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肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白对佐剂性关节

2015-07-03 12:25 来源:学术参考网 作者:未知
肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中tnfα、hif1α和vegf表达的影响

【关键词】 佐剂性关节炎;大鼠;可溶性重组人肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白;肿瘤坏死因子α;缺氧诱导因子1α;血管内皮生长因子


【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(益赛普)对佐剂性关节炎大鼠滑膜中肿瘤坏死因子α(tnfα)、缺氧诱导因子1α(hif1α)、血管内皮生长因子(vegf)表达的影响。方法 将成年雄性wistar大鼠随机分为5组,ⅱ~ⅴ组建立佐剂性关节炎大鼠(aa)模型,于造模后第12天开始ⅲ组给予甲氨喋呤灌胃治疗,ⅳ~ⅴ组给予益赛普皮下注射治疗。第28天取膝关节滑膜,常规he染色,计算滑膜病理积分,免疫组织化学染色检测tnfα、hif1α和vegf在膝关节滑膜的表达。结果 ⅰ组大鼠滑膜组织均有少量tnfα、hif1α和vegf的表达,ⅱ~ⅴ组较ⅰ组均明显增高。ⅳ、ⅴ组滑膜组织tnfα表达较ⅱ组明显减低(p<0.01)而ⅲ组与ⅱ组差异无统计学意义。ⅲ~ⅴ组滑膜组织hif1α、vegf的表达均明显低于ⅱ组,差异有统计学意义(p<0.01)。结论 益赛普可明显降低aa大鼠滑膜组织tnfα、hif1α和vegf表达。益赛普可以降低aa大鼠的关节炎指数、足体积,减轻足肿胀程度,对aa大鼠的关节炎症有明显的治疗作用。WWW.133229.cOM

【关键词】 佐剂性关节炎;大鼠;可溶性重组人肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白;肿瘤坏死因子α;缺氧诱导因子1α;血管内皮生长因子

 the effect of rhutnfrfc on the levels of tnfα,hif1α and vegf in synovium of adjuvant arthritis in rats xu yudong*,jin hongtao*,song xinmei,et al.*department of rheumatology,the second hospital of hebei medical university,shijiazhuang 050000,china

  【abstract】 objective to investigate the changes of levels of tnfα,hif1α and vegf in in synovium of adjuvant arthritis (aa) in rats after injection with rhutnfrfc (etanercept).methods the adult male wistar rats were randomly divided into 5 groups:the aa model was induced with freund complete adjuvant,on the 12th day after induction,the rats in group ⅲ were given with mtx (2.7 mg/kg) by intragastric administration;the rats in group ⅳ,ⅴwere given with etanercept by subcutaneous injection.the arthral pathological score was calculated,the levels of tnfα,hif1α and vegf were detected by histoimmunochemical staining at different stages after cfa inoculation.results the tnfα,hif1α and vegf levels in experimental group were higher than that in control group.the levels of tnfα in group ⅳ,ⅴ were significantly lower than those in group ⅱ,however,there was no significant difference between group ⅲ and group ⅱ.the levels of hif1α and vegf in group ⅲ,ⅳ,ⅴwere significantly lower than those in group ⅱ(p<0.05). conclusion etanercept is able to reduce significantly the levels of tnfα,hif1α and vegf in synovium tissue of rats with aa,and which is able to decrease arthritis indexes and foot volume,as a result,which is effective in treating adjuvant arthritis of rats.

  【key words】 adjuvant arthritis rat;rhutnfrfc;tumor necrosis factorα;hypoxiainducible factor1α;vascular endothelial growth factor

  类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,ra)是一种慢性进行性自身免疫性疾病,以关节滑膜炎,对称性和破坏性关节病变为主要特征[1]。血管新生促进滑膜血管翳的发生和发展,维持血管翳的侵袭性,促进软骨和骨破坏及关节重构,最终造成关节畸形、强直和功能丧失。缺氧诱导因子1(hif1)、血管内皮生长因子(vegf)是促进血管新生的关键因子,可能在ra发病机制中起重要作用。在细胞因子相互作用的网络中肿瘤坏死因子α(tnfα)居于中心位置,是ra滑膜炎发生和持续的一个关键性因子[2]。本试验以佐剂诱导的关节炎大鼠模型为基础,观察肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(益赛普)对关节炎的影响,评价其疗效,探讨益赛普治疗ra的机制、临床应用价值及其对滑膜组织血管增生的抑制情况。

  1 材料与方法

  1.1 动物与试剂 wistar大鼠90只,雄性,体重140~160 g,由河北省实验动物中心提供,合格证号 802120,许可证号scxk(冀) 20031003。

  完全弗氏佐剂(fca,10 ml)购于sigma公司,卡介苗(bcg,50 mg/支) 购自华瑞创新生物科技开发中心。tnfα免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物制品公司,vegf免疫组化成套试剂盒购自晶美生物制品公司。

