【摘要】 目的：了解慢性粒细胞白血病慢性期（cmlcp）患者外周血cd4+和cd8+t细胞中tcr vβ亚家族t细胞的基因表达和克隆性。方法：利用rtpcr分别扩增19例cmlcp患者外周血单个核细胞（pbmcs）、cd4+和cd8+细胞tcr vβ亚家族基因的cdr3，阳性产物进一步经基因扫描分析其克隆性。结果：cml患者外周血cd4+和cd8+细胞分别表达部分（1～21个）vβ亚家族，均以vβ13的表达率最高，其次为vβ9，多数患者的一些vβ亚家族t细胞呈克隆性增殖，主要出现于cd8+细胞中，分别以vβ21（cd4+）和vβ11（cd8+）亚家族的克隆性增殖多见。结论：cml患者外周血cd4+和cd8+细胞的tcr vβ谱系均存在限制性分布，患者存在的克隆性增殖cd4+和cd8+t细胞可能与宿主抗cml抗原反应有关，它们可能在抗cml效应中起主要作用。
【关键词】 慢性粒细胞白血病 t细胞的克隆性 tcr vβ亚家族 基因扫描
analysis of tcr vβ repertoire and clonality of cd4+ and cd8+t cells in patients with cml
geng suxia, li yangqiu, chen shaohua, yang lijian, yin qingsong, tang ji.
institute of hematology, medical college, jinan university, guangzhou 510632，china
［abstract］ objective:to investigate the gene expression of tcr vβ subfamily t cells and clonality in peripheral blood cd4+ and cd8+ cells from patients with chronic myelogenous leukemia–chronic phase(cmlcp).methods:the complementarity determining region 3(cdr3) of tcr vβ subfamily genes in peripheral blood mononuclear cells(pbmcs), sorted cd4+ and cd8+ cells from 19 cmlcp patients were amplified using rtpcr, the products were further by genescan analysis to identify the clonality of t cells.results:only 1 to 21 vβ subfamilies were detected in peripheral blood cd4+ and cd8+ cells from patients with cml. the most frequent expression of vβ subfamily was vβ13 followed by vβ9. clonal expanded t cells in some vβ subfamilies could be identified in both cd4+ and cd8+ cells, especially in cd8+ cells. the clonal expanded of vβ21 subfamily in cd4+ cells and vβ11 subfamily in cd8+ cells were identified most frequently.conclusion:the restricted distribution of tcr vβ repertoire has been found in cd4+ and cd8+ cells in patients with cml. clonal expanded cd4+ cells and cd8+ cells have been identified which may relate to host immune response to cml antigen and may play a important role in anticml effect.
［key words］ chronic myelogenous leukemia；t cells clonality；tcr vβ subfamilies；genescan analysis
白血病的发病与免疫功能异常有关，t细胞免疫对肿瘤有一定的控制作用，机体的免疫状态与肿瘤患者的病情变化、临床疗效、预后和存活期等密切相关，因而很有必要清楚地了解患者的免疫功能状态。Www.133229.COMcml是白血病中较常见的一种类型，通过trecs定量检测胸腺近期输出功能和pbmcs中tcr vβ 24个亚家族的基因表达、克隆性分析，结果均提示cml患者存在不同程度的中枢和外周免疫缺陷［1］。但既往是对外周血t细胞的总体研究，而不同t细胞亚群中tcr vβ亚家族的基因表达和克隆性情况尚少见报道。本研究采用rtpcr和基因扫描分析cml患者cd4+和cd8+t细胞的基因表达和克隆性，进而了解外周不同t细胞亚群的免疫功能状态。
1 材料与方法
