【摘要】 目的: 探讨红景天苷激活hif-1α表达, 抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡的可能的信号通路。方法: 将原代培养的心肌细胞分为4组: 正常对照组、 缺氧组、 缺氧+100 mg/l红景天苷组、 缺氧+100 mg/l红景天苷+ly294002组。mtt法测定细胞存活率, hoechst33258染色、 dna-ladder检测细胞凋亡, 通过免疫荧光染色、 western blot检测细胞akt、 磷酸化akt、 hif-1α的表达。结果: ly294002处理后, 红景天苷对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的保护作用被明显减弱, 细胞存活率明显下降（p<0.01）, 细胞凋亡比率明显增加（p<0.01）, 琼脂糖凝胶电泳特异性“ladder”灰度明显加深, 磷酸化akt、 hif-1α 2种蛋白表达水平明显降低。结论: 红景天苷对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用, 其机制可能是通过pi(3)k/akt信号通路激活hif-1α的表达有关。
【关键词】 红景天苷 心肌细胞 pi(3)k/akt hif-1α
大量实验证实, 缺氧可诱导心肌细胞凋亡, 造成心肌损伤,进而参与心力衰竭的发病过程［1］。红景天苷（salidroside, sal）为传统中药红景天的有效萃取物之一。近年研究表明,红景天苷具有抗缺氧、 抗疲劳、 抗辐射、 抗衰老和抑制人脐静脉内皮细胞［2］等多种药理作用。WWw.133229.CoM通过前期实验, 我们已经证实红景天苷对缺氧诱导的心肌细胞凋亡具有良好的抑制作用, 且这种抑制作用具有剂量依赖性, 并首次证实其分子机制可能与激活缺氧诱导因子-1α（hypoxia induced factor-1α, hif-1α）的表达, 诱导其转位有关。但其具体的信号通路, 至今仍不明确。本研究拟通过研究akt变化, 进一步探讨红景天苷激活hif-1α表达可能的信号通路。
1 材料和方法
1.1 材料 红景天苷（纯度>99%）购自中国药品生物制品鉴定所。新生牛血清、 dmem低糖培养基购自gibco公司。胶原酶i、 噻唑蓝（mtt）、 5-溴-2′-脱氧尿苷（bromodeoxyuridine, brdu）、 ly294002、 rnase a均购自sigma公司。hoechst 33258染料、 bca蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所。蛋白酶k购自merck。hif-1α兔多克隆抗体购自美国novus。akt、 磷酸化akt抗体均购自cst。hrp、 fitc标记羊抗兔二抗均购自北京中山。其余试剂为国产分析纯级。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞原代培养 取新生1～3 d sd大鼠（第四军医大学实验动物中心提供）心室肌组织并剪碎, 用0.95 g/l的胶原酶i37℃分次消化, 分离心肌细胞。以含100 ml/l新生牛血清的dmem低糖培养基制备细胞悬液, 差速贴壁后加入100 μmol/l brdu纯化心肌细胞, 使纯度达到90%以上, 接种细胞至培养板。
1.2.2 缺氧模型建立 采用koyama等［3］方法配制缺氧液(mmol/l): nah2po40.9、 nahco36.0、 cacl21.0、 mgso4 1.2、 乳酸钠 40、 hepes 20、 nacl 98.5、 kcl 10.0, ph6.8, 37℃, 以高浓度氮气饱和（>99.9% 1 l/min×30 min）, 测其血气po2≤4.0 kpa。用缺氧液置换正常培养液, 三气培养箱(kendro, germany), 调整气体浓度为950 ml/l n2+50 ml/l co2, 孵育6 h。
1.2.3 实验分组 将培养的心肌细胞分为4组: （1）正常对照组（control）: 用正常培养液培养细胞; （2）缺氧组（hypoxia）: 参照上述方法, 建立缺氧模型; （3）100 mg/l红景天苷预处理组（hypoxia+sal）: 缺氧前, 100 mg/l红景天苷预处理24 h, 参照（2）行缺氧处理。（4）ly294002+红景天处理组 (hypoxia+sal+ly): 100 mg/l红景天苷预处理24 h后继续用20 μmol/l ly294002处理1 h, 参照（2）行缺氧处理。
