影响因子: : 32377375 期刊年卷:Cell Discov 2020;6 生物二区 细胞生物学 Q2 60/190 DOI:
使用单细胞测序,作者分析了血液中免疫种群的复杂性,并分析了10位患者的70,858个细胞。作者确定了ERS患者的高炎症反应,这可以解释为什么某些患者出院后生病,并建议应重新评估当前的出院标准。此外,作者鉴定了髓样,NK,T和B细胞的独特标志,并指出了TCR和BCR表位的变化。作者的发现有助于阐明抗病毒免疫机制,并揭示了使用疫苗和中和抗体开发免疫疗法的有希望的机会。
用于了解SARS-COV-2清除后的免疫细胞组成(来自PBMC)
回顾性了解免疫细胞反应并告知可能的疫苗设计/药物靶标
用于识别康复患者的免疫特征
作者将患者区分为早期康复阶段(n = 5,ERS,自从对COVID19呈阴性以来<7天)和晚期康复阶段(n = 5,LRS,> 14天),并将这些患者与健康对照组进行比较(n = 5)
PBMC的单细胞RNA测序
scBCR-seq和scTCR-seq评估扩增的B细胞和T细胞克隆的克隆性
计算方法没有得到很好的描述,因此某些数字并未直接突出显示得出的结论
使用的某些工具不是标准的工作流程工具,因此需要在方法中进行进一步说明
优点:
缺点:
由SARS-CoV-2引起的COVID-19最近影响了1,200,000多人,造成60,000多人丧生。关键的免疫细胞亚群发生变化,其在COVID-19过程中的状态仍不清楚。作者试图通过单细胞RNA测序技术全面表征COVID-19恢复期外周血单个核细胞的转录变化。发现在COVID-19的早期恢复期(ERS)中,患者的T细胞显著减少,而单核细胞增加。具有较高炎症基因表达的经典CD14 ++单核细胞比例增加,并且ERS中CD14 ++ IL1β +单核细胞的丰度更高。CD4 + T细胞和CD8 + T细胞显著减少,并在ERS中表达高水平的炎症基因。在B细胞中,浆细胞显著增加,而幼稚B细胞减少。确定了几个新的B细胞受体(BCR)的变化,例如IGHV3-23和IGHV3-7,并确认了以前用于病毒疫苗开发的同种型(IGHV3-15,IGHV3-30和IGKV3-11)。最强的配对频率IGHV3-23-IGHJ4表示与SARS-CoV-2特异性相关的单克隆状态,尚未有报道。此外,综合分析预测,IL-1β和M-CSF可能是炎性风暴的新型候选靶基因,而TNFSF13,IL-18,IL-2和IL-4可能对COVID-19患者的康复有益。作者的研究提供了ERS中炎症性免疫信号的第一个证据,提示出院后COVID-19患者仍然易受伤害。新的BCR信号转导的鉴定可能导致开发用于治疗COVID-19的疫苗和抗体。
为了绘制COVID-19患者的免疫微环境图,作者鉴定了血液中的镜像变化,并查明了与疾病严重程度和恢复相关的细胞特异性变化。然后,作者从 早期恢复阶段(ERS)或晚期恢复阶段(LRS)(70,858 PBMC)的总共10例COVID-19患者中整合了scRNA-seq,单细胞配对BCR和单细胞配对TCR分析。作者还从五个健康供体作为对照收集了scRNA-seq数据(57,238个细胞)(图 1a ** 和补充图 S1a–c )。**该数据集通过了严格的高质量过滤。使用10x Genomics将scRNA-seq样品的单细胞悬液转化为条形码的scRNA-seq库。Cell Ranger软件(版本)用于测序数据的初始处理。
图1:COVID-19患者单免疫细胞谱分析的研究设计和分析
作者使用t分布随机邻居嵌入(t-SNE),根据典型谱系标记物和在每个簇中上调的其他基因的表达,分析了三种免疫细胞谱系,髓样,NK,T和B细胞的分布(图 1b,c )。对于标记基因,位于t-SNE中的每个细胞中的表达值如图 1d 所示。接下来,作者分别将每个谱系的细胞聚类,并鉴定出总共20个免疫细胞簇。
