【关键词】 大肠癌缺失基因; ki67;宫颈癌; 宫颈上皮内瘤变; 免疫组织化学
【摘要】 目的 探讨大肠癌缺失基因(deleted in colorectal carcinoma gene，dcc)和ki67在宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, cin)及宫颈癌组织中的表达及临床病理意义。方法 采用免疫组化技术(sp法)检测dcc和ki67在16例cin和33例宫颈癌中的表达。结果 dcc和ki67在慢性宫颈炎、cinⅰ～ⅱ级、cinⅲ级和宫颈浸润癌组织中表达的阳性率分别为75.0%、50.0%、37.5%、24.2%和10.0%、43.8%、75.0%、87.9%。dcc在宫颈浸润癌和cinⅲ级组织中的表达显著低于慢性宫颈炎组织（p＜0.05），其阳性表达率与年龄、临床分期及病理分级无关( p ＞ 0.05)。ki67在宫颈浸润癌组织中阳性表达率显著高于cinⅰ～ⅱ级和慢性宫颈炎组织（p＜0.05）；ki67在各级cin的阳性表达率显著高于慢性宫颈炎组织（p＜0.05）；ki67表达率与临床分期及病理分级有关（p＜0.05） 。结论 dcc的检测有助于宫颈癌的早期诊断，而ki67的检测则不仅有助于宫颈癌的早期诊断，而且还是监控子宫颈癌发展以及预后的判断的重要指标。wWW.133229.CoM
【关键词】 大肠癌缺失基因; ki67;宫颈癌; 宫颈上皮内瘤变; 免疫组织化学
expression and significance of dcc and ki67 in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer
hou juru,jin dongling,liu xianjun,et al.
the first hospital of yongnian county,hebei, handan 057150,china
【abstract】 objective to investigate the expressions and clinical significance of dcc and ki67 in cervical intraepithelial neoplasia(cin) and cervical cancer. methods immunohistochemistry(sp method) was used to detect the expressions of dcc and ki67 in 16 cases of cin and 49 cases of cervical cancer.results the positive expression rate of dcc and ki67 in chronic cervicitis, cin ⅰ～ⅱ, cin ⅲ and cervical cancer were 75.0%,50.0%,37.5%,24.2% and 10.0%,43.8%,75. 0%,87.9% respectively. the positive expression rate of dcc was significantly different between cervical cancer,cin ⅲ and chronic cervicitis(p<0.05). the positive expression rate of dcc was not related with age, clinical stage and pathologic grade of cervical cancer（p>0.05）.the expressions of ki67 in cin ⅰ～ⅱ, chronic cervicitis and cervical cancer were positively correlated with clinical stage and pathological grade of cervical cancer (p<0.05). conclusion dcc test is helpful to the early diagnosis of cervical cancer, while the detection of ki67 is not only contribute to the early diagnosis of cervical cancer, but also to monitor the development of cervical cancer,which also is an important indicator for patients ’prognosis.
【key words】 dcc; ki67; cervical cancer; cervical intraepithelial neoplasia; immunohistochemistry
