一.植物与土壤的关系
1. 土壤的生态意义
土壤是岩石圈表面的疏松表层，是陆生植物生活的基质。它提供了植物生活必需的营养和水分，是生态系统中物质与能量交换的重要场所。由于植物根系与土壤之间具有极大的接触面，在土壤和植物之间进行频繁的物质交换，彼此强烈影响，因而土壤是植物的一个重要生态因子，通过控制土壤因素就可影响植物的生长和产量。土壤及时满足植物对水、肥、气、热要求的能力，称为土壤肥力。肥沃的土壤同时能满足植物对水、肥、气、热的要求，是植物正常生长发育的基础。
2. 土壤的物理性质及其对植物的影响
（1）土壤质地和结构 土壤是由固体、液体和气体组成的三相系统，其中固体颗粒是组成土壤的物质基础，约占土壤总重量的85%以上。根据固体颗粒的大小，可以把土粒分为以下几级：粗砂（直径2.0~0.2mm）、细砂（0.2~0.02mm）、粉砂（0.02~0.002mm）和粘粒（0.002mm以下）。这些大小不同的固体颗粒的组合百分比称为土壤质地。土壤质地可分为砂土、壤土和粘土三大类。砂土类土壤以粗砂和细砂为主、粉砂和粘粒比重小，土壤粘性小、孔隙多，通气透水性强，蓄水和保肥性能差，易干旱。粘土类土壤以粉砂和粘粒为主，质地粘重，结构致密，保水保肥能力强，但孔隙小，通气透水性能差，湿时粘、干时硬。壤土类土壤质地比较均匀，其中砂粒、粉砂和粘粒所占比重大致相等，既不松又不粘，通气透水性能好，并具一定的保水保肥能力，是比较理想的农作土壤。
土壤结构是指固体颗粒的排列方式、孔隙和团聚体的数量、大小及其稳定度。它可分为微团粒结构（直径小于0.25mm）、团粒结构（0.25~10mm）和比团粒结构更大的各种结构。团粒结构是土壤中的腐殖质把矿质土粒粘结成0.25~10mm直径的小团块，具有泡水不散的水稳性特点。具有团粒结构的土壤是结构良好的土壤，它能协调土壤中水分、空气和营养物质之间的关系，统一保肥和供肥的矛盾，有利于根系活动及吸取水分和养分，为植物的生长发育提供良好的条件。无结构或结构不良的土壤，土体坚实，通气透水性差，土壤中微生物和动物的活动受抑制，土壤肥力差，不利于植物根系扎根和生长。土壤质地和结构与土壤的水分、空气和温度状况有密切的关系。
（2）土壤水分 土壤水分能直接被植物根系所吸收。土壤水分的适量增加有利于各种营养物质溶解和移动，有利于磷酸盐的水解和有机态磷的矿化，这些都能改善植物的营养状况。土壤水分还能调节土壤温度，但水分过多或过少都会影响植物的生长。水分过少时，植物会受干旱的威胁及缺养；水分过多会使土壤中空气流通不畅并使营养物质流失，从而降低土壤肥力，或使有机质分解不完全而产生一些对植物有害的还原物质。
（3）土壤空气 土壤中空气成分与大气是不同的，且不如大气中稳定。土壤空气中的含氧量一般只有10~12%，在土壤板结或积水、透气性不良的情况下，可降到10%以下，此时会抑制植物根系的呼吸，从而影响植物的生理功能。土壤空气中CO2含量比大气高几十至几百倍，排水良好的土壤中在0.1%左右，其中一部分可扩散到近地面的大气中被植物叶子光合作用时吸收，一部分可直接被根系吸收。但在通气不良的土壤中，CO2的浓度常可达10~15%，这不利于植物根系的发育和种子萌发，CO2的进一步增加会对植物产生毒害作用，破坏根系的呼吸功能，甚至导致植物窒息死亡。土壤通气不良会抑制好气性微生物，减缓有机物的分解活动，使植物可利用的营养物质减少；但若过分通气又会使有机物的分解速率太快，使土壤中腐殖质数量减少，不利于养分的长期供应。