1.1 标本 经细胞形态学、细胞组化和细胞及分子遗传学确诊的慢性期cml患者19例（男12例，女7例），中位年龄26岁（15～75岁）。分离外周血单个核细胞（pbmc），其中部分细胞利用cd4、cd8单抗（miltenyi biotec, germany）和免疫磁珠分选法（mcas）分选cd4+和cd8+t细胞（按产品说明操作）。同时收集14例正常人外周血标本作对照。
1.2 rna提取和cdna合成 依据细胞数分别采用trizol试剂盒（3×106～10×106个）和qiagen rneasy mini kit（＜3×106个）提取rna后，应用随机引物和反转录酶试剂盒（superscript ii ,gibco, brl）反转录合成cdna第一链，按常规方法进行。
1.3 rtpcr 用于非标记pcr的24个vβ引物和1个cβ引物，用于runoff reaction的5′端荧光素标记的cβfam引物均由德国柏林tib molbiol公司合成［2］。pcr按已报道的方法进行［2］。总反应体积为25 μl，其中含1 μl cdna，任一vβ引物（24个vβ引物之一）和cβ引物（0.5 μmol/l），0.1 mmol/l dntp，1.25 u taq聚合酶（promega）和1×pcr缓冲液，反应在pcr扩增仪（biometra, 德国）中进行。共进行40循环，每一循环包括：94℃ 1分钟（首次3分钟），60℃ 1分钟和72℃ 1分钟（末次10分钟），最后pcr产物保存于4℃中。
1.4 t细胞克隆性分析
1.4.1 标记pcr产物 10 μl的反应体系含2 μl未标记的pcr产物、0.1 μmol/l cβfam引物、3 mmol/l mgcl2，0.1 mmol/l dntp，0.25 u taq 聚合酶和pcr缓冲液（promega）。pcr共进行35循环，退火温度为66℃，其余同上。
1.4.2 基因扫描分析（cdr3长度分析） 有关操作步骤按使用指南进行。荧光素标记的pcr产物（2 μl）加入9.5 μl高质量的去离子甲酰胺（hidi formamide），0.5 μl genescan500 liz（abi, perkin elmer）分子量标准品。经94℃变性4分钟，立即置冰上冷却2分钟后，直接装载到3100avant全自动遗传分析仪上（abi, perkin elmer）进行毛细管电泳，最后经genemapper softwaretm v3.5分析软件分析产物的长度和荧光素强度。
2 结果
正常人外周血cd4+和cd8+t细胞几乎表达全部24个vβ亚家族，均呈多克隆性增殖，见图1。cml患者则不同，均选择性表达部分vβ亚家族，cd4+和cd8+细胞表达情况比较类似，见图2。均表达1～21个vβ亚家族，以vβ13的表达率最高（18/19例，94.74%），其次为vβ9，最低的分别为vβ20（1/19例，占5.26%）和vβ17（3/19例，占15.79%）。而患者pbmcs中平均仅表达5.89个vβ亚家族，2例患者24个vβ亚家族全部缺失，3例仅表达1个vβ亚家族，最多者表达14个。
基因扫描分析显示73.7%（14/19例）的cml患者cd4+细胞亚群有1～4个亚家族出现不同程度的克隆性增殖t细胞，这些克隆性增殖的t细胞分布在14个亚家族中，以vβ21克隆性增殖最常见，存在于36.84%（7/19例）的病人，其它亚家族中克隆性增殖的t细胞多见于1～2例病人。而在cd8+细胞中，不论是出现克隆性增殖t细胞的例数还是不同病例克隆性增殖t细胞分布的亚家族数都较cd4+增多，见图3。89.5%（17/19例）病人出现多少不等（1～5个亚家族）的克隆性t细胞，这些克隆性增殖的t细胞分布于20个vβ亚家族，以vβ11的克隆性增殖最常见，见于7例（36.84%）病人，并且有单克隆性t细胞出现。其中vβ1、vβ3、vβ4、vβ9、vβ11、vβ18和vβ20的克隆性t细胞仅见于cd8+细胞中，而vβ7的克隆性t细胞仅见于cd4+亚群。此外，在cml患者即使多克隆表达的亚家族t细胞中，基因扫描图形峰的分布也明显异常，见图4、5。
图1 正常人外周血部分cd4+和cd8+t细胞克隆性情况（略）
fig.1 a part of peripheral blood cd4+ and cd8+t cells clonality in normal individuals
图2 cml患者cd4+和cd8+细胞中tcr vβ 24个亚家族表达情况（略）
fig.2 expression of tcr vβ 24 subfamilies in cd4+and cd8+ cells from cml patients
图3 cml患者外周血cd4+和cd8+t细胞的克隆性增殖情况（略）
fig.3 peripheral blood cd4+ and cd8+t cells clonality in cml patients
图4 13例cd4+中表达tcr vβ 21基因的cml患者pcr产物的基因扫描分析结果（略）
fig.4 genescan results of tcr vβ 21 gene in cd4+ cells from 13 cml patients
note:c4,c9,c10,c12 and c15 are oligoclone；c5 is oligoclone trendency；c1 is bioclone；the others are polyclone.
