【摘要】 建立了同时测定玩具中16种致癌和致敏染料（酸性红26、碱性红9、分散蓝1、酸性紫49、分散蓝3、溶剂黄1、分散蓝106、分散橙3、分散黄3、碱性紫1、碱性紫3、分散红1、溶剂黄3、分散蓝124、溶剂黄2、分散橙37）的超高效液相色谱-串联质谱分析方法。纺织品、皮革、纸张、木材、气球、造型黏土、贴纸、可接触液体等不同类型的玩具材料经超声提取后，以waters acquity uplc beh c18色谱柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm）分离后进行uplc/ms/ms多反应监测模式下的定性及定量分析。16种致癌和致敏染料的方法检出限为1.0~8.0 μg/kg； 在5~100 μg/kg范围内的低、中、高3个添加水平的平均回收率为81.3%～98.6%； 日内精密度均小于11%，日间精密度均小于14%。本方法准确、快速、灵敏度高，可用于玩具的实际检验工作。
【关键词】 超高效液相色谱-串联质谱; 玩具; 致癌染料; 致敏染料
simultaneous determination of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs in toys by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometryma qiang，bai hua*，wang chao，zhang qing，ma wei，zhou xin，dong yi-yang，wang bao-lin(chinese academy of inspection and quarantine，beijing 100123)(china agriculture university，beijing 100083)(dongning entry-exist inspection and quarantine bureau，dongning 157200)abstract a comprehensive analytical method based on ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry has been developed for the simultaneous determination of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs(acid red 26，basic red 9，disperse blue 1，acid violet 49，disperse blue 3，solvent yellow 1，dispersed blue 106，disperse orange 3，disperse yellow 3，basic violet 1，basic violet 3，disperse red 1，solvent yellow 3，disperse blue 124，solvent yellow 2 and disperse orange 37).various toy samples，including textile，leather，paper，wood，balloon，modeling clay，limitation tattoo and aqueous liquid，were extracted under ultrasonication.qualitative and quantitative analysis was carried out for the analyte under the mrm mode after the chromatographic separation on waters acquity uplc beh c18(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm) column.the limits of quantitation(loq) for the 16 dyestuffs were in the range of 1.0－8.0 μg/kg.the mean recoveries at the three spiked levels of 5－100 μg/kg were 81.3%－98.6%，with the intra-day precision less than 11% and the inter-day precision less than 14%.the method is accurate，rapid，sensitive，and adapt to the inspection of the 16 dyestuffs in toys.
keywords ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; toys; carcinogenic dyestuffs; allergenous dyestuffs
1 引言