（4）土壤温度 土壤温度具有季节变化、日变化和垂直变化的特点。一般夏季、白天的温度随深度的增加而下降，冬季、夜间相反。但土壤温度在35~100cm以下无昼夜变化，30m以下无季节变化。土壤温度能直接影响植物种子的萌发和实生苗的生长，还影响植物根系的生长、呼吸和吸收能力。大多数作物在10~35℃的范围内生长速度随温度的升高而加快。温带植物的根系在冬季因土温太低而停止生长。土温太高也不利于根系或地下贮藏器官的生长。土温太高或太低都能减弱根系的呼吸能力，如向日葵在土温低于10℃和高于25℃时其呼吸作用都会明显减弱。此外，土温对土壤微生物的活动、土壤气体的交换、水分的蒸发、各种盐类的溶解度以及腐殖质的分解都有显著影响，而这些理化性质与植物的生长有密切关系。
3. 土壤的化学性质对植物的影响
（1）土壤酸碱度 土壤酸碱度是土壤最重要的化学性质，因为它是土壤各种化学性质的综合反映，它与土壤微生物的活动、有机质的合成和分解、各种营养元素的转化与释放及有效性、土壤保持养分的能力都有关系。土壤酸碱度常用pH值表示。我国土壤酸碱度可分为5级：pH<5.0为强酸性，pH5.0~6.5为酸性，pH6.5~7.5为中性，pH7.5~8 .5为碱性，pH>8.5为强碱性。土壤酸碱度对土壤养分有效性有重要影响，在pH6~7的微酸条件下，土壤养分有效性最高，最有利于植物生长。在酸性土壤中易引起P、K、Ca、Mg等元素的短缺，在强碱性土壤中易引起Fe、B、Cu、Mn、Zn等的短缺。土壤酸碱度还能过影响微生物的活动而影响养分的有效性和植物的生长。酸性土壤一般不利于细菌的活动，真菌则较耐酸碱。pH3.5~8.5是大多数维管束植物的生长范围，但其最适生长范围要比此范围窄得多。pH>3或<9时，大多数维管束植物便不能生存。
（2）土壤有机质 土壤有机质是土壤的重要组成部分，它包括腐殖质和非腐殖质两大类。前者是土壤微生物在分解有机质时重新合成的多聚体化合物，约占土壤有机质的85~90%，对植物的营养有重要的作用。土壤有机质能改善土壤的物理和化学性质，有利于土壤团粒结构的形成，从而促进植物的生长和养分的吸收。
（3）土壤中的无机元素。植物从土壤中摄取的无机元素中有13种对其正常生长发育都是不可缺少的（营养元素）:N、P、K、S、Ca、Mg、Fe、Mn、Mo、Cl、Cu、Zn、B。植物所需的无机元素主要来自土壤中的矿物质和有机质的分解。腐殖质是无机元素的储备源，通过矿化作用缓慢释放可供植物利用的元素。土壤中必须含有植物所必需的各种元素及这些元素的适当比例，才能使植物生长发育良好，因此通过合理施肥改善土壤的营养状况是提高植物产量的重要措施。
二.植物为土壤“解毒”
春天的风吹来了绿色，也偶然间吹来了我做这个课题的想法。在沈阳郊区踏青时，我发现有一片土地草枯叶黄。出于好奇，我采集了一些土壤。经过化验，“元凶”终于现身，是一种重金属——镉。镉对植物生长极为有害，而且可以长时间累积。冥思苦想之后，我终于找到了解决问题的巧妙途径：在废弃的土壤上种植耐受性强的植物，将土壤中的镉“吸”出来，再把植物收割后回收利用，以此改良土壤。
植物能够富集重金属。培养液略显酸性、有大量有益微生物如有机磷细菌对植物生长有利，而且浑河水竟也可以改善植物生长情况而使镉的总富集量增加!我完成了这次属于自己的创新性学习，找到了一条通向探究神秘自然、奇妙宫然、科学自然的路!