图5 14例cd8+中表达tcr vβ 11基因的cmlcp患者pcr产物的基因扫描分析结果（略）
fig.5 genescan results of tcr vβ 11 gene in cd8+ cells from 14 cml patients
note:c10 is monoclone；c1 is oligoclone；c4,c8 and c11 are oligoclone trendency；c13 and c14 are biclone；the others are polyclone.
3 讨论
t细胞是执行免疫功能的主要细胞，外周血中90%以上的t细胞为αβt细胞，tcrβ基因由可变区（v）、高变区（d）、结合区（j）和恒定区（c）4 部分基因片段组成。胸腺内t细胞发育过程中v、d和j区进行完全重排而形成具有功能的tcr基因。重排过程中vβ、dβ和jβ结合的多样性和n区不同数量核苷酸的随机插入形成一个可变化的区域——vndnj，称为互补确定区3（complementarity determining regions 3,cdr3），使tcrβ链序列呈现高度多样性，不同克隆t细胞的tcr重排时cdr3长度和碱基序列有所不同，这是tcr特异地识别抗原的区域，它决定了tcr的特异性。已报道vβ基因可分为24个亚家族即vβ1～24，利用tcr vβ亚家族的特异性引物检测cdr3的长度可以作为一种特异的方法用于t细胞克隆性分析。通过分析tcr vβ的基因谱系和cdr3长度和序列，可以精确地分析不同tcr vβ亚家族t细胞的基因表达和克隆性,是目前分析t细胞克隆性最为敏感的方法［3，4］。该方法能够很好地对肿瘤患者外周血t 细胞或肿瘤浸润性t 细胞（tumour infiltrating lymphocyte, til） tcr vβ亚家族的表达和克隆性进行分析，从而深入了解机体的免疫功能和对肿瘤细胞相关抗原的特异性免疫反应情况［5］。
正常情况下，机体未受任何抗原刺激时，tcr β重排是随机的，其t细胞表现为多家族和多克隆性，但在疾病情况下，特殊的抗原刺激可引起某一个或几个亚家族的tcr针对性重排，出现克隆性增殖。本研究发现cml患者cd4+和cd8+细胞均选择性表达1～21个vβ亚家族，提示了cml患者tcr vβ亚家族优势利用的特点。若与其pbmcs相比，vβ亚家族的缺失相对较轻，这种差别可能由于单位数量的pbmcs中t细胞含量较低，某些表达量较低的亚家族未能检测到，t细胞纯化后检测的灵敏度提高。而cd4+与cd8+细胞中tcr vβ亚家族的利用情况无明显差别，且均以vβ13的表达率最高，说明cml患者外周免疫缺陷的分布在不同t细胞亚群无明显的倾向性。
t细胞识别多样性抗原依赖于tcr的多样性，即多克隆的t细胞。而在本研究中多数患者的一些vβ亚家族出现克隆性增殖的t细胞，这很可能是在cml抗原或其相关抗原的刺激下产生的具有特异性抗cml效应的t细胞克隆。因为在体外利用灭活的肿瘤细胞或肿瘤相关抗原多肽等作为特异性抗原诱导正常人t细胞扩增，结果与肿瘤患者所表现的t细胞克隆性增殖情况相似，对原刺激细胞还具有杀伤活性［6］。而在体内这些克隆性增殖的t细胞未能显示出明显的杀灭白血病细胞的作用，考虑可能与以下几方面的因素有关：①患者机体免疫功能低下，未能产生足够数量的具有杀伤活性的t细胞来对抗体内大量恶性增殖的肿瘤细胞，这从本实验室以往的研究发现cml患者胸腺近期输出功能低下的结果可以得到证明［1］；②克隆性增殖的t细胞功能不成熟，不能分泌杀伤靶细胞所需要的物质如：穿孔素和颗粒酶等；③患者体内存在抑制这些克隆性t细胞杀伤活性的因子，使其不能有效发挥作用；④白血病患者内环境紊乱，而体内杀伤过程是依赖温度、能量以及mg2+离子存在的过程；⑤肿瘤细胞增殖的速度超过了t细胞的杀伤速度等等。总之，ctl对靶细胞的杀伤是个复杂的过程，目前对这一过程以及克隆性增殖的t细胞在体内的功能意义还不清楚，仍需进一步研究。
