PI3K/Akt抑制剂对肺腺癌A549细胞增殖活性的影响

【关键词】 非小细胞肺癌;pi3k;ly294002;pakt;bcl2

【摘要】 目的 研究磷脂酰肌醇激酶特异性抑制剂ly294002对人肺腺癌a549细胞株体内外生长的影响，探讨其可能的作用机制。方法 采用mtt方法检测a549细胞增殖活力的改变，用流式细胞仪进行细胞周期分析;建立裸鼠肺癌移植瘤模型，观察ly294002对荷瘤小鼠肿瘤生长情况的影响及肿瘤抑制率。western印迹检测小鼠肿瘤组织内pakt蛋白及bcl2蛋白的表达。结果 ①ly294002对a549细胞增殖有抑制作用，各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义(均p<0.01)，并随着剂量的增加及时间的延长，抑制率增加。②经ly294002治疗后，对照组的瘤重为(773.33±32.04)mg，ly294002组的瘤重为(461.67±36.56)mg，抑瘤率达40.3%。③ly294002组的pakt蛋白及bcl2蛋白表达水平较对照组明显降低。结论 ly294002能抑制肺癌a549细胞的恶性增殖，呈明显的时间及剂量依赖性，并降低pakt蛋白及bcl2蛋白表达水平，诱导肺癌细胞凋亡可能是ly294002发挥抗癌作用的重要机制。

【关键词】 非小细胞肺癌;pi3k;ly294002;pakt;bcl2

　磷醇酰肌醇3激酶(pi3k)/丝氨酸苏氨酸激酶(akt)通路是体内重要的生长因子通路，参与因生长因子激活的经pi3k介导的信号过程，激活的akt(pakt)又进一步激活抗细胞凋亡机制，葡萄糖代谢及蛋白合成等过程，从而促进细胞的生长和增殖〔1〕。Www.lw881.com研究证明，akt的活化与肺癌的发生发展密切相关，在促进肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、转移，促进血管生成，促进对化疗和放疗的抵抗、抑制细胞凋亡方面有重要作用〔2，3〕。akt通路被证实参与了大多数肿瘤的发生发展〔4〕。ly294002〔2(4吗琳基)8苯基4氢1苯并毗喃4酮〕是pi3k的一种特异性的抑制剂，在抗肿瘤研究中具有良好的应用前景。本研究观察了ly294002对肺癌细胞a549体内外生长的影响及对肺腺癌细胞凋亡的作用，为肺癌的治疗和药物开发提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人肺腺癌细胞株a549购自中科院上海细胞生物研究院;f12k培养基、ly294002及噻唑蓝(mtt)购自sigma公司;胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所;pakt 鼠抗人igg一抗来自美国cst公司;bcl2抗体、二氨基联苯胺(dab)和链霉素抗生素蛋白过氧化物酶(sp)试剂盒为北京中杉公司的产品;裸鼠由北京大学医学院实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　a549细胞用f12k培养基，于37℃、5% co2培养箱内培养。细胞为贴壁生长，0.25%的胰蛋白酶消化传代。

　　1.2.2 mtt比色分析法检测ly294002对a549细胞生长抑制作用

　　取对数生长期a549细胞按1×104/孔接种于96孔培养板，每孔加液量200 μl。于培养24 h后换液，设空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)及实验组(加不同浓度的ly294002，其终浓度分别为5、10、20 、40 μmol/l)，每组设6个复孔。分别于培养24、48、72 h加入mtt(5 g/l)20 μl，继续培养4 h后吸出上清，每孔加二甲基亚砜(dmso) 150 μl，振荡溶解10 min，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长490 nm，空白孔调零，测定各孔吸光度a。计算细胞生长的抑制率=(1实验组a平均值/对照组a平均值)×100%。

　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率的变化

　　取对数生长期的a549细胞，调整细胞浓度为2×105/ml接种于培养瓶，加入上述不同浓度的ly294002，培养48 h后获取细胞，制成单细胞悬液，4℃的70%的冷乙醇固定，放置4℃冰箱固定12 h以上。检测时，弃去乙醇，加入0.5%胃蛋白酶1 ml(ph 1.5～2.0)消化，采用碘化丙锭(pi)一步插入性dna定量荧光染色法，上机检测细胞周期和细胞凋亡率。