文章标题：论植物组织培养褐变产生的因素及对策
摘要:本文针对植物组织培养中常见的褐变现象,详细地分析了其产生的机理及影响因素,并提出了相应的对策,为科研和生产提供了一定的理论和实践依据。
关键词:植物组织培养，褐变，对策
目前，在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。褐变主
要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。
1褐变产生的影响因素
影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。
1.1植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。
1.2外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。
1.3培养基成分培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。
1.4培养条件温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素[1]。
2褐变产生的机理
2.1非酶促褐变
非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。徐振彪等[1]将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了[3]。
2.2酶促褐变
目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的[4]。酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。
在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变。
3防止外植体产生褐变的对策
从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质——氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。
3.1适当外植体的选择
取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。王异星[5]用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。
3.2对外植体的处理
通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。何琼英等[6]用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。
3.3适宜的培养基
培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状
态和类型。
3.3.1适当的无机盐浓度张妙霞等[7]在柿树组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS(大量元素减半)和1/2MS的效果最好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。徐振彪[1]在对玉米幼胚耐NaCl愈伤组织的筛选表明，随NaCl浓度升高，褐变现象加重。
3.3.2适当和适量的激素王异星[5]在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加1mg/LBA 0.5mg/L2,4-D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1mg/LBA 1mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。
3.3.3培养基的硬度在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低[8]，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。
3.3.4培养基中水的硬度的影响硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡[8]。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。
3.3.5培养基的pH值在水稻体细胞培养中，pH值为4.5-5.0时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为5.5-6.0时，愈伤组织严重褐变[9]。一般来说，酸性环境(pH值为4.5-5.0)不利于褐变过程的发生[10]。
3.3.6培养条件如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，细胞内CO32-增多，CO32-与细胞膜上的CO32-结合，使有效CO32-减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变[11]。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。
3.4添加褐变抑制剂和吸附剂
褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚[12]。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在水稻细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2 结合，从而降低了其活力。陈学森等[13]在对植酸在银杏组织培养中应用的研究中也证实了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。
常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等,从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变[15]。
3.5进行细胞筛选和多次转移
在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。
参考文献：
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[2]符近.三种不同类型种子休眠萌发及马占相思种子老化过程的研究.北京农业大学硕士研究生论文,1996.
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[6]何琼英等.抗坏血酸预处理阻止香蕉吸芽外植体褐变的研究初报.华南农业大学学报,1995,16(3):79～82.
[7]张妙霞.柿树组织培养防止外植体褐变的研究.河南农业大学学报,1999,33(1):87～91.
[8]金坚敏.水稻幼穗和成熟种子诱导胚状体时的有关因子探讨.植物学通报，1992,9(2):53～54.
[9]金坚敏.水稻幼稿和成熟种子诱导胚状体时的有关因子探讨.植物学通报,1992.
[10]王东霞等,如何对抗植物组织中的组织褐变，中国花卉盆景,2002,12:29～30.
[11]姚洪军,罗晓芳,田砚亭.植物组织培养外植体褐变的研究进展.北京林业大学学报,1999,21(3):78～83.
[12]蔡金星等.不同品种梨多酚氧化酶特性及其抑制剂的研究.河北农业技术师范学院学报,1999,13(1):55～57.
[13]陈学森,张艳敏等，植酸在银杏组织培养中应用的研究.天然产物研究与开发,1997,9(2):24～27.
[14]刘用生.植物组织培养中活性炭的使用.植物生理学通讯,1994,30(3):214.
[15]姚洪军等.植物组织培养外植体褐变的研究进展.北京林业大学学报,1999,21(3):78～84.