从COVID-19感染中恢复过来的患者的免疫细胞区包括所有主要的免疫谱系。作者分析了通过质量控制的128,096个scRNA-seq概况,包括来自五个HC,五个ERS和五个LRS患者的36,442个髓样细胞,64,247个NK和T细胞以及10,177个B细胞。补充图 S2a中 显示了每个主题的粗略聚类分析景观,图 2a中 显示了每个组的合并图像。作者发现,与HCs相比,包括ERS和LRS在内的COVID-19患者的髓样细胞比例更高,但NK和T细胞比例更低(图 2b,c )。有趣的是,与ERS患者相比,LRS患者的B细胞,NK和T细胞更多,但髓样细胞却更少(图 2b,c )。因此,这些发现表明COVID-19患者外周血中淋巴细胞计数降低,而髓样细胞计数升高。
为了进一步了解COVID-19恢复早期和晚期患者中单核细胞的变化,作者进行了基因表达分析,并使用统一流形近似和投影(UMAP)将髓样细胞亚群化为六个转录不同的亚群。
经典CD14 ++单核细胞(M1), 非经典CD16 ++(FCGR3A)CD14- / +单核细胞(M2), 中间CD14 ++CD16 +单核细胞(M3), CD1C + cDC2(M4), CLEC9A + cDC1(M5 )和 pDC(CLEC4C +CD123 +)(M6)
存在于六个不同的簇中(图 3a,b )。作者发现在HCs和COVID-19患者之间,单核细胞亚群的区室显著不同(图 3c )。在髓样细胞中,ERS患者中经典CD14 ++单核细胞(M1)的比例高于HCs,而LRS患者中则几乎是正常的(图 3c )。
图3:恢复期COVID-19患者血液中的髓样细胞亚群及其状态
作者发现,COVID-19患者的CD14 ++ IL1β +单核细胞和IFN激活的单核细胞比HCs富集(图 3d–f )。与CD14 ++炎性单核细胞(M1)相关的基因具有高表达水平的炎性基因,例如 IL1β,JUN,FOS,JUNB 和 KLF6 。趋化因子 CCL4,CXCR4 ; 以及干扰素刺激的基因 IFRD1,IRF1 和 IFI6 。相比之下,与HCs中的CD14 ++单核细胞(M1)相关的抗炎基因在COVID-19患者中被下调(图 3d,e )。值得注意的是,UMAP中的IL1β表达值同时具有对比,表明ERS组中IL1β上调,而LRS患者中IL1β下降(图 3f )。与HCs相比,ERS组的DC集群中也证实了这一点(补充图 S3a,b )。接下来,作者获取了COVID-19患者与HCs中每个髓样细胞scRNA-seq亚型的平均炎症基因(补充图 S3c )。这些结果表明,细胞因子的激活驱动单核细胞群的扩展(尤其是CD14 ++感染COVID-19的患者中的炎性单核细胞)。为了探索M1簇中转录变化的生物学意义,作者用DEG进行了GO分析(图 3g )。作者观察到与细胞因子信号传导和炎症激活相关的途径的富集,这是由 IFITM3 和 IFI6 和 IL1β,JUN,FOS,JUNB 和 KLF6 的上调驱动的(图 3g )。
T细胞和NK细胞在呼吸道感染中发挥病毒清除关键作用 15 , 16 。作者的聚类分析基于规范标记(图 4b 和补充图 S4a )将T和NK淋巴细胞分为10个子集(图 4a )。
NK细胞高表达NCAM1,KLRF1,KLRC1和KLRD1 ;
(1)NK细胞细分为CD56 + CD16 - NK细胞(NK1),它们表达高水平的 CD56 和低水平的 CD16 ;
(2)C56 - CD16 + NK细胞(NK2),它们表达高水平的 CD16 和低水平的 CD56 。
CD4 + T细胞表达CD3E和CD4 ; 然后将这些细胞细分为四个簇:
(1)幼稚的CD4 + T细胞(T1),它们表达高水平的 CCR7,LEF1 和 TCF7 ;