我国是玩具产品的生产和消费大国，也是国际玩具产品的主要出口国。Www.133229.CoM玩具材料中含有的有毒有害化学物质可通过吞咽、舔食、皮肤接触、眼睛接触、吸入等方式进入体内，从而对儿童的健康安全造成严重危害， 玩具的安全性一直是社会关注的热点问题〖1〗。在染色过程中，染料分子通过吸附、扩散等多种化学或物理处理，从染液转移到被染物上而使之染色〖2〗。目前，已经证实存在多种可诱发人体癌变或引起人体皮肤、黏膜或呼吸道过敏的致癌和致敏染料〖3〗。鉴于致癌和致敏染料的严重危害，许多国家和世界权威组织相继颁布了严格的法规和技术标准进行限制。按照欧洲标准化委员会制订的en 71玩具安全系列标准对玩具化学性能的要求，酸性红26、碱性红9、分散蓝1、酸性紫49、分散蓝3、溶剂黄1、分散蓝106、分散橙3、分散黄3、碱性紫1、碱性紫3、分散红1、溶剂黄3、分散蓝124、溶剂黄2、分散橙37等16种致癌和致敏染料在玩具产品中不得检出〖4〗９噬闹繁曜糘eko-tex standard 1000〖5〗、欧盟2002/371/ec指令〖6〗、我国国家标准《生态纺织品技术要求》〖7〗、环境保护行业标准《环境标志产品技术要求 生态纺织品》〖8〗也分别将酸性红26等染料列为致癌和致敏染料。
目前，检测致癌和致敏染料的方法主要有高效液相色谱法〖9~12〗、离子对色谱法〖13〗、液相色谱-质谱法〖10，11〗和气相色谱-质谱法〖14〗等，但这些方法的灵敏度、选择性和分析通量还存在不足。超高效液相色谱技术与传统的液相色谱技术相比，大幅度改善了液相色谱的分析速度、分离效率、样品通量和灵敏度。超高效液相色谱与串联四极杆质谱联用，能够充分发挥超高效液相色谱的高速、高分离度与串联质谱的高选择性、高灵敏度的优势，采用多反应监测扫描方式可提供特征的母离子及其子离子信息，为目标化合物的定性与定量分析提供了可靠依据。本研究建立了同时测定玩具中16种致癌和致敏染料的超高效液相色谱-串联质谱分析方法，在9 min内完成了16种染料多组分的快速分离检测，为玩具样品的高通量快速检测提供了可靠的分析平台，可应用于玩具的实际检验工作和产品质量控制。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
acquity超高效液相色谱仪、quattro micro api三重四极杆质谱仪、masslynx数据处理系统（美国waters公司）；milli-q超纯水器（美国millipore公司）； kq-600b型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； ms2型漩涡振荡器（德国ika公司）； n-1000型旋转蒸发仪（日本eyela公司），配有bc-55型真空冷却系统（日本yamato公司）； acrodisc ghp双性滤膜（美国pall公司）； 乙腈、甲醇、无水乙醇（hplc级，美国fisher公司）； 乙酸铵（hplc级，美国acros公司）； 实验用水为经milli-q净化系统（0.22 μm过滤膜）过滤的去离子水； 氮气、氩气（>99.999%）； 其它试剂均为分析纯。
酸性红26（纯度84%）、碱性红9（纯度95%）、酸性紫49（纯度96%）、分散蓝3（纯度20%）、碱性紫1（纯度30%）、碱性紫3（纯度80%）、分散蓝124（纯度70%）和溶剂黄2（纯度95%）购自德国dr.ehrenstorfer公司；分散蓝1（纯度30%）、溶剂黄1（纯度99%）、分散蓝106（纯度95%）、分散黄3（纯度30%）、分散红1（纯度95%）、和分散橙37（纯度95%）购自美国sigma公司；分散橙3 (纯度95%)和溶剂黄3 (纯度99%)购自美国acros公司，16种染料的标准物质均为市场上最高纯度标准样品，它们的化学文摘号、染料索引号等参数见附表1（/table/090704.pdf）。
2.2 色谱条件
waters acquity uplc beh c18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（a）和5 mmol/l乙酸铵溶液，ph=5.0（b），梯度洗脱程序：0~2.0 min，28%~40% a；2.0~6.0 min，40% a；6.0~9.0 min，40%~95% a；9.0~9.5 min，95% a；9.5~10.0 min，95%~28% a。流速0.3 ml/min；柱温30 ℃；样品室温度20 ℃；进样量5 μl。
2.3 质谱条件
电喷雾离子源；正离子扫描；毛细管电压4.0 kv；射频透镜电压0.1 v；离子源温度120 ℃；去溶剂气温度350 ℃；去溶剂气流量600 l/h；锥孔气流量50 l/h；光电倍增器电压650 v；碰撞气体为氩气，碰撞气压0.32 pa； 多反应监测（mrm）模式检测，16种染料的质谱分析参数见表1， mrm色谱图见图1。
表1 16种致癌和致敏染料的质谱分析参数（略）
table 1 ms parameters for 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs analysis
图1 16种致癌和致敏染料的mrm色谱图（略）
fig.1 mrm chromatograms of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs
色谱峰编号同表1（the peak numbers are the same as in table 1）.