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植物组织培养
植物组织培养即植物无菌培养技术，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官、组织或细胞，如根、茎、叶、花、果实、种子、胚、胚珠、子房、花药、花粉以及贮藏器官的薄壁组织、维管束组织等，在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。至今，世界各国在无性系繁殖、花卉育种、植株脱病毒和种质保存等方面，广泛应用组织培养技术。
（一）组织培养技求的应用
1．无性系繁殖无性系繁殖是植物组织培养应用的主流之一，用植物组织培养进行无性繁殖的优点是，用材少，速度快，不受气候、季节、基质等自然条件的影响，比传统的常规繁殖方法要快得多，人们又叫它'快速繁殖'或'微型繁殖'。其常见繁殖方式有短枝扦插、芽增殖、原球茎、器官分化和胚状体发生。其中芽增殖在盆栽花卉繁殖中应用最为普遍，如草本植物四季秋海棠、鸡冠花、万寿菊、长春花，观叶植物蟆叶秋海棠、网纹草、花叶芋、天鹅绒竹芋，木本植物三角花、比利时杜鹃、月季、八仙花等，在生产实践中，均已取得较好的经济效益。原球茎培养在大花蕙兰、蝴蝶兰、美丽兜兰、石斛、春兰等兰科植物和肾蕨、凤尾蕨、鹿角蕨等观赏蕨的规模性生产中得到广泛应用。胚状体培养，据报道目前已在30个科150种植物上观察到它们的愈伤组织可以分化出胚状体，而盆栽花卉中的花叶芋、山茶花都是成功的范例。器官分化主要是从外植体直接产生不定芽或不定根，一般不通过从愈伤组织进行器官分化形成植株，因为其性状有可能发生变化或经过多次继代培养后，会丧失再生植株的能力。
2．花卉育种当今盆栽花卉育种中，也广泛应用组培技术。
胚培养：在花卉种间杂交或远缘杂交中，有时虽然能正常受精，但胚往往发育不完全或胚与胚乳间不亲和，不能得到种子，可采用胚的早期离体培养促使胚正常发育，培养出杂交后代。如山茶花、百合和鸢尾杂交中均采用幼胚培养，成功地收到了杂交种子。同时，在杂交中受精困难，也可把未受精的胚珠分离出来，在试管内用花粉受精来解决，这在草本花卉花菱草中已取得成功。
单倍体育种：利用花药培养诱导花粉形成单倍体，在试管培养中通过秋水仙素处理，使染色体加倍，而成为纯合二倍体植物，从而缩短新品种育种的时间，还有利于突变中隐性突变的分离。这在花卉的株型、花色、花型的大小或重瓣，叶型、叶色等产生变异，往往有直接利用价值。这在矮牵牛的育种中已应用。
体细胞杂交和植物基因工程：利用原生质体遗传操作技术，可以从原来不大可能进行杂交的不同属植物间获得体细胞杂种或核质杂种。可以通过摄取外源目的基因，定向改造植物的某些重要性状。
3．植株脱病毒用无性繁殖方法来繁衍的花卉种类如菊花、香石竹、郁金香、百合、白鹤芋等，不能通过种子途径去除病毒，用化学方法防治和高温处理往往成效不稳定。作为组织培养的无性繁殖材料，最好是去病毒组织，否则易导致病毒积累，危害加重。而植物的茎尖部分无维管束，病毒难以侵入。所以，茎尖培养是获得无病毒植株的最好途径。至今，茎尖培养脱毒法已在菊花、百合、香石竹、郁金香等盆栽花卉上推广使用。
4．种质保存用无性繁殖的植物，因没有种子，只能在植物园内长期栽培保存，耗费大量的土地和劳力。种质材料还易受自然环境的变化和病虫危害而流失。若用组织培养方法，保存愈伤组织、胚状体、茎尖等组织，可节省大量人力和物力。
（二）组织培养的几个步骤
1．材料的选用一般用于组织培养的材料称为外植体。常分为两类。一类是带芽的外植体，如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等，组织培养过程中可直接诱导丛生芽的产生。其获得再生植株的成功率较高，变异性也较小，易保持材料的优良性状。另一类主要是根、茎、叶等营养器官和花药、花瓣、花轴、花萼、胚珠、果实等生殖器官。这一类外植体需要一个脱分化过程，经过愈伤组织阶段，再分化出芽或产生胚状体，然后形成再生植株。
外植体的取用与组织部位、植株年龄、取材季节以及植株的生理状态、质量，都对培养时器官的分化有一定影响。一般阶段发育年幼的实生苗比发育年龄老的栽培品种容易分化，顶芽比腋芽容易分化，萌动的芽比休眠芽容易分化。在组织培养中，最常用的外植体是茎尖，通常切块在0．5厘米左右，太小产生愈伤组织的能力差，太大则在培养瓶中占据空间太多。培养脱毒种苗，常用茎尖分生组织部，长度为0．1毫米以下。
