【关键词】 双氟胞苷;晶体;上皮细胞;细胞培养技术;兔
【摘要】 目的探讨双氟胞苷对培养的兔晶状体上皮细胞(rlecs)体外生长的抑制作用，为临床防治后发性白内障提供理论依据。方法在第3代体外培养rlecs中加入不同浓度双氟胞苷，采用mtt比色法及血细胞板计数法观察不同浓度的双氟胞苷对体外培养的rlecs增殖的抑制作用。结果浓度为64 mg/l双氟胞苷在24 h对rlecs无明显的抑制作用;浓度为128~4 096 mg/l的双氟胞苷在24、48、72 h对rlecs有明显的抑制作用，与阴性对照组比较差异有统计学意义(f=22.248~34.090，q=2.188~11.353，p<0.05)。在同一作用时间随双氟胞苷浓度的增高，对rlecs的抑制作用逐渐增强，各浓度之间比较差异具有统计学意义(q=2.122~10.524，p<0.05)。各实验浓度的双氟胞苷对rlecs的抑制作用随作用时间延长逐渐增强，在72 h抑制作用最强。mtt比色法结果与血细胞板计数法结果一致。结论双氟胞苷可抑制体外培养rlecs的增殖，可用于抑制、预防后发性白内障的形成。
【关键词】 双氟胞苷;晶体;上皮细胞;细胞培养技术;兔
[abstract]objectiveto study the depressant effect of gemcitabine on the cells of rabbit epithelium lentis (rel) in vitro, and provide a theoretical evidence for treatment of aftercataract.methodsthe cells of rel were cultured in vitro, and different concentrations of gemcitabine were added into the cells of the third generation. the effect of gemcitabine at different concentrations on the cells was measured with mtt staining colorimetry and cell count technique.resultsthe gemcitabine at the concentration of 64 mg/l for 24 h did not show inhibition on cells of rel (p>0.05); at 128-4 096 mg/l for 24 h, 48 h, and72 h showed obvious inhibition (f=22.248-34.090,q=2.188-11.353,p<0.05), the differences were significant as compared with the control. under the same-time condition, the inhibitory action increased with the increase of the concentration of gemci-tabine, the differences among different concentrations were significant (q=2.122-10.524,p<0.05). with the same concentration, the effect of prohibition depended on time. the result of mtt was consistent to that of cell count technique.conclusiongemcitabine depresses the growth of rel cells cultured in vitro, which can be used to inhibit and prevent secondary cataract.
[key words]gemcitabine; lens, crystalline; epithelial cell; cell culture technique; rabbits
后发性白内障是白内障囊外摘除术后常见的并发症,也是影响病人术后视力的最主要原因之一，其术后1、3、5年的白内障发生率在成人可以高达11.8%、20.7%、28.5%[1-2]。WWw.133229.coM有关实验的结果表明，术后残留的晶状体上皮细胞的增殖和迁移，转化为成纤维细胞，可能是形成后发性白内障的主要原因之一[3-4]。本实验旨在观察双氟胞苷对培养的兔晶状体上皮细胞(rlecs)体外生长的抑制作用，为临床防治后发性白内障提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1实验动物取实验用家兔10只，体质量为1.5～2.5 kg，雌雄不限，由青岛大学医学院动物实验中心提供。
1.1.2主要试剂与药品dmem干粉培养基(gibco brl 公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，胰蛋白酶(gibco brl 公司)，四甲基偶氮唑盐(mtt，sigma 公司)，双氟胞苷(美国礼莱亚洲公司)，青霉素钠(华北制药有限公司)，硫酸链霉素和硫酸庆大霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)。