　　1.2.4 裸鼠移植瘤模型的建立与干预

　　12只裸鼠，3～4周龄，均为雌性，体重约18～20 g，实验和饲养均在spf条件下进行。随机将裸鼠分为两组：对照组和ly294002组，于裸鼠右上背部皮下接种处于对数生长期的a549细胞1×107/0.2 ml。ly294002组于a549细胞接种后1 w肿瘤长出后开始予ly294002 25 mg/kg腹腔注射，每周2次，共3 w;对照组等量生理盐水腹腔注射。实验共4 w。实验中注意观察裸鼠进食及排便情况，实验结束取出移植瘤称重，并计算ly294002的抑瘤率。移植瘤-80℃冰箱保存。

　　1.2.5 western印迹法检测pakt、bcl2蛋白的表达

　　组织蛋白质的提取：取50 mg组织，用组织小剪将其充分剪碎，溶于预冷15℃的1.0 ml的组织蛋白质提取液，超声破碎仪充分破碎细胞，然后置于装满碎冰的铝制平托盘上温育20 min。4℃离心。收集上清液，经核酸定量仪检测纯度并定量，制备10%sdspage，每泳道加蛋白50 μg进行电泳，经电转印转移到硝酸纤维滤膜上。5%脱脂奶粉封闭，1∶800 pakt单克隆抗体，1∶400 bcl2单克隆抗体，4℃孵育过夜，1∶2 000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔及羊抗鼠igg室温孵育1 h，弃二抗，将硝酸纤维素膜反面于滤纸上吸一下后，加入碱性磷酸酶底物显色试剂(bcip/nbt，即用型)，蛋白带显色后，漂洗。图像分析系统测定各条带的吸光度a值作定量分析。

　　1.3 统计学分析

　　采用spss13.0统计软件进行处理，计量资料以x±s表示，用方差分析比较各浓度药物组间a值差异，率的比较采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 ly294002对a549细胞生长的抑制效应

　　mtt比色结果显示：ly294002对a549细胞增殖有抑制作用，各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义(均p<0.01);随着ly294002剂量的增加和作用时间的延长，其对a549细胞生长抑制率增加。不同浓度的ly294002作用于a549细胞不同时点的a值。见表1。表1 ly294002作用不同时间后的a值和抑制率

　　2.2 ly294002对a549细胞周期及凋亡率的影响

　　4种不同浓度ly294002作用于a549细胞24 h后，均显示凋亡峰较对照组增大，对凋亡峰进行定量分析提示随着药物浓度增大，凋亡率增加，呈剂量依赖性。细胞周期检测结果显示：ly294002可引起a549细胞周期分布发生变化，表现为g0/g1期细胞增多，提示ly294002使a549细胞生长阻滞于g0/g1期。见表2。表2 ly294002对a549细胞凋亡率及细胞周期的影响

　　2.3 ly294002对裸鼠移植瘤生长的影响

　　裸鼠皮下接种a549细胞后，约1 w见皮下移植瘤出现，呈圆形或椭圆形结节。在实验过程中，各组裸鼠均未出现精神、进食、排便的明显异常及死亡。经ly294002治疗后，ly294002组的瘤重较对照组明显减轻，抑瘤率达40.3%(p<0.01)。结果显示，ly294002能抑制裸鼠体内人肺腺癌的生长。见表3。表3 ly294002对裸鼠移植瘤生长的抑制效应

　　2.4 ly294002对移植瘤细胞pakt、bcl2蛋白表达的影响

　　western印迹结果显示pakt蛋白表达量低于对照组(p<0.01)，ly294002干预后移植瘤bcl2蛋白表达降低。见表4。表4 ly294002对移植瘤pakt、bcl2蛋白表达的影响

　　3 讨 论

　　pi3k/akt通路被认为是癌细胞存活的首要通路，有“抗凋亡途径”之称，该信号转导通路的异常，可导致细胞异常增殖引起肿瘤。pi3k是由sugimoto和macara等发现的一种胞内磷脂酰肌醇激酶，与vsrc和vras等癌基因的产物相关，pi3k介导的信号转导通路调节细胞的分裂、分化、凋亡等活动〔5〕。akt是pi3k下游直接的靶蛋白，其具有丝氨酸/苏氨酸残基，可直接被pi3k激活，也可以被pi3k激活的pdk1和pdk2所激活。活化的akt可介导各种类型的细胞生长、生存和分化，同时还可上调抗凋亡基因的表达，抑制由cmyc诱导的细胞凋亡，或活化细胞内其他信号转导通路，调节细胞的适应性生存。pakt是akt的功能活化状态，akt只有在活化状态时才具有生物学功能。pakt在大多数肿瘤组织中过度表达在非小细胞肺癌病人中发现pakt总表达率为67.4%，在鳞癌和腺癌中的表达率分别为68.2%和61.5%〔6〕。pi3k/akt通路可能是参与肺癌发生发展的重要途径。

　　ly294002是五羟黄酮的衍生物，能完全特异性的抑制pi3k活性(ic50=0.43 μg/ml;1.40 μm)，能和pi3k竞争性结合atp位点，抑制akt的激活。体外实验发现ly294002对白血病细胞、卵巢癌细胞、食管癌细胞有抑制生长、促进凋亡作用。本研究发现ly294002可抑制a549细胞增殖，且随着ly294002浓度的增大及作用时间的延长，生长抑制率也随之增大;同时体内实验显示ly294002可抑制裸鼠移植瘤的生长，使移植瘤的pakt蛋白的表达下调，提示ly294002可通过抑制pi3k活性，进而调控akt的表达及活化，从而抑制肺癌的生长。