  1.2 分组及aa大鼠模型的建立 将90只雄性wistar大鼠采用数字表法随机分为5组,分别编号ⅰ~ⅴ组,ⅰ组10只,ⅱ~ⅴ组每组20只。ⅰ组为正常对照组,ⅱ组为单纯造模组,ⅲ组为造模+甲氨喋呤组,ⅳ组为造模+益赛普低剂量组(0.44 mg/kg),ⅴ组为造模+益赛普高剂量组(0.88 mg/kg)。将fca与卡介苗配置为含bcg 10 mg/ml 的水包油乳剂。试验第1天在ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ组大鼠的尾根部皮内注射该乳剂0.2 ml致炎,诱发佐剂性关节炎。而ⅰ组大鼠的尾根部皮内注射等量0.9%氯化钠溶液。

  1.3 给药 于致炎后第12~23天ⅳ、ⅴ组皮下注射益赛普,ⅳ组予以益赛普0.44 mg·kg-1·d-1,ⅴ组予以益赛普0.88 mg·kg-1·d-1。给药容积均为0.1 ml/100 g,连续12 d。ⅲ组大鼠给予甲氨喋呤2.7 mg/kg灌胃,ⅱ组大鼠给予蒸馏水灌胃0.5 ml·只-1·d-1;给药时间均固定在每天上午9∶00。

  1.4 测量足体积及关节炎指数(ai)的评定 于实验的第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27天用排水法测右足体积,分别测量3次,取平均值。根据关节红肿程度进行ai的评定,标准[3]如下:0分:无关节炎;1分:个别足趾发红、肿胀;2分:大部分足趾及足底肿胀;3分:踝关节以下肿胀;4分:肿胀累及踝关节以上,不能负重;ai=四肢关节评分之和。

  1.5 病理学及免疫组织化学检测 于致炎后第28天,处死所有大鼠并取膝关节滑膜组织,置于4%多聚甲醛固定液中固定,以备作病理及免疫组织化学检测。常规he染色并计算滑膜病理积分,按照程度不同分别评分[4]:0分:正常;1 分:极少炎性细胞浸润或(和)组织轻微水肿;2分:轻微浸润;3分:中等浸润;4分:明显浸润;5分:严重浸润。免疫组化检测用sabc (链霉亲和素生物素酶复合物)法,tnfα、hif1α和vegf阳性滑膜细胞均呈颗粒状棕黄色或棕褐色。采用真彩色图像分析系统对tnfα、hif1α和vegf表达强度进行定量分析。方法[5]如下:每张切片随机选取5个视野(×200),系统自动测量出阳性染色部位的积分光密度(iod),5个视野的平均iod值代表该切片tnfα、hif1α和vegf的表达情况。

  1.6 统计学分析 应用spss 13.0统计软件,计量资料以±s表示,采用单因素方差分析,相关性采用直线相关分析,p<0.05为差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 ⅱ~ⅴ组大鼠造模后共有38只于第15~19天先后出现关节红、肿等关节炎表现,给药期间ⅱ组死亡1只,ⅲ、ⅳ组各有1只受伤,剔出死亡、受伤及造模不成功的大鼠后,最终入选实验统计结果的实验动物共计45只,ⅰ、ⅱ组各10只,ⅲ、ⅳ组各9只,ⅴ组7只。

  2.2 ai值及足体积的测定 ⅰ组大鼠无足爪肿胀,各时间点ai值均为0分,ⅱ~ⅴ组大鼠ai值均高于ⅰ组,差异有统计学意义(p<0.05)。造模后第21~27天ⅴ组大鼠的ai值明显低于ⅱ组,差异有统计学意义(p<0.05),而ⅲ、ⅳ组ai值虽然均低于ⅱ组但差异无统计学意义(p>0.05)。ⅲ、ⅳ、ⅴ组两两之间在各时间点ai值差异无统计学意义(p>0.05)。见表1。表1 4组大鼠在不同时间段ai值比较

  2.3 各组不同时间段右足体积比较 试验前5组大鼠之间右足体积差异无统计学意义(p>0.05)。ⅱ~ⅴ组大鼠右足体积于造模后第15天开始明显增高,与ⅰ组比较,ⅱ组于造模后第15天足肿胀程度明显增高(p<0.05或<0.01);ⅲ~ⅴ组于造模后第18天足爪肿胀程度明显增高(p<0.05),并于第21~24天逐渐达肿胀高峰,除ⅳ组外,ⅲ、ⅴ组于第27天足肿胀程度均略好转,但与ⅰ组比较差异仍有统计学意义(p<0.05)。与ⅱ组比较,ⅲ组虽然足肿胀程度低但差异无统计学意义(p>0.05),ⅳ组于第21~24天足体积明显低于ⅱ组(p<0.05),但第27天与差异无统计学意义(p>0.05);ⅴ组于第21~27天足体积均明显低于ⅱ组(p<0.05)。ⅴ组于给药12 d后足体积明显低于ⅲ组(p<0.05);ⅲ组与ⅳ组、ⅳ组与ⅴ组差异均无统计学意义(p>0.05)。见表2。表2 5组大鼠不同时间段右足体积比较