1.3 观察指标
1.3.1 细胞存活率 mtt比色法检测细胞存活率。细胞接种于96孔板, 缺氧处理后, 每孔加入5 g/l mtt 20 μl, co2孵箱孵育4 h, 弃上清液, 每孔加入dmso 150 μl, 震荡10 min, 酶联免疫检测仪上490 nm波长测定各孔光吸收度。
1.3.2 hoechst 33258染色 各组细胞处理后, 40 g/l多聚甲醛固定, pbs冲洗2次, 5 g/l hoechst 33258染料孵育10 min, pbs冲洗2次后紫外线激发, 荧光倒置显微镜下任选5个视野观察计数并拍照。
1.3.3 dna琼脂糖凝胶电泳 参照文献［4］方法提取心肌细胞dna。配制20 g/l琼脂糖凝胶, 加入8 μg dna样品, tbe缓冲液中电泳, 凝胶成像系统中成像。
1.3.4 hif-1α免疫荧光染色 培养细胞于12孔板, 处理细胞后40 g/l多聚甲醛固定并透化处理, pbs充分清洗后, 100 g/l羊血清封闭, 加入hif-1α兔多克隆抗体（1∶400） 4℃过夜孵育。pbs充分清洗, 羊抗兔fitc标记的荧光二抗孵育30 min, 荧光显微镜下观察细胞并拍照。
1.3.5 western blot检测 培养细胞于6孔板, 缺氧处理后, 参照文献［5］裂解细胞bca试剂盒蛋白定量后, sds-page系统电泳转膜后加入一抗, 包括hif-1α抗体（1∶1000）、 akt抗体（1∶1000）、 p-akt抗体（1∶1000）、 β-actin抗体（1∶2000）, 二抗为hrp标记羊抗兔抗体（1∶1000 ）。
1.4 统计学处理 实验数据以x±s表示, 用graphpad software统计软件进行组与组之间单因素方差分析。
2 结果
2.1 ly294002使细胞存活率下降 mtt实验结果表明, 缺氧后心肌细胞存活率为（43.19±8.84）%, 较正常组细胞明显下降, 有统计学意义（p<0.01）; 100 g/l sal预处理细胞缺氧后细胞存活率修复为（66.60±12.77）%, 与缺氧组细胞比较明显升高（p<0.01）; 而sal与ly294002共同处理的细胞缺氧后细胞存活率又下降至（53.46±9.59）%, 与单独sal预处理组比较具有统计学意义（p<0.01, 图1）。
图1 mtt比色法测定细胞存活率（略）
1: 正常组; 2: 缺氧组; 3: 缺氧+sal组; 4: 缺氧+sal+ly组. bp<0.01 vs正常组; dp<0.01 vs缺氧组; fp<0.01 vs缺氧+sal组.
2.2 ly294002使细胞凋亡增多 细胞发生凋亡时, 染色质会固缩, hoechst33258染色显示细胞核呈致密浓染, 或呈碎块状致密浓染（如图 2b、 c、 d箭头所示）。每组细胞任选5个视野进行细胞计数, 计算染色阳性细胞比率, 进行统计学分析。统计结果（图2e）显示, 缺氧组细胞hoechst染色阳性细胞率与正常组细胞比较有明显差异（p<0.01）, sal预处理细胞缺氧后染色阳性细胞率与缺氧组细胞比较有明显差异（p<0.01）, 而sal与ly294002共同处理的细胞缺氧后染色阳性细胞率增加, 与单独sal预处理组比较具有统计学意义（p<0.01）。此外, 通过琼脂糖凝胶电泳进一步检测了心肌细胞的凋亡。如图3所示, 心肌细胞缺氧后可见明显的特异性的“ladder”, sal预处理组心肌细胞缺氧后虽有“ladder”出现, 但较缺氧组“ladder”灰度明显减弱, 而sal与ly294002共同处理的细胞缺氧后“ladder”灰度较单独sal预处理组“ladder”灰度又明显加深。
2.3 ly294002阻断akt的磷酸化 大量资料证实, ly294002为pi(3)k特异性抑制剂, 它可以阻断pi(3)k的下游靶蛋白akt的磷酸化表达。结果如图4所示, sal与ly294002均未改变细胞akt总蛋白水平, 与正常组细胞比较, 缺氧后细胞磷酸化akt水平明显升高, sal预处理后其磷酸化水平进一步提高, 而ly294002处理后, sal的这种提高akt磷酸化的作用被阻断, 磷酸化akt蛋白表达水平明显下降。
图2 hoechst 33258染色检测细胞凋亡率（×200）（略）
a: 正常组; b: 缺氧组; c: 缺氧+红景天苷组; d: 缺氧+红景天苷+ly; e: hoechst染色阳性细胞比率. 1: 正常组; 2: 缺氧组; 3: 缺氧+sal组; 4: 缺氧+sal+ly组. bp<0.01 vs正常组; dp<0.01 vs缺氧组; fp<0.01 vs缺氧+sal组.
