【摘要】 借助micro-ct评价单纯牛骨形态发生蛋白( bovine bone morphogenetic protein， bbmp)异位诱导成骨的长期三维影像学及骨质变化。(20±2) g昆明小鼠21只，麻醉后于双侧股部肌肉中植入bbmp各2 mg，分别于1、2、4、6、8、10、12周各处死3只，切取诱导分化组织，5%戊二醛固定，行micro-ct扫描和三维重建，运用aba专用骨骼分析软件测定组织矿含量 (tissue mineral content, tmc)，组织骨密度 (tissue mineral density, tmd)，骨体积分数(bone volume fraction, bvf)，结构模型指数(structure model index, smi),骨小梁厚度(trabecular thickness, tb.th),骨小梁数量(trabecular number, tb.n)及皮质骨骨密度(bone mineral density, bmd)等参数，运用spss10.0统计软件进行统计学分析。bbmp从植入2周开始逐渐形成一椭圆形骨组织块，2～4周，异位生成骨呈疏松的新生骨，4周时组织矿含量达第一个峰值，骨小梁数量最多;随着观察时间的延长(6～12周)，异位诱导生成的椭圆形骨组织内部骨小梁逐渐吸收，数量减少，12周时骨小梁数量最少;而外层骨组织逐渐塑形成为皮质骨，12周时骨矿含量值、骨小梁厚度、组织骨密度和皮质骨骨密度均达最大值。Www.133229.cOm说明bbmp具有强大的异位骨诱导能力，血供不足时，骨质降解吸收;血供充足时，骨质逐渐成熟改建。
【关键词】 骨形态发生蛋白;异位成骨;骨诱导;骨小梁;microct
the assessment of ectopic osteoinduction by bbmp using micro-ctli dan, liu min, hu yunyu, bi long, duan yonghong, jin jing, wang jun, liu yin
(institute of orthopaedics & traumatology,xijing hospital，the fourth military medical university,xi'an 710032，china)
abstract：to assess the 3-d image and changes in quality of osseous tissue produced through ectopic osteoinduction by bovine bone morphegenetic protein over an extended period by means of micro-ct.twenty-one kunming rats(20±2)g were used， 2 mg bbmp were implanted into thigh muscles of both sides of the rat under anesthesia. three animals of each were sacrificed at 1, 2, 4, 6, 8, 10 and 12 weeks after the implantation. after being harvested, the newly formed bone tissue was fixed with 5% glutaraldehyde, then successively subjected to micro-ct scan and 3-d reconstruction, measurement of tissue mineral consent(tmc) using aba software and tissue mineral density(tmd), determination of bone volume fraction(bvf), structure model index(smi), trabecular thickness(tb.th), trabecular number(tb.n), cortical bone mineral density(bmd) and other parameters, 3-d images were created and saved as tiff files; statistical analyses were carried out by anova (analysis of variance) using statistics package for social science (spss) software.at 2 weeks postimplantation, an oval mass of osseous tissue began to take shape; between 2 to 4 weeks, the ectopic-induced new bone presented as loose cancellous bone tissue, and the mineral content reached the first peak by the 4th week, showing numerous trabeculae; the innermost trabecular of the ectopic-induced lump of osseous tissue were resorbed with their number decreased with time(between 6th and 12th week), approaching the minimum by the 12th week; the outer part remodeled into cortical bone with tmc, tb.th, tmd and bmd of the lump as whole reaching the maximum by the 12th week.bovine bmp possesses strong ectopic osteoinductivity, but the newly formed bone tissue is resorbed when the blood supply is inadequate, whereas the osseous tissue remodels with progression toward a mature tissue when provided with ample blood supply.
