【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶9及其抑制剂timp1在大鼠弥漫性脑损伤后早期的表达变化与继发脑损伤的关系。方法 荧光实时定量rtpcr分别测定mmp9mrna和timp1mrna在大鼠弥漫性脑损伤早期不同时程的表达，干湿重法测定脑水分含量，光镜和电镜观察血脑屏障结构的变化。结果 与假手术对照组相比，外伤后1h大鼠脑组织中mmp9mrna开始增加，伤后12h达到高峰并持续7d（p<0.01）；timp1mrna表达6h明显升高，24h达高峰，表达量增加1倍，并持续7d（p<0.01）。脑组织含水量比假手术对照组明显增加，光镜及电镜下可见炎性反应和毛细血管的超微结构破坏、神经元变性水肿和坏死，72h损伤最重。 结论 大鼠外伤后诱导mmp9mrna和timp1mrna表达增加，可能参与了弥漫性脑损伤后早期脑水肿和神经元损伤的继发脑损害病理过程。
【关键词】 脑损伤 明胶酶b 金属蛋白酶1组织抑制剂 血脑屏障 大鼠 sprague dawley
metalloproteinase1 after diffuse brain injury and their significance in rats
song linjie1, zhang xiuping2, wang chong1, dong yanan1,
jiang yong1, zhao hongyang3, zhu xianli3
(1. deparment of neurosurgery, jinan central hospital affiliated to shandong university, jinan 250013, china;
2. central laboratory, jinan central hospital affiliated to shandong university, jinan 250013, china;
3. deparment of neurosurgery, tongji medical college of huazhong university of science and technology, wuhan 430022, china)
to explore whether expressions of matrix metalloproteinase9 and tissuce inhibitor of metalloproteinase1 in early diffuse brain injured tissues have a correlation with second brain injury in rats. methods realtime quantitative pcr was used to determine expressions of mmp9mrna and timp1mrna, the drywet method to determine the containing water measure in the brain, and histological techniques and electron microscopy to determine the ultrastructural blood brain barrier at different timepoints after diffuse brain injury in rats. results compared with the shamoperated group, expression of mmp9mrna started to increase at the first hour, peaked at the 12th hour(p<0.01) and persisted up to one week. expression of timp1mrna also peaked at the 24th hour and persisted up to one week (p<0.01). ultrastructures of the neurons were injured, edema and necrosis were diffuse and distinct at the 72 th hour under light microscopy and electron microscopy. conclusions expressions of mmp9mrna and timp1mrna are increased after diffuse brain injury in rats, indicating that mmp9 and timp1 are closely related to brain edema and neuronal damage in early second brain injury in rats.
key words: brain injury; gelatinasc b; tissue inhibitor of metalloproteinase1; blood brain barrier; rats, spraguedawley