宫颈癌（cervical cancer）是最常见的妇科恶性肿瘤之一，在全球女性恶性肿瘤中其发病率仅次于乳腺癌。宫颈癌的发生是一个涉及多基因改变和多阶段致癌的复杂过程，其中原癌基因活化或抑癌基因失活以及抗凋亡基因活性增强或促凋亡基因活性减弱的综合结果在宫颈癌的发生发展中起非常重要的作用。大肠癌缺失基因（deleted colorectal carcinoma，dcc），是一个重要的肿瘤抑制基因，它通过影响细胞凋亡参与肿瘤的发生。ki67是人类增殖细胞核中普遍存在的标志性抗原，有学者认为ki67在细胞周期调控中起枢纽作用,决定细胞通过g1 调定点进入增殖循环或进入g0 期,可能与肿瘤的发生和发展密切相关［1］。本研究应用免疫组织化学sp方法联合检测dcc与ki67在宫颈癌、宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithial neoplasia,cin）组织中的表达，并以良性病变慢性宫颈炎作对照，结合临床病理资料，探讨dcc和ki67在宫颈癌发生、发展中的作用及其相互关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
原发性宫颈癌、cin和癌旁组织均来自河北省永年县第一医院病理科, 选取 2007年3月至2009年12月存档的病理标本。所有病例均经过病理组织学证明。宫颈浸润癌33 例, 年龄33～68 岁, 平均年龄49.6 岁。病理分级：g1 8 例,g2 15 例,g3 10 例。按国际妇产科联盟(figo)宫颈癌分期标准进行分期:ⅰa 期3例, ⅰb 期14 例, ⅱa 期10 例, ⅱb 期6例。cin 24例, cinⅰ级(轻度不典型增生) 10 例, cinⅱ级(中度不典型增生) 6 例,cinⅲ级(重度不典型增生及原位癌)8 例。慢性宫颈炎组织20例。所有患者术前均未进行化疗和放疗。所有标本均经过10%的甲醛中性溶液浸泡, 常规脱水、透明、浸蜡, 然后石蜡包埋。4 μm厚连续切片，分别作he和sp染色。
1.2 免疫组织化学染色
dcc兔抗人单克隆抗体试剂盒购于博士德生物工程有限公司，ki67鼠抗人单克隆抗体和免疫组织化学sp试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。dcc抗体工作液浓度为1∶200, ki67抗体工作液浓度为1∶100。sp染色按试剂盒说明操作，以3％ h2o2溶液室温孵育5～10 min除去内源性过氧化物酶的活性，抗原热修复，常规免疫组化标记。用已知dcc和ki67阳性的人食管癌标本作阳性对照；用pbs代替一抗作阴性对照。dab显色，苏木精衬染，中性树胶封固，显微镜观察。
1.3 结果判断标准
dcc阳性定位于细胞膜,ki67阳性定位于细胞核,以各种抗体在细胞膜或胞核内出现棕黄色颗粒为阳性信号。参照 parenti等［1］的标准,每张切片均随机观察 5个高倍视野(×400),阳性细胞数＜5%为 (-), 5%～25%为(+), 25%～50%为 (++),＞50%为 (+++)。以 +～+++视为阳性表达,以(-)视为阴性表达。
1.4 统计学分析
应用spss 12.0统计软件，计数资料采用χ2检验，相关性检验采用等级相关分析，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 dcc和ki67在慢性宫颈炎、cin、宫颈浸润癌组织中的表达结果dcc表达主要在上皮或肿瘤细胞的胞膜上。dcc在慢性宫颈炎组织中阳性表达率为75%，而在宫颈浸润癌和cinⅲ级组织中表达缺失，阳性表达率显著低于慢性宫颈炎组织（p＜0.05）；而在cinⅰ～ⅱ级和ⅲ级之间以及cinⅰ～ⅱ级和慢性宫颈炎之间dcc的表达差异无统计学意义（p＞0.05）。见表1。ki67表达主要在上皮或肿瘤细胞的胞核上。ki67在宫颈浸润癌组织中阳性表达率为87.9%，显著高于cinⅰ～ⅱ级和慢性宫颈炎组织（p＜0.05）；ki67在cinⅲ级和ⅰ～ⅱ级的阳性表达率显著高于慢性宫颈炎组织（p＜0.05）；而在cinⅰ～ⅱ级和ⅲ级之间ki67的表达差异无统计学意义（p＞0.05）。见表1。表1 dcc和ki67在慢性宫颈炎、cin、宫颈癌组织中的表达例（略）注：与慢性宫颈炎比较，*p＜0.05；与其他各组比较，#p＜0.05；与cinⅲ、宫颈浸润癌比较， △p<0.05
2.2 dcc和ki67与宫颈癌临床病理参数的关系宫颈癌中dcc的表达与年龄、病理分级、临床分期无关（p＞0.05）。ki67在宫颈癌中的表达与年龄无关（p＞0.05），但与病理分级有关，分化程度较低的g2、g3级的阳性表达率显著高于分化程度较高的g1级（p＜0.05）。ki67在宫颈癌中的表达与临床分期有关，随着病变的进展阳性率增加, 在宫颈癌ⅱa～ⅱb期阳性表达率为100%, 显著高于ⅰa～ⅰb期（p＜0.05）。见表2。表2 dcc和ki67与宫颈浸润癌临床病理参数的关系例（略）
2.3 dcc和ki67在慢性宫颈炎、cin、宫颈癌组织中表达的相关性经统计学相关分析，两种蛋白的表达无相关性（p＞0.05）。见表3。表3 dcc的表达与ki67 表达的相关性例（略）
3 讨论
dcc基因即结直肠癌缺失基因，是fearon 等［2］于1990年确定并命名的一个重要的肿瘤抑制基因，定位于人染色体18q21.3，此家族在细胞信号传导中发挥重要作用，是细胞生长、分化及存活的重要调节者。
