【关键词】 ho1; 急性肺损伤; mmp2; mmp9
【摘要】 目的 通过复制急性肺损伤模型，探讨血晶素诱导血红素加氧酶1(heme oxygenase1， ho1)的表达对于小鼠急性肺损伤的影响。方法 利用逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹方法检测急性肺损伤小鼠肺组织基质金属蛋白酶2 (matrix metalloproteinas2， mmp2)、mmp9 mrna和ho1蛋白的表达。结果 血晶素加脂多糖组和对照组比较，ho1蛋白表达明显增高 (p<0.05);脂多糖组与对照组比较，mmp2 mrna和mmp9 mrna表达差异有统计学意义(p<0.05)，血晶素加脂多糖组与对照组比较，差异无统计学意义(p>0.05)。结论 ho1降低了急性肺损伤小鼠肺组织mmp2、mmp9 mrna的表达，对于小鼠的急性肺损伤有保护作用。
【关键词】 ho1; 急性肺损伤; mmp2; mmp9
expression of hemin-induced ho1 and its effects on mmp2mrna,mmp9mrna in mice with acute lung injury zhang jianwu, xing zhiwei. hebei provincial chest hospital,shijiazhuang 050041,china
【abstract】 objective to investigate the effect of expression of hemin-induced (heme oxygenase1)ho1 on mice with acute lung injury by reproducing the model of acute lung injury.methods the rtpcr and western blot methods were used to detect the expression of matrix metalloproteinase2(mmp2),mmp9mrna and ho1 in mice with acute lung injury.results the expresion of ho1 in hemin+lps group was significantly increased, as compared with that in control groups(p<0.05). there were significant differences in the expressions of mmp2mrna and mmp9mrna between lps group and control group(p<0.05),however, there were no significant differences in the expressions of mmp2mrna and mmp9mrna between hemin+lps group group and control group(p>0.05).conclusion ho1 can downregulate the expression of mmp2 and mmp9mrna in mice with acute lung injury,as a result,which has a protective effect on acute lung injury of mice.
【key words】 ho1; acute lung injury; mmp2; mmp9
血红素加氧酶(heme oxygenase,ho)是血红素代谢过程中的起始酶和限速酶，可以降解血红素。WWw.133229.COm在人和哺乳动物体内共有3种ho的同工酶：ho1、ho2、ho3。其中ho1为诱导型，又称为热休克蛋白32， 研究发现血晶素可以诱导ho1的高表达[1]。急性肺损伤(acute lung injury, ali)是以肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞广泛损伤为病理特征的一种失控的炎性反应，是全身炎性反应综合征所致多器官功能障碍综合征的肺部表现。本研究通过复制脂多糖(lipopolysaccharide，lps)诱导的急性肺损伤小鼠模型，检测血晶素诱导ho1的高表达对肺组织中基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinas2，mmp2)、mmp9 mrna的影响，为临床ali的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂：lps和血晶素为sigma公司产品;trizol试剂为invitrogen公司产品;reverse transcription system和gotaq green master mix均为promega公司产品;dna maker为北京天根生化科技有限公司产品;兔抗鼠ho1多克隆抗体美国santa cruz公司产品。
1.1.2 实验动物：雄性balb/c小鼠(清洁级)40只，10～12周龄，体重19～22 g，由河北省实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 实验分组与给药方法：随机分为4组：对照组、脂多糖组、血晶素加脂多糖组和血晶素组，每组10只。脂多糖组：腹腔注射脂多糖，20 mg/kg;血晶素加脂多糖组：腹腔注射脂多糖前2 h给予血晶素，30 mg/kg;血晶素组：腹腔注射血晶素，30 mg/kg;对照组：在相同时间点注射等体积的0.9%氯化钠溶液。