key words：bovine bone morphogenetic protein; ectopic bone formation; osteoinduction; trabecular bone; microcomputed tomography
1 引 言
自1965年urist[1]首次报道骨形态发生蛋白异位成骨能力到1995年中国食品药品监督管理局对重组合异种骨[2](主要成分为bbmp)及美国fda相继对rhbmp临床应用的批准，bmp的研究已从实验室走向临床。但是，关于bmp仍有许多未解决的问题，例如bmp活性定量，bmp异位成骨的转归等。目前，研究主要集中在基因重组的bmp，如rhbmp-2、rhbmp-4及rhbmp-7等，反而忽视对最早通过生物化学方法提取并纯化的天然bmp的研究。既然bmp具有强大的异位骨诱导成骨能力，这种异位生成骨是否具有应用价值?其转归如何?本实验就小牛骨中生物提取bmp异位成骨过程中组织学的变化进行长期观察，借助microct了解成骨骨质变化情况，探讨这种异位生成骨进一步应用的可能性，并为bmp相关骨修复研究提供参考。
2 材料与方法
2.1 原材料与设备
bbmp (本研究所综合骨库制备)，昆明小鼠(第四军医大学实验动物中心提供)，速眠新(长春军事兽医研究所)，explore locus sp型micro-ct(美国ge公司), micview v2.1.2 三维重建处理软件，aba专用骨骼分析软件。
2.2 植入实验
(20±2) g昆明小鼠21只，麻醉后于双侧股部肌肉中植入bbmp各2 mg，分别于1、2、4、6、8、10、12周各处死3只，切取诱导分化组织，5%戊二醛固定。
2.3 标本扫描
扫描协仪： 44mltube21um150minss
扫描参数：扫描分辨率21μm，旋转角度360°，旋转角度增量0.4°，电压80 kv，电流80 μa，曝光时间3 000 ms，帧平均数为4，像素组合为1×1。
2.4 三维重建
扫描完成后，运用micview v2.1.2软件进行三维重建处理。
2.5 分析测试
aba专用骨骼分析软件分析测试以下参数：tmc，tmd，bvf，smi，tb.th，tb.n及皮质骨bmd。
2.6 统计学分析
测试数据表示为均数±标准差，用spss 10.0 统计软件处理，所有数据先行分布正态性分析和方差齐性检验，对多组均数的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，p<0.05。
3 结果
3.1 microct影像学
如图1(截取任一平面microct扫描图)所示，除bbmp植入1周时尚无放射性显影外，从2周开始均有较强的放射线显影，诱导分化的组织呈椭圆状，从4周开始，椭圆形组织块内部显影的骨小梁数量逐渐减少。表面重建影像学结果见图2，2周和4周时，组织块表面呈疏松的蜂窝状， 6周开始至12周
3.2 分析测试结果
组织矿含量(tmc)测定结果显示，在2周到4周及10周到12周两个时间段，组织矿含量有一个加速增加的过程， 4周到8周趋于平稳而略有下降，8周到10周则缓慢上升(见图4a)，除10周与6周外，其他任何两组间比较均有显著统计学意义;组织骨密度(tmd)测定结果显示， 从2周到8周，tmd呈缓慢上升趋势，从8周开始到10周加速上升(见图4b)，除10周与12周外，其余各组间比较均有统计学意义;骨体积分数(bvf)总体呈现下降趋势(见图4c)，但变化不明显，两组间仅2周和12周比较具有统计学意义;结构模型指数(smi)测定结果显示，2周到4周时间段，smi下降，4周到6周，smi上升，而从6周开始至12周，smi持续下降(见图4d)，除2周与6周，4周与10和12周外，其余组间比较均有统计学意义;骨小梁厚度(tb.th)测定结果显示，2周到4周和10周到12周时间段，骨小梁厚度变化平稳，组间比较无统计学意义，从4周到10周呈加速变宽，组间比较均有显著统计学意义(见图4e);骨小梁数量(tb.n)在4周时最大，且从此加速下降，至8周趋于平稳(见图4f)，除2周外，4周与其他各组比较均具有显著统计学意义，而6、8、10及12周两两比较均无统计学意义;皮质骨骨密度(bmd)测定结果显示，2周到8周，各组间比较无统计学意义，皮质骨骨密度无明显变化，从8周开始到10周时间段快速增加(见图4g)，2、4、6及8周与10和12周比较均有统计学意义。不同时间点各参数值见表1。
4 讨论
寻找理想的骨移植替代物始终是骨移植与骨修复研究领域的热门课题。即使临床已经应用的替代物如自体骨、异体骨及各种人工骨和一些初步临床应用的个体化设计的组织工程骨均不同程度存在诸如取骨量有限、存在潜在病毒感染、免疫排斥反应、新骨形成和材料降解不匹配等诸多问题。因此，有学者开始考虑能否利用bmp异位骨诱导作用将异位生成骨用于骨移植[3-5]。kusumoto等[6]以i型胶原为rhbmp-2载体在wistar大鼠肌肉中异位预制了血管化的骨组织，inoda等[7]以胶原海绵为rhbmp-2载体于wistar大鼠肌肉中异位构建骨组织，3周时用于修复骨缺损，并与自体骨，异体骨进行了比较，实验结果令人满意。然而cooley等[8]对rhbmp-2异位成骨进行的长期观察研究表明，这种皮下或肌肉内注射rhbmp-2所诱导生成的异位骨与在骨性组织中长期存在的新生骨不同，异位成骨是短期成骨，异位新生骨会发生吸收，在4周时完全丧失钙化特征，在其设计的9组实验中，除4组皮瓣组外，其它5组新生骨在4～5周时均全部消失。
本实验直接将从小牛皮质骨中提取的天然bmp(二次纯化离心所得的块状沉淀2mg)未加任何载体，单独植入小鼠股部肌肉中， microct三维重建发现，除bbmp植入1周时尚无放射性显影外，从2周开始均有较强的放射线显影，诱导分化的组织呈椭圆状，2周到4周时，组织块表面呈疏松的蜂窝状， 6周开始至12周则逐渐光滑致密，皮质骨骨密度自2周逐渐增加至12周时最高，很好地印证了影像学所见，与cooley等所观察到的rhbmp异位生成骨在4～5周时全部消失不同，bbmp所诱导的异位生成骨4周后仍存活并在改建中。表1 不同时间点各参数值