近年来的研究已经证实，基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase，mmp9）及金属蛋白酶1组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase1，timp1）之间的平衡参与了细胞外基质的重塑，和骨关节炎、血管形成、肿瘤转移和炎症反应密切相关。WWW.133229.cOM在脑出血中参与了脑水肿、神经元损伤和血脑屏障的破坏等继发脑损害的病理过程，这一病理过程的恶化进展常使死亡率和神经功能缺失增加。但在弥漫性脑损伤中，mmp9和timp1也是否参与这一继发损害的过程而与患者预后有密切关系，本研究通过观察大鼠marmarou弥漫性脑损伤模型［1］中二者的表达变化，探求其与继发脑损害的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 将健康成年雄性sd大鼠90只（由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供），体质量325～375g，随机分为9组，即假手术对照组10只、外伤组80（分为外伤后1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、7d各10只）。
1.2 动物模型 按照marmarou等的方法制作弥漫性脑损伤模型，即用450g的铜砝码经有机玻璃管内从2m高处自由落下，通过直径1cm厚0.3cm的金属垫片打击大鼠造成弥漫性脑损伤，垫片用胶粘贴于颅顶正中即冠状缝和人字缝之间。大鼠俯卧固定于已知弹性系数的海绵床上。当砝码落于垫片上时立即移开海绵床以免再次打击伤。立即将大鼠移至手术台上观察，必要时呼吸机辅助呼吸，假手术组麻醉后解剖气管和放置垫片，不做打击。伤后严密观察并心电监护，呼吸机备用。大鼠清醒后笼中饲养，自由进食水。至规定时间处死。
1.3 脑组织含水量的标本收集 大鼠断头处死后快速冠状切取冠状缝和人字缝之间的部分脑组织，去除软脑膜和凝血块，冰等渗盐水冲洗后迅速投入液氮保存备用。同时同样切取约100mg脑组织一块，在精度为1%的分析天平上称湿重。于105℃烘箱内干燥至恒重（两次干重之差≤0.001mg）, 再称干重。根据elliott［2］公式计算脑组织含水量,脑组织含水量＝（湿重-干重）/湿重×100％。
1.4 组织切片及电镜取材 常规以等渗盐水和40g/l的多聚甲醛心脏灌注后，冠状切取大鼠脑组织后固定、石蜡包埋，5μm连续切片备用。在pcr取材的同时切取皮层组织迅速投入25g/l戊二醛缓冲液中固定5～10min，等组织稍变硬修整为1mm3大小，室温固定2h后送电镜室常规电镜处理，包埋超薄切片，透射电镜（德国opton em10c型）下观察、拍照，记录。
1.5 mmp9mrna提取和实时rtpcr定量测定 取无菌留取的大鼠脑组织各约50mg，以trizol一步法提取总rna（promega公司，美国）采用荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应（rtpcr）技术对逆转录-扩增产物进行定量分析。primer5.0设计的mmp9引物序列，5′caccgccaactatgaccagga3′（正义链），5′aagacgaaggggaagacgcac3′(反义链)，扩增片断约为111bp。荧光探针序列：5′famactgtaactgggggcaactcggcagtamra3′，以βactin为内参照，上游引物为：5′agc aga gaa tgg aaa gtc aaa3′；下游引物为：5′atgctgcttacatgtctcgat3′。
timp1引物：5′cctgtagctgtgccccaac3′（正义链），5′ggcgaaccggaaacctgtg3′（反义链），扩增片断为185bp,荧光探针序列5′famcccacccacagacagctttctgctamra3′。以βactin为内参照，上游引物为：5′agc aga gaa tgg aaa gtc aaa3′；下游引物为: 5′atgctgcttacatgtctcgat3′(以上引物均由上海博亚生物有限公司合成)。在延伸的过程中搜集荧光信号于每次扩增的同时设置无cdna的阴性对照。结果由ftc2000型实时荧光定量pcr仪（上海枫岭生物技术有限公司）自带分析软件进行分析。
1.6 统计学处理 采用spss11.0软件，实验数据用
2 结 果
2.1 外伤后脑组织含水量的变化 大鼠外伤后不同时间脑组织含水量分别为1h(78.5±0.2)％、3h(80.0±1.0)％、6h(80.2±0.3)％、12h(80.3±0.9)％、24h(80.9±0.1)％、48h(80.5±0.4)％、72h(80.2±0.2)％、168h(80.0±0.5)％，24h、48h为高峰，之后有所下降，7d下降但仍高于假手术对照组。其中外伤后6h、24h、48h、72h较假手术对照组（78.1±0.1）％高（p<0.05），不同时间点组之间差异有统计学意义。
2.2 大鼠脑组织中mmp9mrna的表达 假手术对照组mmp9mrna表达极低，伤后1h即可见其表达升高，表现为荧光强度值增加，呈上升趋势。表1中各组内参βactin与mmp9的荧光强度差值（ct1ct2）代表mmp9mrna的实际表达量。12h表达量达高峰期，持续至7d，72h表达量最高。假手术对照组与12h～7d组相比有显著性差异（p<0.01），1h组与24h～7d组、3h组与72h组比较差异均有统计学意义（p<0.05），余各组差异无统计学意义。表1 mmp9mrna在大鼠脑组织中的表达