图3 dna ladder检测细胞凋亡（略）
m: dna marker; 1: 正常组; 2: 缺氧组; 3: 缺氧+红景天苷组; 4: 缺氧+红景天苷+ly组.
图4 western blot检测心肌细胞p-akt及akt蛋白表达（略）
1: 正常组; 2: 缺氧组; 3: 缺氧+sal组; 4: 缺氧+sal+ly组. ap<0.01 vs正常组; dp<0.01 vs缺氧组; fp<0.01 vs缺氧+sal组.
2.4 ly294002阻断hif-1α的表达 近来研究证实, pi(3)k的抑制剂可抑制hif-1α的稳定及表达［6］。免疫荧光及western blot试验结果均与之一致（图5、 6）常培养的细胞hif-1α迅速降解, 故较少有蛋白表达; 缺氧后, 细胞hif-1α表达稳定, 免疫荧光及western blot结果均显示hif-1α蛋白表达量明显增加; sal可进一步激活hif-1α的表达, 而pi(3)k特异性抑制剂ly294002抑制了hif-1α的表达, 蛋白表达水平较sal预处理组明显减少（p<0.01）。
图5 免疫荧光染色检测心肌细胞hif-1α蛋白的表达（×200）（略）
a: 正常组; b: 缺氧组; c: 缺氧+sal组; d: 缺氧+sal+ly组.
图6 western blot检测心肌细胞hif-1α蛋白表达（略）
1: 正常组; 2: 缺氧组; 3: 缺氧+sal组; 4: 缺氧+sal+ly组. bp<0.01 vs正常组; dp<0.01 vs缺氧组; fp<0.01 vs缺氧+sal组.
3 讨论
近年, 大量的实验模型及其人类心脏疾病证实, 凋亡造成的心肌细胞的减少在人类多种类型的心脏疾病中占极其关键地位, 并最终导致心脏功能的衰竭。因此, 阻断细胞凋亡进程可以延缓甚至阻断心衰的发生。本研究中, 通过检测细胞存活率、 细胞凋亡比率及其相关蛋白表达水平, 证明了心肌细胞经pi(3)k特异性阻断剂ly294002处理后, 红景天苷对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的保护作用被明显减弱,细胞存活率明显下降, 细胞凋亡比率明显增加, 琼脂糖凝胶电泳结果显示特异性“ladder”灰度明显加深, 磷酸化akt、 hif-1α2种蛋白表达水平明显降低, 这些结果均提示, 在红景天苷抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中, akt起到了重要的作用, 通过它的磷酸化诱导了hif-1α的表达。
pi(3)k/akt信号通路可激活一系列生长信号通路, 阻断一系列凋亡信号通路, 从而促进细胞的存活、 增殖。相反, 阻断pi(3)k/akt信号通路, 可导致细胞的凋亡。研究证实, 缺氧或胰岛素等生长因子可激活akt的磷酸化, 进而诱导hif-1α蛋白的稳定及其转录, 增加其表达［7］。但其具体的机制至今仍不明确。sodhi等［8］研究证实, hif-1并不含有akt磷酸化后的结合位点, akt磷酸化并不能直接诱导hif-1α的表达, 但akt激活后, 可激活其下游靶蛋白gsk-3(glycogen synthase kinase-3, 糖原合成激酶3)磷酸化的增加, 从而抑制hif-1α的降解, 增加其表达。也有研究证实, akt可能通过激活mtor（mammalian target of rapamycin, 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）的表达, 从而促进hif-1α的转录［9]。通过本实验, 我们发现pi(3)k抑制剂ly294002可明显减少hif-1α表达, 红景天苷处理后细胞凋亡率明显升高, 这些结果显示, 红景天苷对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用可能是通过激活akt的磷酸化进而诱导了hif-1α的稳定表达途径而实现的。
综上所述, 红景天苷对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用可能与激活pi(3)k/akt的磷酸化进而诱导hif-1α的表达有关。本研究将为红景天苷开发用于缺氧造成的心脏疾病的治疗制剂提供了一定的理论基础。
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