(2)中央记忆CD4 + T细胞(T2,CD4 Tcm),表达高水平的 CCR7 ,但与单纯CD4 + T细胞相比, AQP3 和 CD69 更高;
(3)效应器记忆CD4 + T细胞(T3,CD4 Tem),表达高水平的 CCR6,CXCR6,CCL5 和 PRDM1 ;
(4)调节性T细胞(T4,Treg),表达 FOXP3 。
CD8 + T细胞表达CD8A和CD8B,并细分为三个簇:
(1)幼稚CD8 + T细胞(T5),其表达高水平的 CCR7,LEF1 和 TCF7 ,与幼稚CD4 + T细胞相似;
(2)效应记忆CD8 + T细胞(T6,CD8 Tm),表达高水平的 GZMK ;
和细胞毒性CD8 +淋巴细胞(CD8 +CTL)(T7),它们表达高水平的 GZMB,GNLY 和 PRF1 。
(3)增殖性T细胞(T8,T prol)是TYMS + MKI67 +细胞。
图4:恢复的COVID-19患者血液中T和NK细胞反应的特征。
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在HCs和COVID-19患者之间,T细胞和NK细胞亚群的组成存在显著差异(图 4c )。在COVID-19患者中,CD8 + T细胞的绝对数量,特别是效应记忆CD8 + T细胞亚组和NK细胞的绝对数量减少,而ERS中NK细胞的相对比例高于HCs。CD4 + T细胞的比例是稳定的,但HCs和COVID-19患者之间CD4 + T细胞亚群的组成存在显著差异。在CD4 + T细胞中,中央记忆CD4 + T细胞的比例明显更高,而幼稚CD4 + T细胞,Tregs和效应记忆CD4的比例+ T细胞低于HCs,尤其是ERS组。值得注意的是,与CD4 + T细胞相关的基因具有较高的炎症相关基因表达水平,并且在COVID-19患者中明显上调(图 4d )。CD4 + T细胞在COVID-19的ERS患者中具有高表达水平的炎症基因,包括 FOS,JUN,KLF6 和 S100A8 (图 4e )。相反,COVID-19患者的CD4 + T细胞相关的抗炎基因相对于HCs被下调(图 4d,e )。这表明CD4 +T细胞是病毒感染的主要参与者。CD4 + T细胞中DEG的比较揭示了参与细胞因子途径和炎症激活的基因的丰富,包括 IFITM3 和 IFI6 以及 IL1B,JUN,FOS,JUNB 和 KLF6 (图 4f )。需要进一步的研究阐明与COVID-19发病机制有关的IFN途径。
TCR-seq分析显示,ERS组的T细胞扩增明显低于HC组(图 4g )。此外,幼稚或中枢记忆T细胞几乎没有克隆扩增,而效应记忆T细胞,末端效应CD8 + T细胞(CTL)和增殖T细胞则显示出更高的扩增水平(图 4h )。另外,ERS组中扩增最高(最大)的克隆是TRAV8-6-TRAJ45:TRAV7-8-TRBJ2-1(补充图 S5d )。COVID-19患者中CD8 + T细胞比例的降低可能暗示了CD8 + T细胞在病毒清除中的作用(图 4c )。而且,CD8 +与HCs中的克隆相比,具有扩展克隆的CTL还表现出过度活化的炎症和抗病毒活性(图 4i 和补充图 S4b )。总之,这些发现表明COVID-19患者外周血中CD8 + T细胞的克隆扩增有助于控制该病毒。作者还通过Seurat FindAllMarkers 分析进行了DEG分析,并在T prol细胞中发现了相似的结果(补充图 S4c )。接下来,作者将COVID-19患者中每个NK和T细胞亚群scRNA-seq子集的炎症基因与正常RNA-seq数据的 平均值进行比较 (补充图 S4d )。
通过使用扩散图预测B细胞的基因表达数据,作者使用
scRNA-seq鉴定了四个B细胞簇:
表达 CD19,CD20(MS4A1),IGHD,IGHM,IL4R和 TCL1A的 幼稚B细胞(B1);**