2.3 大鼠脑组织中timp1mrna的表达 本研究发现，假手术对照组timp1mrna表达极低，外伤后1h可见其表达增加，表现为荧光强度值增加，呈上升趋势。表2中各组内参βactin与timp1mrna的荧光强度差值（ct1ct2）代表timp1mrna的实际表达量。6h明显升高，24h表达量达高峰，表达量增加1倍，并持续至7d。假手术对照组与12h～7d组相比差异有统计学意义（p<0.01），1h组与24h～7d组相比，3h组与72h组比较差异均有统计学意义（p<0.05），余各组差异无统计学意义。见图1。 表2 假手术对照组和外伤组大鼠脑组织中timp1mrna的表达
2.4 外伤后脑组织形态学变化 光镜下与假手术对照组相比，外伤后3h即可见脑组织血管内皮细胞轻度肿胀，血管壁通透性增加，多形核白细胞和单核巨噬细胞等炎性细胞附壁，部分浸润脑实质。6h时这一现象明显，48h和72h时可见大量的多型核白细胞和单核巨噬细胞积聚在水肿带。同时72h时水肿明显，神经元胞质呈严重缺血性改变，神经元细胞形态不规则，核固缩，周围可见空隙，胶质细胞肿胀。血管周围可见水肿，渗出。假手术对照组却无此现象出现（图2a）。
电镜下外伤后6h胞浆空泡增多扩大，线粒体内质网肿胀，游离核糖体增多。24h胞浆中出现大小不等的空泡，核染色质逐渐向中央聚集成轮廓不规则的团块。72h线粒体空泡结构更明显甚至消失，微管微丝断裂。核膜迂曲甚至断裂，核仁偏移消失，胞体内容物外溢（图2b）。
3 讨 论
基质金属蛋白酶是一类以zn2+为辅助因子的蛋白酶家族，在体内主要降解细胞外基质，引起一系列疾病的病理生理变化，其活性的变化亦受周围环境的影响。其作用底物主要包括胶原、纤维连接蛋白和基膜。脑组织中多种细胞可产生mmp，包括神经元、胶质细胞、小胶质细胞、毛细血管内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞，其中mmp9是较为重要的一种。研究表明，mmp9除参与了脑肿瘤的侵袭外，在脑出血和脑缺血［34］的急性损伤过程中起着重要的作用。timp1是timps家族的一个成员，分子量为28.5kda的一种可分泌的糖蛋白。它是含有一个n末端和一个c末端的二聚体，n末端以非共价键的形式结合到mmp9基底活化的zn离子结合位点上，从而1∶1的在蛋白水平对mmp9的活性起到抑制作用。
绝大多数颅脑损伤的死亡和病残都与创伤后出现的继发性脑损害关系密切。继发脑损伤的病理生理变化是个复杂过程，参与因素较多，伤后脑水肿及血脑屏障（blood brain barrier, bbb）的破坏是继发缺血性改变的重要表现之一，而其引起颅内压增高的是早期致脑疝甚至死亡的主要原因，脑水肿引起脑血流的进一步降低形成恶性循环。脑组织中bbb主要由毛细血管内皮细胞、血管基底膜以及胶质细胞终足构成，血管基底膜与间质内的细胞外基质(extracelluar matrix, ecm)是维持bbb完整结构的重要结构基础，mmp9能降解血管基底膜，包括胶原、纤维连接蛋白和基膜，血管壁遭到破坏，打破了bbb的结构完整，通透性增加，导致血管源性脑水肿。
本实验对大鼠脑组织外伤后脑水分含量的定量测定发现，脑水分含量达高峰期后持续至7d，这与mmp9mrna的峰值持续相似，提示了可能mmp9通过对基膜的降解导致血管源性脑水肿发生，二者是密切相关的。同时经光镜及电镜观察发现外伤后脑水肿和bbb的结构破坏短期内就出现，3h即可发现大鼠脑组织内发生了炎症反应，血管内皮肿胀，炎性细胞浸润至血管周围并水分积聚。24h水肿加剧，含水量明显增加，72h时毛细血管已经严重损伤，这与国内学者杨治权等［5］对大鼠弥漫性脑损伤后脑缺血的研究结果一致。外伤后发生缺血缺氧，导致微循环障碍，最终bbb结构破坏，神经细胞的代谢活动紊乱，使脑组织发生了继发脑损伤。组织学和超微结构的变化与mmp9mrna的表达变化基本一致，同时也从mmp9的作用机制角度解释了外伤后血管源性脑水肿的发生原因。
timp1通过抑制mmp9对ecm成分的降解稳定血脑屏障的结构，并可减少谷氨酸介导的钙离子内流引发的兴奋性毒作用［6］。脑缺血后mmps增加，二者之间的平衡被打破，mmps的净活性增加就会导致ecm的降解，bbb通透性增加。同时内源性timp1随之增加，保持二者相对平衡的状态，timp1通过影响细胞增殖、生存、和凋亡在脑缺血中起到脑保护作用［7］。在中枢神经系统损伤模型中，原位免疫研究证实了增生的星形细胞分泌timp1，在病毒感染所致炎症中，胶质细胞中timp1mrna表达上调导致mmps和timps比例失衡，提示着timp1的脑保护作用［89］。von gettern等［10］对大鼠脑挫裂伤的研究证实，mmp9mrna 在外伤后24h即明显升高，96h达最高峰。timp1mrna 4h明显升高，24h达到高峰并持续到4d, 2w下降至对照水平。本研究结果表明，外伤后大鼠脑组织中mmp9mrna 1h其表达升高，12h表达量达高峰期，持续至7d，72h表达量最高。假手术对照组timp1mrna表达极低，外伤后1h可见其表达增加，6h明显升高，24h达到高峰，表达量增加一倍，持续至7d。这一结果与前者类似，但是表达变化出现的时间和峰值持续时间存在一定的差异，分析可能因为采用的动物模型不同，实验方法有差异，同时存在一定的主观因素。同时对比mmp9mrna与timp1mrna的表达趋势可以发现，二者的这种平衡变化可能也参与了神经元的损伤与修复过程。
总之，本研究通过对大鼠弥漫性脑损伤的研究发现，外伤诱导了mmp9mrna和timp1mrna的表达增加，可能通过参与弥漫性脑损伤后早期血管源性脑水肿、炎症反应和神经元损伤等病理过程加重了继发脑损害。
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