2．外植体的消毒植物组培能否取得成功的重要因素之一，就是保证培养物在无菌条件下安全生长。为此，必须抓好外植体的消毒和实行无菌操作。
由于培养的植物材料大都采集于田间栽培植株，材料上常附有各种微生物，一旦被带入培养基，即会迅速繁殖滋长，造成污染，培养失败。所以培养前必须对外植体进行严格的消毒处理，消毒的尺度为既能全都杀灭外植体上附带的微生物，但又不伤害材料的生活力。因此，必须正确选择消毒剂和使用的浓度、处理时间及程序。目前，常用的消毒剂有次氯酸钙、氯化汞、次氯酸钠、双氧水、酒精（70％）等。具体消毒方法如下：
（1）茎尖、茎、叶片的消毒消毒前先用清水漂洗干净或用软毛刷将尘埃刷除，茸毛较多的用皂液洗涤，然后再用清水洗去皂液，洗后用吸水纸吸干表面水分，用70％酒精浸数秒钟，取出后及时用10％次氯酸钙饱和上清液浸泡10～20分钟。或用2％～10％次氯酸钠溶液浸泡6～15分钟。消毒后用无菌水冲洗3次，用无菌纱布或无菌纸吸干接种。
（2）根、块茎、鳞茎的消毒这类材料大都生长在土中，常带有泥土，挖取时易遭损伤。消毒前必须先用净水清洗干净，在凹凸不平处以及鳞片缝隙处，均用毛笔或软刷将污物清除干净，用吸水纸吸干后，在70％酒精中浸一下，然后用6％～10％次氯酸钠溶液浸5～15分钟，或用0．1％～0．2％氯化汞消毒5～10分钟，最后用无菌水清洗3～4次，用无菌纱布或无菌纸吸干后接种。
（3）果实、种子的消毒这类材料有的表皮上具有茸毛或蜡质，消毒前先用70％酒精浸泡几秒钟或2～10分钟，然后用饱和漂白粉上清液消毒10～30分钟或2％次氯酸钠溶液浸10～20分钟，消毒后去除果皮，取出内部组织或种子接种。直接用种子或果实消毒，经消毒后的材料均须用无菌水多次冲洗后接种。
（4）花药、花粉的消毒植物的花药外面常被花瓣、花萼包裹着，一般处于无菌状态，只需采用表面消毒即可接种。通常先用70％酒精棉球擦拭花蕾或叶鞘，然后将花蕾剥出，在饱和漂白粉上清液中浸泡10～15分钟，用无菌水冲洗2～3次，吸干后即可接种。
3．组织培养的条件接种后的培养容器置放培养室，室温应控制在23～26℃，每天12～16小时光照，光照度为1000～3000勒克斯。
4．外植体的增殖接种后的外植体要分化出丛状芽、愈伤组织或胚状体，必须对培养基及激素的种类和浓度进行严格的设计和筛选。常用的基本培养基为MS培养基，激素的种类和浓度对外植体的分化和增殖起到重要的作用。也就是说不同的花卉种类对激素的种类和浓度是有差别的（表4－－3）。
5．诱导生根继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，要促使试管苗生根，必须转移到生根培养基上，生根培养基一般应用1／2MS培养基，因为降低无机盐浓度有利于根的分化。同时，不同盆栽花卉诱导生根时所需要的生长素的种类和浓度是不同的（表4－4）。一般常用吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）三种。一般在生根培养基中培养1个月左右即可获得健壮根系。
6．组培苗的移栽生根或形成根原基的试管苗从无菌，温、光、湿度稳定环境中进入到自然环境中，从异养过渡到自养过程，必须经过一个炼苗过程。首先打开试管瓶塞放阳光充足处让其锻炼1～2天，然后取出幼苗用温水将琼脂冲洗掉，移栽到泥炭、珍珠岩、蛭石、砻糠灰等组成的基质中，基质使用前需高温消毒，移栽后要适当遮荫，可用塑料薄膜覆盖，保持较高空气湿度，温度维持在25℃左右，勿使阳光直晒，7～10天后要注意通风和补充浇水，约20～40天，新梢开始生长后，小苗可转入正常管理。
植物组织培养及其应用研究概况
在世界各国科学家的不断努力下，近几十年来，植物组织培养技术迅速发展。利用组织培养，不仅可以大量生产优良无性系，获得人类需要的多种代
谢物质，还可获得单倍体、三倍体、多倍体及非整倍体。通过细胞融合可以打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲合性，在植物新品种的培育和种性的改良中发挥了巨大作用。组织培养的植物细胞是在细胞水平上分析研究的理想材料，从植物快繁、花药培养发展到细胞器培养、原生质融合以及DNA重组技术等，植物组织培养技术广泛应用于植物科学的各个领域及农业、林业、工业、医药等多种行业，已经成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。