1.2方法
1.2.1培养液的配制将dmem干粉培养基加入1 000 ml三蒸水配制成dmem培养液，加入灭活的小牛血清,使之成为含体积分数0.150小牛血清的培养液，4 ℃冰箱保存。mtt溶液: 将mtt474用pbs液溶解，浓度为5 mg/l,两层微孔滤膜过滤除菌，4 ℃避光保存。
1.2.2rlecs的培养实验用兔空气栓塞致死后，完整摘除眼球，在超净工作台内取出晶状体，分离出连着晶状体赤道部的前囊膜。将晶状体前囊膜剪成组织碎片，均匀铺贴于培养瓶底壁，加入培养液置于培养箱中，至细胞游出相互融合，然后进行传代培养。取培养的第3代rlecs，制成细胞悬液，用血细胞板观察四角大方格的细胞数[5-7]。
1.2.3实验分组根据条件培养液的不同，随机分为8组，阴性对照组(无血清培养液)和浓度为64、128、256、512、1 024、2 048、4 096 mg/l的双氟胞苷无血清培养液组。
1.2.4rlecs计数①血细胞板计数法[8]：将rlecs悬液调整到细胞密度为2.5×107/l，平行接种到24孔培养板上，每孔1 ml，平行3个，放入co2培养箱中10 h后取出，弃上清液，8组分别加入条件培养液，置co2培养箱中培养24、48、72 h，观察细胞形态学改变。分别于培养24、48、72 h后弃去条件培养液，加胰酶消化后，每孔加d-hanks液1 ml，将细胞吹打均匀，用血细胞板计数，每孔计数8次，取平均值。②mtt比色法[9-11]：将rlecs悬液调整到细胞密度为5×107/l。平行接种于96孔培养板，平行3个，每板分为9组，每组6孔，第1组为200 μl不含细胞的空白对照组，其余8组分别加入200 μl上述密度的细胞培养液(含体积分数0.150小牛血清)，每孔细胞数约为5×103个，置co2培养箱中培养。10 h后，分别将含有细胞的8组培养液弃去，按实验分组加入条件培养液，置co2培养箱中继续培养。分别于24、48、72 h后弃去上清液，每孔再加20 μl浓度为5 g/l的mtt液，3 h后终止培养，弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜(dmso)200 μl，在震荡器上震荡30 min，使结晶物充分溶解，在全自动酶联免疫检测仪上测定570 nm波长处的吸光度(a)值。结果以mtt比色法测定值减去空白对照组测定值表示。
1.2.5统计学处理实验数据以均数±标准差表示，采用spss 12.0及ppms 1.5[12]软件处理，组间比较采用方差分析。
2结果
2.1正常培养的rlecs形态学观察
组织碎片在接种24~48 h后可见细胞游走出植片边缘，贴壁生长，细胞逐渐增多，随时间延长细胞密度增大，最初在靠近植片处，细胞呈团状，3~4 d后大部分植片上的细胞游走出植片，围绕植片生长。6~7 d细胞生长活跃，10 d左右形成围绕植片的单层上皮细胞，铺满瓶底，达到融合状态。原代培养的晶状体上皮细胞呈透明状，多角形或六边形，保持上皮细胞的特征。传代细胞经胰蛋白酶消化后，单个细胞为圆形，6 h左右开始贴壁生长，24 h后约80%细胞贴壁，细胞增殖迅速，3~4 d达到融合。2~4代的晶状体上皮细胞贴壁迅速，增殖快，生长良好，呈展开透明状，排列不规则，与原代细胞无明显差别，传至6代后，细胞贴壁时间延长，晶状体上皮细胞变为成纤维细胞形状，呈长梭形、长条状，细胞大量增殖，中间出现拉网现象。
2.2双氟胞苷对rlecs增殖的影响
2.2.1双氟胞苷对rlecs形态学的影响 与阴性对照组比较，浓度为64 mg/l的双氟胞苷作用于rlecs 24 h后，细胞形态无明显差异;浓度为128～4 096 mg/l时，各实验组的细胞数量逐渐减少，视野中所见细胞稀疏，细胞体积略小，细胞基质较对照组亦减少。随时间的延长，上述现象更加明显，实验组在药物作用48 h后，细胞数量进一步减少，细胞收缩呈圆形，细胞基质减少;在药物作用72 h后，各实验组的细胞数量及细胞基质较24、48 h均明显减少，在4 096 mg/l组中，视野中偶见小圆形细胞及稀疏的细胞基质。
2.2.2血细胞板计数结果在24 h 时64 mg/l双氟胞苷对晶状体上皮细胞无明显抑制作用，与阴性对照组比较无显著意义(p>0.05)。64 mg/l双氟胞苷在48、72 h时，128～4 096 mg/l双氟胞苷在24、48、72 h时对晶状体上皮细胞均有明显的抑制作用，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(f=22.248~34.090，q=2.188~11.353，p<0.05)。在同一作用时间内随双氟胞苷浓度的增高，对晶状体上皮细胞的抑制作用逐渐增强，各浓度之间比较差异有显著性(q=2.122~10.524，p<0.05)。各浓度双氟胞苷对晶状体上皮细胞抑制作用，随时间的延长而逐渐增强，从双氟胞苷对晶状体上皮细胞的抑制作用血细胞板计数结果曲线来看，在72 h抑制作用最强。见图1。
2.2.3mtt比色法结果在24 h 时64 mg/l双氟胞苷对晶状体上皮细胞无明显抑制作用，与阴性对照组比较无统计学意义(p>0.05)。64 mg/l双氟胞苷在48、72 h，128～4 096 mg/l双氟胞苷在24、48、72 h对晶状体上皮细胞均有明显的抑制作 用，与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(f=42.435~290.688，q=3.133~37.001，p<0.05)。
