从造模第1天开始每天腹腔注射人参皂苷rg1注射液70 mg·kg-1。各组动物的存活期分别是开始造模后的5 d和20 d。
1.2.3 取材及处理用10%水合氯醛按0.04 mg·kg-1体重对小鼠腹腔麻醉，经左心室升主动脉灌流固定后，取脑，后固定6 h，脑经脱水、透明、石蜡包埋，做冠状切片，片厚6 μm，常温保存备用。
1.2.4 免疫组化法(abc法)常规组织切片脱蜡至水后加新配制1% h2o2甲醇溶液处理20 min；0.01 m枸橼酸缓冲液(ph 6.0)92℃热修复10 min，自然冷却至室温；胃蛋白酶k消化(37℃)20 min；以上各步之间都采用0.01 m pbs洗涤5 min×3次。再滴加正常山羊血清工作液，37℃，20 min；吸干血清，分别加入一抗小鼠抗pcna抗体(1∶50)，兔抗小鼠nestin抗体(1∶200)，4℃，48 h～72 h；滴加二抗37℃，2 h；滴加三抗37℃，2 h；滴加显色剂dab底物溶液显色，显色时间10 min～30min；在滴加一抗至三抗后都采用0.01 m pbs洗涤5min×3次。切片双蒸水冲洗，酒精梯度脱水、二甲苯透明、光学树脂封片；阴性对照切片不加一抗，其他处理同上。光镜观察切片，细胞内棕色颗粒为阳性颗粒。
1.2.5 brdu/nestin免疫双标方法首先按常规免疫组织化学abc法显示核抗体brdu，显色液为碱性磷酸酶nbt/bcip显色浓缩液，阳性胞核为蓝色；再按abc法显示nestin的表达，底物显色剂为dab，阳性胞浆为棕色颗粒。光镜观察切片，胞核为蓝色颗粒和胞浆为棕色颗粒的细胞为阳性双标细胞。
1.2.6 图像分析 每个存活期每只动物选视交叉前冠状切片，采用olympus bx61显微镜1倍物镜采集图像，分别对前侧脑室下区brdu和nestin阳性细胞以及brdu+/nestin+双标细胞计数。
1.3 统计学处理 实验数据应用spss统计软件处理，结果采用(x±s)表示，多组间比较采用方差分析。
2 结果
2.1 人参皂苷rg1对pd小鼠前侧脑室下区brdu阳性细胞表达的影响 模型组和治疗组20 d小鼠侧脑室壁周围brdu阳性细胞均有不同程度的增多，但细胞计数三组间无统计学意义(p＞0.05)(表1)。
正常组小鼠brdu阳性细胞染色较淡，数量较少，主要表达在前脑室的背外侧角、外侧壁的中部、内侧壁和外侧壁交界处的室管膜和室管膜下层。模型组5 d小鼠，brdu阳性细胞在上述部位表达增多；治疗组5 d小鼠阳性细胞比模型组增多明显，还可以观察到从背外侧角向外侧沿胼胝体下方排列的brdu阳性细胞。表1 各组侧脑室部位brdu阳性细胞表达的比较
2.2 参皂苷rg1对pd小鼠前脑室下区nestin阳性细胞表达的影响 模型组和治疗组20 d小鼠前侧脑室下区阳性细胞数较正常组有所减少。(表2)
正常组小鼠的前脑室背外侧角和腹侧下角周围有少量阳性细胞表达，染色较浅。模型组5 d小鼠在前脑室背外侧角和腹侧下角周围阳性细胞数明显增多，治疗组5 d nestin阳性细胞数量更多。 表2 各组侧脑室部位nestin阳性细胞数表达的比较
2.3 人参皂苷rg1对各组pd小鼠前脑室下区brdu+/nestin+免疫双标细胞表达的影响 模型组和治疗组细胞数较正常组增多，其中治疗组20 d比模型组增多的数量更明显。(表3)表3 各组前侧脑室brdu+/nestin+阳性细胞数表达的比较注:与正常组比较,**p＜0.01;与模型组比较,△p＜0.05。 正常组前脑室外侧壁、背外侧角和腹侧下角周围可见少量的brdu+/nestin+双标细胞，胞核呈淡红色，覆盖棕色颗粒后甚至接近棕黑色，胞浆染色呈棕色。
3 讨论
许多研究证明，哺乳动物包括人的中枢神经系统的侧脑室svz、海马齿状回等部位有nscs的存在，正常情况下处于静息状态，而在一定的条件下(如脑损伤)可以进行增殖、迁移并且分化成新的神经元和胶质细胞，这些新生成的原位神经元可替代丢失的神经细胞，并且发挥一定程度的代偿功能，参与脑损伤的修复[3-6]。
brdu为胸腺嘧啶的衍生物，活体注射或加入细胞培养液中，而后利用抗brdu单克隆抗体，显示增殖细胞，可作为反映细胞增殖活性的指标确切可靠[7]。nestin是未分化神经干细胞的抗原标志，目前被广泛作为鉴定神经干细胞的一个标记物。我们实验发现mptp腹腔注射成功制作pd小鼠模型后5d，可以激活pd小鼠自身前脑室的svz出现大量brdu、nestin以及brdu/nestin阳性的细胞。提示黑质损伤本身的确可以激活自体svz的细胞增殖，且增殖的大量细胞属nscs。但细胞的增殖程度与前脑室下区具体部位和损伤的时间关系密切，其中前脑室的背外侧角、外侧壁中部、腹侧下角增殖最活跃。虽然在损伤晚期侧脑室下区brdu阳性细胞、nestin阳性的数量较早期少，我们认为这可能与细胞增殖后的迁移有关。有学者发现svz的增殖细胞可沿胼胝体迁移至脑的其他部位[8]，我们也观察到了沿胼胝体方向排列的brdu、nestin以及brdu/nestin阳性的细胞，这些细胞可能是从svz增殖的nscs沿胼胝体迁移所致。
人参是我国传统名贵中药，具有广泛的药理作用和医疗用途。人参皂苷是人参的主要有效成分之一，药理学研究表明，rg1具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增强记忆力等作用，人参皂苷rg1对减少神经细胞损伤、促进脑功能恢复等方面也具有很好的作用[2]。近年来发现人参皂苷rg1预处理能提高黑质区域谷胱甘肽(gsh)的浓度及降低超氧化物歧化酶(sod活力，相应地减少pd鼠黑质致密带尼氏(nissl)阳性神经元和th阳性神经元的脱失现象，使活化型caspase 3表达阳性细胞减少，降低黑质神经元tunel染色的阳性率，对mptp诱导的小鼠黑质神经元凋亡有抗氧化保护作用，在一定程度上改善其行为障碍[9]。本研究发现人参皂苷rg1可以促进帕金森病小鼠原位前脑室室管膜下区神经干细胞的增殖和迁移，但这些增殖的神经干细胞能否向神经元分化，需要进一步深入的研究。
【参考文献】
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8 朱培纯,程 龙,司银楚,等.成年大鼠去皮层血管引起前脑室下区祖细胞增殖迁移并形成迁移路至损伤部位(二)来自背外侧脑室下区的祖细胞形成迁移路径胼胝体至损伤部位[j].神经解剖学杂志,2006,22(1):21-26.
9 周宜灿,陈晓春,朱元贵,等. 人参皂苷rg1可能通过抗氧化作用来保护帕金森病鼠黑质神经元[j].中国临床药理学与治疗学, 2003,8(3):273-277.