1 植物组织培养的基本概念、原理和试验步骤
1．1概念
植物组织培养是在无菌条件下，将离体的植物器官(根尖、茎尖等)、组织(形成层、花药组织等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚胎(成熟或未成熟的胚)、原生质体等在人工配制的培养基上培养，给予适宜的培养条件，诱发其产生愈伤组织或潜伏芽或长成完整的植株的技术。
1．2原理
植物组织培养的依据是植物细胞的“全能性”及植物的“再生作用”。1902年，德国著名植物学家 G．Haberlandt根据细胞学理论提出了一个观点，“高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞，即植物体细胞，体细胞在适当的条件下具有不断分裂、繁殖并发育成完整植株的潜力”。1943年，美国人White在烟草愈伤组织中偶然发现形成一个芽，证实了G．Haberlandt的论点。
不同植物所需要的生长条件不同，所用的培养基也有所不同。较常用的基础培养基有MT、MS、 SH、N6、White等。在组织培养中，愈伤组织和胚状体能否形成是培育出新植株的关键。通过在基础培养基里添加一定浓度的外源激素，可以诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官，最终获得再生植株或次生物质。
用于植物组织培养的材料称为外植体，其主要形式有器官、胚胎、单细胞、原生质体等。根据外植体的不同，所需要的培养基种类、培养条件、外源激素的种类及比例等均不同。植物组织培养中，影响培养力的因素是多方面的，诱导愈伤组织成败的关键在于培养条件，植物激素是诱导愈伤组织和绿苗分化的关键因素。
最常用的诱导愈伤组织的生长素是IAA、NAA和2，4一D，所需浓度为O．01～10 mg／L。最常用的细胞分裂素是KT和ABA，使用浓度为O．1～10 mg／L。KT的主要作用是促进细胞分裂和愈伤组织分化。ABA对植物体细胞胚的发生与发育具有重要作用。各类植物激素的生理作用虽有相对专一性，但是植物的各种生理效应是不同种类激素之间相互作用的综合表现。
1．3试验步骤
1．3．1选择和配制培养基 培养基是植物组织培养中的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。
1．3．2灭茵灭菌是组织培养中的重要工作之一，通常采用物理的或化学的灭菌方法。培养基用常压或高压蒸煮等湿热灭菌、器械采用灼烧灭菌、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌、不耐热的物质采用过滤灭菌、植物材料表面用消毒剂灭菌、物体表面用药剂喷雾灭菌、接种室等空间采用紫外线或熏蒸灭菌。
1．3．3接种将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块放入培养基，整个接种过程要在无菌条件下进行。
l.3．4培养把培养材料放在有一定光照和温度等条件的培养室里，使之生长、分裂和分化，形成愈伤组织或进一步分化成再生植株。
1．3．5试管苗驯化移栽 试管苗是在特殊环境条件下生长的幼苗，与自然生长的幼苗有很大差异，只有通过驯化，使之适应自然环境后才能移栽。
2 植物组织培养的应用
2．1植物快速繁殖和无病毒种苗生产
植物快速繁殖技术始于20世纪60年代，法国的Morel用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功，从此揭开了植物快速繁殖技术研究和应用的序幕。目前，通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有100多科1 000种以上，有的已经发展成为工业化生产的商品。世界上80％～85％的兰花是通过组织培养进行脱毒和快速繁殖的。培养的植物种类也由观赏植物逐渐发展到园艺植物、大田作物、经济植物和药用植物等。在我国，同类的研究始于20世纪70年代。马铃薯无毒种薯和甘蔗种苗已在生产上大面积种植，30余种植物已进行规模化生产或中间试验。利用组织培养进行植物快速繁殖及无病毒种苗生产，不仅能够挽救珍惜濒危物种，而且能够解决植物野生资源缺乏的问题。