  2.4 大鼠滑膜病理学改变及病理学评分 ⅰ组正常大鼠滑膜衬里层有1~2层滑膜细胞组成,且部分不连续。滑膜衬里层下层为由脂肪细胞、少量成纤维细胞、巨噬细胞和少量血管组成的结缔组织。滑膜组织无炎性细胞浸润,无纤维组织增生。ⅱ组可见滑膜组织中等量淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞浸润,平均病理积分3.8±0.4,滑膜衬里层增生达4~6层。ⅲ~ⅴ组滑膜组织病理积分均明显低于ⅱ组,差异有统计学差异(p<0.01);ⅴ组滑膜组织病理积分低于ⅲ组(p<0.05);ⅳ组滑膜组织病理积分与ⅲ、ⅴ组之间差异无统计学意义(p>0.05)。见表3。表3 大鼠膝关节滑膜病理学积分

  2.5 滑膜组织tnfα、hif1α和vegf的表达 ⅰ组大鼠滑膜组织有少量tnfα、hif1α和vegf的表达。与ⅰ组比较,ⅱ~ⅴ组均明显增高(p<0.01)。与ⅱ组比较,ⅳ、ⅴ组滑膜组织tnfα表达明显减低,差异有统计学意义(p<0.01);ⅲ组tnfα表达虽低于ⅱ组,但差异无统计学意义(p>0.05);ⅲ~ⅴ组滑膜组织hif1α、vegf的表达均明显低于ⅱ组(p<0.01)。ⅳ、ⅴ组滑膜组织tnfα表达低于ⅲ组(p<0.05),ⅴ组滑膜组织tnfα表达低于ⅳ组(p<0.05)。ⅲ、ⅳ组滑膜组织hif1α、vegf的表达均高于ⅴ组(p<0.05);ⅲ与ⅳ组之间差异无统计学意义(p>0.05)。见表4、图1~8。表4 5组大鼠膝关节滑膜组织tnfα、hif1α和vegf iod值比较注:与ⅰ组比较,*p<0.01;与ⅱ组比较,#p<0.01;与ⅲ组比较,△p<0.05,与ⅳ组比较,☆p<0.05

  2.6 滑膜病理学评分与tnfα、hif1α和vegf表达的相关性 滑膜组织tnfα、hif1α和vegf的iod值分别与病理积分成直线正相关(r=0.872,p<0.01;r=0.810,p<0.01;r=0.778,p<0.01)。

  3 讨论

  益赛即注射用重组人ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白,是一种可抑制tnfα功能的生物制剂。目前益赛普抗炎疗效的可能的机制包括:(1)减少炎症部位的细胞生成;(2)下调滑膜细胞因子的表达;(3)降低血浆mmp1和mmp3的水平;(4)可调节细胞的凋亡[6]。有研究结果显示,应用益赛普治疗的ra患者关节炎症明显好转。hif1α和vegf在血管新生的病理和生理中炎症具有重要作用。hif1α是缺氧状态下血管生成的核心调控因子,可上调vegf表达。研究显示,在体内tnfα启动vegf生成以促进血管新生,抗tnfα治疗可降低vegf生成及与ra相关的血管新生,使增生血管复原[7,8]。抗tnfα制剂,在体外培养的滑膜细胞可抑制vegf生成[9]。本实验显示,益赛普可抑制滑膜组织tnfα、hif1α和vegf的过度表达,且和足体积、关节炎指数均呈直线正相关。益赛普治疗组滑膜组织tnfα的表达低于单纯造模组,而甲氨喋呤组与单纯造模组差异无统计学意义,说明益赛普可降低滑膜组织tnfα的表达。益赛普治疗组滑膜组织hif1α、vegf的表达

  均明显低于单纯造模组,高剂量组明显低于甲氨喋呤组,而低剂量组与甲氨喋呤组无统计学差异。说明益赛普可以降低aa大鼠滑膜组织hif1α、vegf的表达,抑制新生血管形成,从而减少血管翳的形成。益赛普治疗组大鼠滑膜组织病理积分均明显低于单纯造模组;高剂量组明显低于甲氨喋呤组,而低剂量组与甲氨喋呤组差异无统计学意义。说明益赛普可以有效抑制或延缓aa大鼠关节病理改变,减轻关节病变程度且成剂量依赖性。与甲氨喋呤治疗组比较,益赛普高剂量组在足体积、ai、tnfα、hif1α和vegf在滑膜的表达、滑膜病理积分均明显降低,而低剂量组与甲氨喋呤组差异无统计学意义(p<0.05),说明益赛普起效早于甲氨喋呤,近期效果优于甲氨喋呤,这可能与给药方法不同,以及甲氨喋呤起效缓慢有关,但远期疗效尚有待观察。

  本实验说明:经益赛普治疗的aa大鼠,从足肿胀程度、滑膜tnfα、hif1α和vegf水平、滑膜病理积分几方面均显著低于未经治疗的aa大鼠,近期疗效优于甲氨喋呤,其机制可能与益赛普中和tnfα,抑制了tnfα促炎因子的作用,从而间接抑制了对血管翳形成直接造成软骨和骨破坏起主要作用的hif1α、vegf的表达有关。

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