1.2.2 肺组织ho1蛋白表达的western blotting检测：注射lps或0.9%氯化钠溶液后6 h后脱臼处死，取左肺组织称重、剪碎，加入组织裂解液于4℃下匀浆，冰上放置1 h，4℃ 12 000 r/min离心15 min，吸取上清，分装。应用考马斯亮蓝法进行蛋白质浓度检测，其余置-80℃保存。每组取50 μg样品蛋白行8% sds聚丙烯酰胺凝胶电泳后，采用水浴式电印迹方法转膜，电压90 v转膜3 h。取出pvdf膜，应用封闭液(5%脱脂奶粉)室温封闭1 h，洗膜后加入稀释的一抗(以适当比例稀释)，4℃密封过夜。洗膜后，加入稀释的二抗，37℃放置1 h，再洗膜后加入显色剂进行检测，用凝胶图像成像系统拍摄实验结果，分析ho1和gapdh蛋白条带的吸光度值。用吸光度值代表ho1蛋白的表达量。
1.2.3 半定量rtpcr技术检测：每只小鼠取右侧肺叶，立即放入depc处理过高压消毒的ep管中，置入液氮罐中，用于半定量rtpcr技术检测mmp2、mmp9 mrna表达。用trizol试剂提取肺组织的总rna后，检测其完整性和浓度。提取的总rna按照promega的试剂盒reverse transcription system说明进行反转录，合成cdna，然后进行pcr扩增。各基因mmp2、mmp9、βactin引物序列如下：mmp2引物序列是上游为5'caccatcgcccatcatcaagt3'，下游为5'tggattcgagaaaagcgcagcgg3'，扩增片段长度为399 bp;mmp9引物序列是上游为5'gctttcggctgcagctctgctg3'，下游为5'gaggcctttgaaggtttggaat3'，扩增片段长度为305 bp;βactin引物序列是上游为5'gtgggccgctctaggcacca3'，下游为5'cggttggccttagggttca ggggg3'，扩增片段长度为244 bp。pcr扩增条件如下：95℃ 3 min;94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，循环35次;72℃ 10 min;4℃。取pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统分析并拍摄图像，mrna表达相对值=目的片段的光亮度值/βactin的光亮度值。
1.3 统计学分析 应用spss 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，p<0.05表示有统计学意义。
2 结果
2.1 western blotting半定量检测肺组织ho 1蛋白表达的变化 对照组小鼠肺组织表达较弱的ho1蛋白，小鼠给予血晶素后，能诱导肺组织的ho1表达，血晶素组条带亮度明显增加。ho1的蛋白表达变化结果显示，脂多糖组吸光度值和对照组比较，差异无统计学意义(p>0.05)，而血晶素加脂多糖组吸光度值和脂多糖组比较，差异有统计学意义(p<0.05)。见表1，图1。
2.2 rtpcr检测结果 对照组mmp2和mmp9 mrna都有弱表达;脂多糖组，两者表达增加，与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05);血晶素加脂多糖组，两者表达明显降低，与脂多糖组比较差异有统计学意义(p<0.05);血晶素加脂多糖组与对照组比较，两者表达水平差异无统计学意义(p>0.05)。见表2，图2。表1 4组小鼠肺组织ho1蛋白表达吸光度值表2 4组小鼠肺组织mmp2、mmp9 mrna表达相对值
3 讨论
mmps是细胞外基质(extracellular matrix,ecm)重要降解酶，是自然界进化中高度保守的一组锌离子依赖性蛋白水解酶，属于锌肽酶超家族，是细胞外基质降解的主要介质。急性肺损伤时某些基质金属蛋白酶分泌增加，可加速ecm的降解，造成肺组织的广泛破坏。
mmp2和mmp9是降解细胞基底膜的主要组分ⅳ型胶原的重要酶类，它们的分泌和激活可导致气道上皮和血管内皮通透性增加，严重时可导致其结构破坏。mmp2又称明胶酶 a，能降解ⅳ型胶原和层粘连蛋白等多种胶原。研究表明，正常肺组织中 mmp2呈弱表达，而脂多糖和前炎症细胞因子tnfα[2]能促进mmp2的表达 。torii 等[3]研究发现，急性呼吸窘迫综合征(ards)患者支气管肺泡灌洗液中 mmp2浓度显著高于正常者，提出有胶原溶解活性的 mmps可能在ards的发病机制中起重要作用。肺组织的 mmp9 主要由炎性细胞产生，包括中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸粒细胞和淋巴细胞。lps暴露可致各种动物模型支气管肺泡灌洗液balf 的 mmp9 的增加[4]。研究发现脂多糖可以介导大量多核中性粒细胞浸润的急性肺部炎症，其血液中分叶核中性粒细胞向血浆释放 mmp9 增加[5]，这些研究发现提示mmp9 参与急性炎症过程。
本实验通过复制脂多糖致小鼠ali模型，对肺组织中两种主要基质金属蛋白酶基因含量同时进行检测，初步探讨ho1的诱导表达对小鼠ali的保护作用。westernblot的实验结果显示，小鼠肺组织ho1蛋白在血晶素加脂多糖组的表达相对较高，由此我们可以看出血晶素可以诱导ho1的表达。rtpcr结果显示，对照组小鼠肺组织mmp2、mmp9 mrna 表达很低，注射 lps 后6 h，两者在转录水平的表达明显增高，与对照组比较差异有统计学意义(p<0.05)，此实验结果与先前研究结果一致，mmp2、mmp9与小鼠的急性肺损伤密切相关。而对于预先注射血晶素的急性肺损伤小鼠，mmp2、mmp9 mrna的表达明显下降，血晶素加脂多糖组与对照组比较，差异无统计学意义(p>0.05)，可能由于ho1的诱导表达，发挥了抗炎、抗氧化、抗增生等作用[6，7]，因此血晶素对于小鼠的急性肺损伤有保护作用。但是，ho1的诱导表达及保护作用机制还有待于进一步的探讨。
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