2．2植物花药培养和单倍体育种
将植物花药培养成单倍体植株，再经过染色体加倍，能很快得到纯合的二倍体，这样将大大缩短育种年限。到目前为止，世界上通过花粉和花药培养已获得了几百种植物的单倍体植株。印度科学家应用这种方法培育的水稻品系，比对照产量提高15％～49％。韩国先后育成了5个优质、抗病、抗倒伏的水稻品种。我国自20世纪70年代开始该领域的研究，已经培育了40余种由花粉或花药发育成的单倍体植株，其中有10余种为我国首创。玉米获得了100多个纯合的自交系；橡胶获得了二倍体和三倍体植株。仅“九五”期间就育成高产、优质、抗逆、抗病的农作物新品种44个，种植面积超过660万 hm2。
2．3植物胚胎培养
杂交育种中，杂种胚常常败育，因此将早期生长的胚取出，应用组织培养方法，就有可能培育出杂交植物。已经有100篇以上幼胚培养成为植株的报道。国内外科学家应用植物胚胎培养技术获得了多种远缘杂交的重组体、栽培种和杂交品种。
2．4植物愈伤组织或细胞悬浮培养
利用植物愈伤组织或细胞悬浮培养可以生产用于预防和治疗疾病的植物次生代谢产物。近年来，这一领域的发展极为迅速，已经研究了400多种植物，从培养细胞中分离到600多种次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于原植物，20种以上干重超过原植物的1 9，6。例如，从薯芋愈伤组织和悬浮细胞生产的diosgenin用于合成甾体药物。最近抗癌药物紫杉醇一红豆杉细胞培养物，可用75t发酵罐培养，已达到商业化生产水平。另外，达到商品化水平的还有紫草、人参、黄连、老鹳草等；长春花、毛地黄、烟草等已实现工业化生产；牙签草、红花等20多种植物正在向商品化过渡。
2．5细胞融合与原生质体培养
自1960年英国学者Cocking首次利用纤维素酶从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功以来，到1990年已有100种以上植物的原生质体能再生植株。我国获得了30余个品种的原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物，如大豆、水稻、玉米、小麦、谷子、高梁、棉花等。在木本植物、药用植物、蔬菜和真菌原生质体培养方面的进展也十分迅速。国外已先后获得了种内及种间的体细胞杂种植株。植物原生质体培养还可应用于外源基因转移、无性系变异及突变体筛选等研究，因而越来越受到人们的重视。
2．6植物细胞突变体筛选
植物细胞突变体的筛选最早始于1959年，G． Melchers在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。1970年，P．S．Carlson，H．Binding和Y．M． Heimer等分别分离出烟草营养缺陷型细胞、矮牵牛抗链霉素细胞系及烟草抗苏氨酸细胞系。迄今为止，已经在不少于15个科45个种的植物细胞培养中筛选出100个以上的植物细胞突变体或变异体。其中包括抗病细胞突变体，如玉米抗小斑病突变体和小麦抗赤霉病、根腐病突变体；抗氨基酸及其类似物细胞突变体，如甘蓝型油菜抗HYP突变体[263；抗逆境胁迫细胞突变体，如水稻耐盐突变体和小麦抗盐突变体；抗除草剂细胞突变体及营养缺陷型细胞突变体，如玉米抗除草剂变异体；株高突变体的筛选，如水稻矮秆变异体。
2．7植物体细胞胚胎和人工种子
1958年，Reinert在胡萝卜的组织培养中最先发现了体细胞胚胎(胚状体)。据不完全统计，能大量产生胚状体的植物有43科92属100多种。一些重要作物如水稻、小麦、玉米、珍珠谷等，也能通过离体培养产生胚状体。这些胚状体用褐藻酸钠等包埋，再加上人工种皮，就形成了人工种子。人工种子的优点是：繁殖快速，成苗率极高；不受气候影响，四季皆可工厂化生产。上世纪80年代初，美、日、法等国家相继开展了人工种子的研究，我国也于“七五”期间开展了此项研究，并于1987年列入了国家“863”高技术研究发展计划。
2．8 植物组织细胞培养物的超低温保存与种质库建立
植物细胞全能性的发现和证实，为植物种质资源的长期保存开辟了一条新途径。采用液氮超低温保存技术，能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。如建立茎尖分生组织培养物的超低温保存种质库，不仅可以防止种质的遗传变异和退化，而且可以长期保存无病毒的原种。