2.4 标准储备液和工作液的配制
准确称取适量的各染料标准品，用甲醇溶解并定容至100 ml，配制成1000 mg/l标准储备液，于－20 ℃下保存。准确量取各染料标准储备液5 ml，用甲醇定容至100 ml，配制成50 mg/l混合标准储备液。使用时，用甲醇逐级稀释成混合标准工作液，于4 ℃下保存，现用现配。
2.5 样品处理
2.5.1 纺织品、皮革、纸张、木材、气球、造型黏土、贴纸材质玩具材料的处理 取代表性样品，测试试样应从单个样品上的可触及部分移取，同种材料可合并作为同一测试试样，将其剪碎至3 mm×3 mm以下，混匀。准确称取1.0 g试样置于50 ml具塞锥形瓶中，准确加入15 ml无水乙醇，超声提取15 min。将提取液转移至50 ml鸡心瓶中，残渣再加入15 ml无水乙醇提取一次。合并提取液，用旋转蒸发仪于40 ℃水浴减压浓缩至近干，用氮气缓慢吹干后，准确加入1 ml甲醇溶解残渣，过0.20 μm微孔滤膜后，供uplc/ms/ms测定。
2.5.2 可接触液体玩具材料的处理 取代表性样品，测试试样应从单个样品上的可触及部分移取，同种材料可合并作为同一测试试样。准确称取1.0 g试样置于50 ml具塞锥形瓶中，准确加入15 ml无水乙醇，超声提取15 min，将提取液转移至50 ml鸡心瓶中，用旋转蒸发仪于40 ℃水浴减压浓缩至近干，用氮气缓慢吹干后，准确加入1 ml甲醇溶解残渣，过0.20 μm微孔滤膜后，供uplc/ms/ms测定。
3 结果与讨论
3.1 样品处理方法的优化
酸性红26等16种染料的正辛醇/水分配系数（kow）介于－0.83~4.58之间，极性范围分布较宽，各染料均在无水乙醇中有较好的溶解性。因此，选择无水乙醇为提取溶剂。为了减少操作步骤及获得尽可能高的提取率，采用超声提取方式对样品进行提取。考察了不同提取时间（10， 15， 20和25 min）和提取次数（1， 2和3次）的提取效果，确定了最佳的样品处理条件。
3.2 色谱条件的优化
3.2.1 色谱柱的选择 采用亚微米小颗粒填料色谱柱可获得更高的分离度、样品通量和灵敏度。分别考察了具有不同选择性的uplc色谱柱（规格均为50 mm×2.1 mm，1.7 μm）对16种染料的分离效果：c18及c8（直链烷烃）、shield rp18（内嵌有氨基甲酸酯极性基团）、phenyl（苯基连接在c6直链的硅甲基官能团上）、hilic（硅胶基质）、hss t3（三键c18烷基键合）。结果表明，16种染料在acquity uplc beh c18色谱柱上获得了最为理想的分离效果。
3.2.2 流动相的选择 分别考察了反相色谱常用的有机相溶剂（甲醇和乙腈）与不同种类和ph值的挥发性缓冲液组成的流动相体系，如甲醇（或乙腈）-5 mmol/l甲酸铵溶液（ph值分别调节为3.75， 4.00， 4.25， 4.50， 4.75， 5.00， 5.25， 5.50和5.75）、甲醇（或乙腈）-5 mmol/l乙酸铵（ph值分别调节为2.75， 3.00， 3.25， 3.50， 3.75， 4.00， 4.25， 4.50和4.75）、甲醇（或乙腈）-0.1%甲酸溶液等对染料化合物的色谱行为和离子化程度的影响。结果表明，以乙腈-5 mmol/l乙酸铵溶液（ph=5.0）作为流动相时获得了最优的色谱峰形、分离效果和质谱信号响应。进一步比较了乙酸铵缓冲液离子强度的影响，乙酸铵溶液浓度从2 mmol/l变化到10 mmol/l的结果表明，5 mmol/l乙酸铵为最佳添加量。由于上述16种染料包括酸性染料、碱性染料、分散染料、直接染料等类别，化学结构上涵盖了偶氮型、三芳甲烷型、蒽醌型、杂环型等，各染料的化学性质和保留性质相差较大，选择梯度洗脱方式，通过优化流动相梯度洗脱条件实现了16种染料的有效分离。
3.3 质谱条件的优化
在esi+和esi－离子化模式下，分别进行全扫描以选择适当的电离方式和准分子离子峰。实验结果表明，大部分染料在离子源esi+电离方式下，可获得较高丰度的〖m + h〗+母离子。酸性红26、酸性紫49等含钠染料的母离子为〖(m－nna)+(n+1)h〗+，碱性红9、碱性紫1、碱性紫3等含氯染料的母离子为〖m－cl+h〗+，16种染料的二级质谱图见附图1（/fig/090704.pdf）。在确定各染料的母离子后，采用子离子扫描方式进行二级质谱分析，对子离子进行了优化选择，确定定量离子和辅助定性离子，通过优化毛细管电压、一级锥孔电压、二级锥孔电压、射频透镜电压、碰撞能量、质谱分辨率等质谱参数，使每种染料的准分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大。
3.4 uplc/ms/ms与hplc/ms/ms的比较