本研究结果还表明寡克隆性增殖的t细胞主要见于cd8+细胞，可见明显的克隆性增殖接近单克隆t细胞出现，而cd4+细胞中寡克隆性t细胞相对较少，国外研究人员对bcll患者和scid异基因骨髓移植后患者t细胞克隆性分析的结果与此类似，这提示肿瘤抗原诱导ctl主要是来自cd8+细胞，与以往的特点由cd8+细胞介导的细胞毒作用相同，该特点主要是与肿瘤抗原的种类和肿瘤细胞表面mhc分子的分布有关［7，8］。肿瘤细胞主要表达mhcⅰ类分子，所以主要诱导了cd8+细胞的增殖。本研究中还发现部分cd4+细胞也呈克隆性增殖，这也提示实际上cml细胞相关抗原还是有可能诱导cd4+细胞形成，这也与近期所报道的存在抗肿瘤cd4+ctl的结果相符。
总之，本研究首先提供了cml患者外周血cd4+和cd8+t亚群细胞中tcr vβ亚家族的基因表达和克隆性增殖情况，这对于进一步研究特异性免疫治疗有重要意义。
【参考文献】
1 耿素霞,李扬秋,杨力建 et al.实时定量pcr分析cml患者胸腺近期输出功能 ［j］.肿瘤防治研究,2004;31(6):317319.
2 李扬秋,杨力建,陈少华 et al.急性单核细胞白血病病人外周血tcr vβ t细胞克隆性增殖特点 ［j］.中国病理生理杂志,2002;18(7):765769.
3 assaf c,hummel m,dippel e et al. high detection rate of t cell receptor beta chain rearrangements in tcell lymphoproliferations by family specific polymerase chain reaction in combination with the genescan technique and dna sequencing ［j］. blood, 2000;96(2): 640646.
4 李扬秋,汪明春,吴幼华.利用基因扫描分析tcr vβ亚家族的cdr3长度的方法检测t细胞克隆性 ［j］.中国免疫学杂志,1998;14(1):4850.
5 puisieux i,even j,pannetier c et al.oligoclonality of tumorinfiltrating lymphocytes from human melanomas ［j］. j immunol,1994;153(6): 28072818.
6 张玉平,李扬秋,陈少华 et al.慢性粒细胞白血病相关的tcr vβ t细胞的诱导及其限制性和克隆性分析 ［j］.中国病理生理杂志,2004;20(3):330334.
7 rezvany m r,jedditehrani m,wigzell h et al.leukemiaassociated monoclonal and oligoclonal tcrbv use in patients with bcell chronic lymphocytic leukemia ［j］. blood, 2003;101(3): 10631070.
8 sarzotti m,patel d d,li x et al. t cell repertoire development in humans with