在同一作用时间内随双氟胞苷浓度的增高，对晶状体上皮细胞的抑制作用逐渐增强，各浓度之间比较差异有显著性(q=2.351~14.298，p<0.05)。从双氟胞苷对晶状体上皮细胞抑制作用mtt比色法a值曲线可以看出，同一浓度双氟胞苷对晶状体上皮细胞的抑制作用在72 h作用最强。见图2。图1血细胞板计数法结果曲线图2mtt比色法a曲线
3讨论
近年来，针对后发性白内障的发生机制，许多学者采用多种方法从不同的方向进行研究，尤其是针对抑制残留晶状体上皮细胞增殖的药物研究成为大家关注的热点。白内障术后残留的晶状体上皮细胞在晶状体囊膜上的增生、移行、产生胶原，是白内障摘除人工晶状体植入眼发生后发性白内障的主要原因，晶状体上皮细胞增生移行至后囊可导致后囊混浊的形成[13-14]。
双氟胞苷又称吉西他滨(2，2-二氟脱氧双氟胞嘧啶核苷)，是一种新的胞嘧啶核苷衍生物，主要代谢产物在细胞内参入dna，主要作用于g1/s期。双氟胞苷能抑制核苷酸还原酶，导致细胞内脱氧核苷三磷酸酯减少，尚能抑制脱氧胞嘧啶脱氨酶减少细胞内代谢物的降解，具有自我增效的作用，其对多种肿瘤有效。
本实验主要采用双氟胞苷局部用药的方式，可以减少或消除全身用药的副作用，另外可以提高药物局部的浓度，更好地发挥双氟胞苷对晶状体上皮细胞的作用，为今后进一步体内应用双氟胞苷打下了理论基础。
本实验采用血细胞板计数法及mtt定量法观察了双氟胞苷对晶状体上皮细胞增殖影响，两种方法所得实验结果基本相同，都显示了双氟胞苷在低浓度(64 mg/l)对晶状体上皮细胞无明显抑制作用，与阴性对照组比较无统计学意义(p>0.05)，随着双氟胞苷浓度的增高其抑制晶状体上皮细胞增殖的作用逐渐增强，在24、48、72 h对晶状体上皮细胞均有明显的抑制作用，与阴性对照组比较，差异有显著性(p<0.05)，说明双氟胞苷对晶状体上皮细胞的抑制作用呈剂量依赖性。从mtt比色法a值曲线可以看出，同一浓度双氟胞苷对晶状体上皮细胞的抑制作用在72 h作用最强，呈时间依赖性。
综上所述，双氟胞苷可抑制体外培养rlecs的增殖，并可因此抑制、预防后发性白内障的形成。因人晶状体上皮细胞与rlecs的不同，且体外培养与活体的生理条件有诸多不同，需进一步研究其在人体的作用。双氟胞苷有望成为预防后发性白内障的药物之一。
【参考文献】
\[1\]apple d j, solmon k d, tet tetz m r, et al. posterior capsular opacification \[j\]. surv ophthalmol, 1992,37:73-116.
\[2\]kappelhof j p, verensen g f. the pathology of after catarcat\[j\]. acta ophthalmol, 1992,70:13-24.
\[3\]高维奇. 白内障术后后囊膜混浊\[j\]. 黑龙江医学, 2004,28(8):568-570.
\[4\]李筱荣,孙慧敏,袁佳琴. 白内障摘除人工晶状体植入后晶状体后囊膜混浊的基础研究\[j\]. 中华眼科杂志, 2001,37(6):476-480.
\[5\]苏小波,李绍珍,郑健梁. 兔晶状体上皮细胞培养的技术改进\[j\]. 眼科研究, 1996,14(4):266-267.
\[6\]reddan j r, mcgee s j, goldenberg e m. both human and newborn rabbit lens epithelial cells exhibit similar limited growth properties in tissue culture\[j\]. cur eye res, 1982,83(2):399-405.
\[7\]王强,张俊青,张晶,等. 兔晶状体上皮细胞体外培养的研究\[j\]. 滨州医学院学报, 2000,23(11):1-2.
\[8\]鄂征. 组织培养与分子生物学技术\[m\]. 北京:北京出版社, 1995:87-880.
\[9\]司徒镇强,吴正军. 细胞培养\[m\]. 西安:世界图书出版公司,1996:186-187.
\[10\]郑永唐,贲昆龙. 测定细胞存活和增殖的mtt方法的建立\[j\]. 免疫学杂志, 1992,8(4):266-268.
\[11\]张敏,张效房,高小东,等. mtt比色法测定药物对晶状体上皮细胞增殖的影响\[j\]. 眼科研究, 1997,15(4):233-235.
\[12\]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件ppms 1.5的组成和应用特点\[j\]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1): 29-32.
\[13\]schaumberg d a, dana m r, christen w g, et al. a systematic overview of the incidence of posterior capsule opacification\[j\]. ophthalmology, 1998,105(7):1213-1221.
\[14\]saxby l a. secondary cataract\[m\]//yanoff m, duker j s. ophthalmolgy. 3rd ed. london: mosby, 2001:1-4.