本研究组曾建立了同时测定玩具中酸性红26等16种致癌和致敏染料的hplc/ms/ms方法，其完成一次样品分析的时间为27 min， 流动相消耗量为27 ml（流速为1.0 ml/min）。而本方法在9 min之内即完成了对16种染料的分析测定，分析时间为hplc/ms/ms方法的1/3，显著提高了样品分析通量，完成一次样品分析的溶剂消耗量仅为2.7 ml，为hplc/ms/ms方法的1/10，提高了分析速度，降低了分析成本，减少了废液产生。
3.5 线性范围和检出限
分别配制一系列标准工作溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，16种染料的线性方程、线性范围和相关系数见表2。以信噪比为10估算定量限（loq），16种染料的定量限为1.0~8.0 μg/kg。
表2 16种致癌和致敏染料的线性方程、线性范围和相关系数（n=3）（略）
table 2 linear equations，linear ranges and correlation coefficients of 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs(n=3)
3.6 方法的回收率和精密度
分别称取经测定不含有16种染料的纺织品、皮革、纸张、木材、可接触液体、气球、造型黏土、贴纸等材质的玩具样品1.0 g，分别添加不同浓度标准溶液，每个添加浓度6个平行样，进行添加回收率和精密度实验，用超高效液相色谱-串联四极杆质谱进样测定。在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为81.3%～98.6%。16种染料中代表性物质的回收率和精密度结果见表3，全部结果见附表2（/table/090704.pdf）。在一日内不同时间点和不同日期（5 d内）测定的日内精密度均小于11%； 日间精密度均小于14%。
3.7 样品测定
应用本方法对布绒、皮革、纸制、木制、泥制等不同类型的玩具样品共25件进行了分析测定，均未检出含有致癌和致敏染料。
表3 玩具（纺织品、皮革、纸张）中16种致癌和致敏染料的部分添加回收率结果（n=6）（略）
table 3 results of recovery for 16 carcinogenic and allergenous dyestuffs in textile，leather and paper samples(n=6)
【参考文献】
1 department of supervision on inspection，general administration of quality supervision，inspection and quarantine of the people’s republic of china(国家质量监督检验检疫总局检验监管司).toy safety testing and regulation(玩具安全测试及法规).beijing(北京)：china standard press(中国标准出版社)，2007： 170
2 chen shi-neng(陈士能).encyclopedia of chinese chemical products(中国化工产品大全.中卷).beijing(北京)：chemical industry press(化学工业出版社)，1998： 859
3 he jin-xin(何瑾馨).the chemistry of dyes(染料化学).beijing(北京)：china textile & apparel press(中国纺织出版社)，2009： 11
4 safety of toys-part 9：organic chemical compounds-requirement. en 71-9-2005
5 ko-tex standard 1000，ko-tex international，ausgabe/edition 01/2009
6 commission decision of 15 may 2002 establishing the ecological criteria for the award of the community eco-label to textile products and amending decision 1999/178/ec(2002/371/ec)
7 technical specification for ecological textiles(生态纺织品技术要求)，gb/t 18885-2002
8 technical requirement for environmental labeling products-ecotypic textiles(环境标志产品技术要求 生态纺织品).hj/t 307-2006