三维重建图像显示， 2、4、6周时异位新生骨以疏松的骨小梁形成椭圆形组织块，后期则内部骨小梁数量逐渐减少，外部钙化加强，骨质改建，与检测得到的组织矿含量(tmc)和组织骨密度(tmd)总体均呈上升趋势及骨小梁数量(tb.n)逐渐下降的结果相吻合;骨体积分数(bvf)即骨体积占总体积的比例在本组实验中也呈下降趋势，从另一个侧面证明了骨小梁数量的减少;结构模型指数(smi)是通过计算骨骼表面的曲率来描述骨小梁板状和杆状的程度的指数，理想的板状骨小梁和杆状骨小梁的smi数值分别为0和3，发生骨质疏松时，骨小梁从板状向杆状转变，smi数值增加[9]。本组实验中，smi值在6周时为最高约2.07，在12周时为最低约0.81，即6周时骨小梁接近杆状，而12周时接近板状，骨质明显改建;本组实验中骨小梁平均厚度(tb.th)持续增加则更加充分地说明了骨小梁的进一步改建。
seiya等[10]以βtcp作为rhbmp-2载体在体内肌肉中异位构建血管化的自体骨，结果表明，血管化在异位骨的形成和维持中起着至关重要的作用。本实验直接异位植入块状bbmp，诱导形成的椭圆形组织块外周被肌肉所包绕，有着丰富的血供，骨质未见明显吸收，而组织块内部，由于没有载体支架，血管长入困难，血供差，部分骨小梁逐渐吸收降解，提示血供在异位骨的形成和维持中可能起着重要作用，后续实验应将进一步探讨血管化和血供在bbmp异位成骨中的作用。
bbmp无需任何载体即可在肌肉中异位成骨，本实验椭圆形异位骨组织块内骨小梁在4周以后开始吸收减少，但内部残存骨小梁和外层骨质不仅持续存活，而且，骨质进一步塑形改建，提示bbmp异位生成骨存在潜在的应用价值。
【参考文献】
[1]urist mr. bone formation by autoinduction[j].science, 1965，150(698)：893-899.
[2]胡蕴玉，陆裕朴，刘玮. 重组合异种骨的实验研究与临床应用[j]. 中华外科杂志，1993;31：709-712.
[3]於丽明，王佐林. bmp2诱导骨骼肌成骨的研究进展[j].口腔颌面外科杂志, 2008, 18(4): 300-303.
[4]kazuya yoshida，kazuhisa bessho，kazuma fujimura，et al.osteoinduction capability of recombinant human bone morphogenetic protein-2 in intramuscular and subcutaneous sites: an experimental study[j]. journal of cranio- maxillofacial surgery, 1998, 26:112-115.
[5]kanczler j m,ginty p j, barry j a, et al. the effect of mesenchymal populations and vascular endothelial growth factor delivered from biodegradable polymer scaffolds on bone formation[j]. biomaterials, 2008, 29:1892-1900.
[6]kusumoto k,bessho k,fujimura k, et al. prefabricated muscle flap including bone induced by recombinant human bone morphogenetic protein-2: an experimental study of ectopic osteoinduction in a rat latissimus dorsi muscle flap[j].british journal of plastic surgery , 1998 , 51: 275-280.
[7]inoda h，yanmmoto g，hattori t.rhbmp2 induced ectopic bone for grafting critical size defects： a preliminary histological evaluation in rat calvariae[j].int j oral maxillofac surg, 2007, 36(1):39-44.
[8]cooley bc， daley ra，toth jm.long-term bmp-2 induced bone formation in rat island and free flaps[j]. microsurgery, 2005, 25(2): 167-173.
[9]hildebrand t,ruegsegger p. quantification of bone microarchitecture with the structure model index[j]. comp meth biomech miomed eng，1997;1:15-23.
[10]seiya jingushi, ken urabe, ken okazaki, et al. intramuscular bone induction by human recombinant bone morphogenetic protein-2 with beta-tricalcium phosphate as a carrier: in vivo bone banking for muscle-pedicle autograft[j]. j orthop sci , 2002, 7:490-494.