表达 CD27,CD38和 IGHG的 记忆B细胞(B2); **
仅表达 CD19和 CD20(MS4A1)的 未成熟B细胞(B3 ) ;**
以及表达高水平 XBP1和 MZB1的 浆细胞(B4)(图 5a,b 和补充图 S5a )**。
图5:在COVID-19患者中单细胞B细胞的表征。
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与HCs相比,COVID-19患者的浆细胞百分比显著增加,而COVID-19患者的幼稚B细胞百分比显著降低(图 5c )。记忆B细胞和浆细胞(MPB)可能在病毒感染的控制和过继免疫的发展中起重要作用,因为它们协同工作并诱导特异性抗体。此外,与 HCs相比 ,包括 S100A8,IGLL5,SSR3,IGHA1,XBP1 和 MZB1 在内的B细胞活化相关基因主要在ERS组的MPB中表达(图 5d )。作者还在浆细胞,抗体分泌细胞(ASC)中发现了类似的结果(补充图 S5b,c ),提示ASC在病毒控制中起关键作用。接下来,作者将COVID-19患者每个B细胞亚群的炎症基因平均值与正常RNA-seq数据进行比较(图 5e )。ERS和HCs之间的基因差异表明COVID-19患者的B细胞反应和抗体分泌增强。GO分析表明, MPHA中IGHA1,XBP1,MZB1,JUN,POLR2L 和 ZFP36 的表达过高,这表明COVID-19患者的B细胞增殖和病毒转录增强(图 5f )。单细胞BCR-seq分析表明,与HC中相比,COVID-19患者中IgA同种型的表达过高(图 5g) )。这与血清IgA水平升高相对应,这在其他冠状病毒感染中也很明显。此外,在ERS患者中,(IgA + IgG + IgE)与(IgD + IgM)的比例显著增加,并且随着恢复时间而呈下降趋势(图 5h )。
使用sc-BCR-seq评估患者血液中克隆扩增的状态,作者发现IL4R +幼稚B细胞显示出很少的克隆扩增,而CD27 + CD38 +记忆B细胞显示出在各种B细胞亚群中最高的扩增水平(图 6a )。在个体水平上,作者发现与HCs相比,COVID-19患者的克隆明显扩增,这支持了B细胞在SARS-CoV-2感染下经历了独特的VDJ克隆重排的假设。作者还发现,与LRS患者相比,ERS中始终保持较高的B细胞克隆性(图 6b)。 )。此外,对每个受试者的最大扩增(最大)克隆的定量显示,ERS组中最大克隆的比率高于HCs中的最大克隆的比率(图 6c )。为了了解扩增的克隆B细胞的功能状态,作者在克隆的记忆B细胞和其他B细胞之间进行了DEG分析。作者的结果表明B细胞基因的表达增加,包括 CD27,SSR4,IGHG1,MZB1 和 XBP1 ,这进一步支持了扩增的克隆B细胞的优异效应子功能(图 6d )。而且,随着时间的流逝,扩增的B细胞的差异基因会明显消退,而在LRS患者中会降低(图 6d )。
图6:在COVID-19患者中观察到BCR克隆扩增,VDJ基因使用偏倚。
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为了研究COVID-19患者中BCR的独特变化和偏好基因,作者比较了COVID-19患者和HCs中VDJ基因的使用情况。作者确定了IGHV3家族的过度表达,COVID-19患者相比尤其是在IGHV3-7,IGHV3-15,IGHV3-21,IGHV3-23和IGHV3-30 (图 6E )。优选的IGKV是IGKV1-17,IGKV2-28和IGKV3-15,而优选的IGLV是IGLV1-44,IGLV2-8和IGLV3-27(图 6e )。此外,ERS患者的前两个配对频率是IGHV3-23-IGHJ4和IGHV3-7-IGHJ6(图 6f) )。这些细胞显示出IGH亚基与分别由IGLV1-44-IGLJ3和IGKV1-17-IGKJ1编码的IGK / L亚基配对,这表明与SARS-CoV-2特异性相关的扩展状态。单独地,ERS-4和ERS-5具有最大的克隆,分别参考IGHV3-23-IGHJ4(补充图 S5e )和IGHV3-7-IGHJ6(补充图 S5f )。