　　在正常情况下，机体可通过诱导凋亡来清除受损或无生理意义的细胞，有利于机体环境的稳定，而在肿瘤中，肿瘤细胞却可通过抑制凋亡来实现自我保护，以利于生存。肺癌的发生不仅仅与细胞增殖失控有关，也与凋亡的相对减少密切相关。akt是pi3k最主要的靶酶，与多种细胞活动、物质代谢调节，尤其是与抑制细胞凋亡、促进细胞增殖、介导细胞周期有密切关系〔7〕。bcl2基因是迄今为止研究最为深入和广泛的一种抑制凋亡的癌基因。在大多数正常机体组织中bcl2表达很低，而在肿瘤细胞中bcl2表达增高，而且这种表达与细胞的分化程度有关〔8〕，即恶性程度越高，bcl2表达也越高，肿瘤细胞越易出现凋亡抑制。有研究表明，高水平表达的bcl2蛋白可抑制糖皮质激素、热休克、γ射线以及多数化疗药物诱导的细胞凋亡，从而促进了肿瘤细胞的增殖〔9〕。pi3k/akt活化后可通过抑制核转录因子(nfκb)的转录活性、磷酸化camp应答元件结合蛋白(creb)等诱导bcl2基因的表达。本研究流式细胞仪结果显示ly294002可引起细胞凋亡率增加，且凋亡率与ly294002的浓度相关，同时ly294002可改变a549细胞的生长增殖周期，使细胞周期阻滞于g0/g1期。阻止细胞进入dna合成期，从而延缓细胞的增殖过程。移植瘤组织western印迹结果显示：ly294002可抑制裸鼠移植瘤bcl2蛋白的表达。说明pi3k信号转导通路可通过调控细胞内的凋亡相关蛋白的表达来导致细胞凋亡，提示pi3k/akt途径的活化促进细胞进入g1期和g1s期转换来调控细胞周期，抑制了细胞的凋亡，促进了细胞的无限增殖，导致肺癌的发生发展，ly294002对肺癌的促凋亡作用可能部分是由bcl2下调所介导的。因此，通过抑制pi3k/akt基因的表达从而调整细胞增殖与凋亡间的平衡，可能是肺癌靶向治疗的新思路。

【参考文献】
　1 westfall sd，skinner mk.inhibition of phosphatidylinositol 3kinase sensitizes ovarian cancer cells to carboplatin and allows adjunct chemotherapy treatment〔j〕.mol cancer ther，2005;4(11)：176471.

　　2 brognard j，clark as，ni y,et al.akt/protein kinase b is constitutively active in nonsmall cell lung cancer cells and promotes cellular survival and resistance to chemotherapy and radiation〔j〕.cancer res，2001;61(10)：398697.

　　3 tommasi s，pinto r，pilato b,et al.molecular pathways and related target therapies in liver carcinoma〔j〕.curr pharm des，2007;13(32):327987.

　　4 gliozzo b，sung ck,scalia p，et al.insulinstimulated cell growth in insulin receptor substrateldeficient zr751 cells is mediated by a phosphatidylinositol3kinaseindependent pathway〔j〕.j cell biochem，1998;70(2)：26880.

　　5 cantley lc.the phosphoinositide 3kinase pathway〔j〕.science，2002;296(5573)：16557.

　　6 brunet a，bonni a,zigmond mj，et al.akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a forkhead transcription factor〔j〕.cell，1999;96(6)：85768.

　　7 roymans d，slegers h.phosphatidylinositol 3kinases in tumor progression〔j〕.eur j biochem，2001;268(3):48798.

　　8 sarker kp，lee ky.l6 myoblast differentiation is modulated by cdk5 via the pi3kaktp70s6k signaling pathway〔j〕.oncogene，2004;23(36)：606470.

　　9 o′reilly ke，rojo f，she qb,et al.mtor inhibition induces upstream receptor tyrosine kinase signaling and activates akt〔j〕.cancer res,2006;66(3)：15008.