narayanan等［3］选择自然转化可能性很低的rat1纤维母细胞，将构建的dcc基因特异反义rna转导入其中后，细胞生长速度明显加快，并在裸鼠模型中可诱发癌变。dcc具有调节细胞凋亡作用的发现证明了它是肿瘤抑制因子。证据包括：在70%的大肠癌和其他一些肿瘤中，人染色体18q上的dcc位点缺失［3］；在90%以上的原发结肠癌中存在dcc等位基因缺失(allelicloss)［4］；同时在包括胃癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、食道癌、神经胶质瘤等一系列肿瘤中也检测到dcc表达下调［5］。dcc蛋白可以作为肿瘤转移或局部浸润性生长的抑制因子,而dcc功能的丧失可以增加配体缺乏环境中的细胞生存［6］。
本研究发现，dcc在宫颈癌、cinⅲ、cinⅰ～ⅱ以及慢性宫颈炎组织中阳性表达率分别为24.24%、37.50%、50%和75%。dcc在宫颈浸润癌和宫颈上皮内瘤变iii级组织中表达缺失，显著低于慢性宫颈炎组织，两者差异有统计学意义。这与grady等［7］对大肠癌结果相符。本研究经过分析dcc与宫颈浸润癌临床病理参数的关系发现，dcc在宫颈癌中的表达率与年龄、病理分级及临床分期无关，提示dcc基因表达缺失在宫颈癌的发生过程中是早期事件，是肿瘤发生的促发因素之一。ki67 是一种与增殖细胞相关的核抗原［8］,它是一种贯穿表达于增殖期细胞中的核蛋白,在维持细胞增殖活性中起重要作用,可以较好地反映细胞的增殖活性。本研究结果显示, ki67在慢性宫颈炎组织中几乎不表达,而在cinⅰ～ⅱ、cinⅲ组织中阳性表达率逐渐增高， ki67在宫颈浸润癌组织中阳性表达率为87.9%，显著高于cinⅰ～ⅱ级和慢性宫颈炎组织；ki67在各级cin的阳性表达率显著高于慢性宫颈炎组织；说明宫颈癌的发生系细胞过度增殖所致。本研究还发现，ki67在宫颈癌中的表达率与年龄无关,而与病理分级和临床分期有关；病理g2、g3级表达高于g1级,ⅱ期表达高于ⅰ期病例,且差异具有统计学意义。说明ki67 能反映子宫颈癌细胞增殖情况，结果与国内文献报道一致［9-11］ 。
本实验通过对dcc和ki67在慢性宫颈炎、cin、宫颈癌组织中表达的相关性分析，表明两者的表达无明显相关。提示在宫颈癌的发生发展过程中，dcc和ki67是彼此独立的影响因素，各自发挥着不同的病理生理功能。dcc的检测有助于宫颈癌的早期诊断，而ki67的检测则不仅有助于宫颈癌的早期诊断，而且还是监控子宫颈癌发展以及预后的判断的重要指标。
【参考文献】
1 parenti a, leo g, porzionato a, et al. expression of survivin,p53, and caspase 3 in barrett’s esophagus carcinogenesis.hum pathol, 2006,37:1622.
2 fearon er,cho kr,nigro jm.identification of a chromosome 18q gene that is altered in colorectal cancers.science,1990，247:4956.
3 narayanan r,law lor kg,schaapveld rqj,et al.antisense rna to the putative tumor suppressor gene dcc transform rat1 fibrosis.oncogene,1992,7:553561.
4 mehlen p,llambi f.role of netrin1 and netrin1 dependence receptors in colorectal cancers.br j cancer,2005,93:16.
5 mehlen p,furne c.netrin1:when a neuronal guidance cueturns out to be a regulator of tumorigenesis.cell mol life sci,2005,62:25992616.
6 mehlen p, fearon er. role of the dependence receptor dcc in colorectal cancer pathogenesis. j clin onco,2004, 22:32403248.
7 grady wm.making the case for dcc and unc5c as tumor-suppressor genes in the colon.gastroenterology,2007,133:20452049.
8 ferrandina g, ranelletti fo,larocca lm,et al. tamoxifen modulales the expression of ki67,apoptosis,and microvessel density in cervical cancer.clin cancer res,2001,7:26562661.
9 李红雨,石小燕,徐茜,等. pinl 在子宫颈癌中过表达及其与ki67 关系的研究. 中国肿瘤临床, 2006,33:181183.
10 陈浩华，谢文华.子宫颈病变的筛查方法及其新进展.河北医药，2008，30：15861587.
11 何慧仪,卢丽娜,杜洪,等. ki67、survivin、p16 表达在宫颈癌和宫颈癌前病变诊断中的意义. 中国妇幼保健,2006 ,21:18251827.