总之,以IgA和IgM同种型为主的COVID-19克隆性的增加,以及IGHV基因的偏斜使用,提示SARS-CoV-2对发病机理的贡献。值得注意的是,COVID-19患者中主要IGV基因(尤其是IGHV3-23和IGHV3-7)的偏好为合理设计SARS-CoV-2疫苗提供了框架。
用于预测可能有助于ERS和LRS中T细胞,B细胞,单核细胞和树突状细胞(DC)不同功能状态的细胞间相互作用(图 7a,b )。在ERS COVID-19患者中,作者发现了与单核细胞激活,增殖和炎症信号有关的适应性信号(图 7a,b )。
T细胞表达的基因编码TNFSF8,LTA,IFNG,IL17A,CCR5和LTB的配体与TNFRSF8,TNFRSF1A / TNFRSF14,IFNGR1,IL-17RA,CCR1和LTBR的配体相关,这些基因在单核细胞上表达,可能有助于促炎状态。其他T细胞-单核细胞相互作用涉及CSF2和CSF1的表达。
T细胞可能通过CSF2和CSF1的表达激活单核细胞,而CSF2和CSF1与CSFR(CSFR2 / 1)结合并促成炎性风暴。CD14 +单核细胞簇仅表达IL1β,据预测它将与T细胞表达的IL1RAP结合。T细胞与单核细胞的相互作用可能会增强免疫应答,并且仅针对COVID-19患者(图 7a,b )。
此外,作者发现单核细胞高表达脊髓灰质炎病毒受体,在脊髓灰质炎病毒复制和诱导NF-κB信号传导的第一步中,它作为脊髓灰质炎病毒的细胞受体。从B细胞单核细胞和B细胞T细胞的相互作用中,作者发现B细胞可以分泌大量IL-6,LTA和LTB,并与在单核细胞中表达的IL-6R,LTAR和LTBR结合,大量的IL-6应用于T细胞,以促进IFN-γ,IL-1β和其他炎症细胞因子和趋化因子的分泌。因此,在ERS COVID-19患者的发病高峰中形成了高表达IL-6及其后代的炎性单核细胞的级联特征(图 7c )。这些活化的免疫细胞可能大量进入肺和其他器官的循环,并发挥免疫破坏作用。
在LRS COVID-19患者中,预计DC配体会与参与细胞增殖和抗体产生的B和T细胞受体相互作用。作者发现LRS患者的外周血含有多种抗体。作者发现,在作者对DC-B细胞相互作用的分析中,IL18-IL18RAP,TNFSF13-TNFRSF13B,TNFSF13-TNFRSF17,TNFSF13B-TNFRSF17,TNFSF13B-TNFRSF13B和TNFSF13B-TNFRSF13C高度表达(图 7d )。因此,作者推测DC产生IL-18,TNFSF13和TNFSF13B来促进B细胞的增殖,然后在ERS的血液中分泌许多抗体。
从DC-T和T细胞-B细胞的相互作用中,作者发现DC不仅产生IL-18,而且产生IL-7以促进T细胞的增殖。此外,T细胞产生IL-2以促进B细胞的增殖和抗体产生(图 7d )。因此,细胞间的相互作用有助于作者理解为什么COVID-19患者表现出高单核细胞率和低淋巴细胞率,以及为何康复患者外周血中淋巴细胞的比例逐渐增加。
图7:在COVID-19患者中免疫细胞之间的细胞间通讯。
全尺寸图片
使用单细胞测序,作者分析了血液中免疫种群的复杂性,并分析了10位患者的70,858个细胞。作者确定了ERS患者的高炎症反应,这可以解释为什么某些患者出院后生病,并建议应重新评估当前的出院标准。此外,作者鉴定了髓样,NK,T和B细胞的独特标志,并指出了TCR和BCR表位的变化。作者的发现有助于阐明抗病毒免疫机制,并揭示了使用疫苗和中和抗体开发免疫疗法的有希望的机会。