2．9 植物组织培养与转基因技术的应用
我国第一个T—DNA插入突变体库的构建和研究为我国水稻功能基因组学研究奠定了良好的技术和材料基础，为确保我国拥有一批有自主知识产权的基因资源做出了积极贡献。由中国水稻研究所农业部水稻生物学重点开放实验室和中科院上海植物生理研究所合作，通过建立大规模、高效的农杆菌介导的转基因技术体系，将玉米转座子Ac—Ds等外源基因导入水稻未成熟胚和种子诱导的愈伤组织，获得了1．2万个独立的T—DNA插入株系，并构建了水稻突变体的数据库。
3 展望
植物组织培养研究与应用是20世纪科技进步的重大成果之一，为研究植物生长发育、抗性生理、激素及器官发生与胚胎发生等提供了许多良好的实验材料和有效途径。植物组织培养方法不断提高的同时，也相应拓宽了其应用范围。由于组织培养在人工控制的条件下进行，容易掌握花芽分化和开花成因；通过胚胎培养，能够得到杂种或自交种；通过分离单倍体细胞，能培育纯合的二倍体优良品系；提高育种多样性的同时缩短了育种时间；通过突变体筛选，提高植物的品质，增强抗逆境胁迫能力，扩大植物的生长范围；将体细胞冷藏在低温下，建立基因库，达到保存物种的目的；获得药用价值高和工业生产所需要的次生产物，加快药物生产的时间并且减少了单纯依靠天然植物的被动性。植物组织培养技术已经渗透到科研、生产和生活各个领域，必将日臻完善。
黑龙江农业科学2006，(3)
(1)单倍体育种单倍体植株往往不能结实，在培养中用秋水仙素处理，可使染色体加倍，成为纯合二倍体植株，这种培养技术在育种上的应用称为单倍体育种。单倍体育种具有高速、高效率、基因型一次纯合等优点，因此，通过花药或花粉培养的单倍体育种，已经作为一种崭新的育种手段问世，并已开始育成大面积种植的作物新品种。在单倍体育种方面，我国科学家做出了突出贡献。1974年就育成了世界上第一个作物新品种--单育1号烟草品种。随后又育成了中花8号水稻和京花1号、京单92-2097小麦等面积栽培的作物新品种，还获得了多种作物的大量花培新品系。河南省在花培育种方面卓有成效，培育出了花培28、花配 2321、峡麦1号、豫麦1号、豫麦37号、花9、花特早、豫麦60号等优良品种(系)，已累计推广700多万亩，在全国名列前茅。
(2)胚胎培养在植物种间杂交或远缘杂交中，杂交不孕给远缘杂交带来了许多困难。而采用胚的早期离体培养可以使胚正常发育并成功地培养出杂交后代，可以通过无性系繁殖获得数量较多、性状一致的群体，胚培养已在50多个科属中获得成功。远缘杂交中，可把未受精的胚珠分离出来，在试管内用异种花粉在胚珠上萌发受精，产生的杂种胚在试管中发育成完整植株，此法称为“试管受精”。用胚乳培养可以获得三倍体植株，为诱导形成三倍体植物开辟了一条新途径。三倍体加倍后可得到六倍体，可育成多倍体新品种。
(3)细胞融合通过原生质体融合，可部分克服有性杂交不亲和性，而获得体细胞杂种，从而创造新种或育成优良品种，这是组织培养应用最诱人的一个方面，目前已获得40余个种间、属间、甚至科间的体细胞杂种、愈伤组织，有些还进而分化成苗。目前，采用原生质体融合技术已经能从不杂交的植物中如番茄和马铃薯、烟草和龙葵、芥菜等获得属间杂种，但这些杂种尚无实际应用价值。随着原生质体融合、选择、培养技术的不断成熟和发展，今后可望获得更多有一定应用价值的经济作物体细胞杂种及新品种。
(4)基因工程用基因工程的方法，把目标基因切割下来并通过载体使外来基因整合进植物的基因组是完全有可能的，这项研究如果获得成功，将克服作物育种中的盲目性，而变成按人们的需要操纵作物的遗传变异，育成优良品种，目前这项研究刚刚起步，加上植物的遗传背景比原核生物更为复杂，因此，要用基因工程实现作物改良，以增加产量和改善品质，将是21世纪需要解决的一个问题。
(5)培养细胞突变体无论是愈伤组织培养还是细胞培养，培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件和外界压力(如射线、化学物质等)的影响而产生诱变，从中可以筛选出对人们有用的突变体，从而育成新品种。尤其对原来诱发突变较为困难、突变率较低的一些性状，用细胞培养进行诱发、筛选和鉴定时，处理细胞数远远多于处理个体数，因此一些突变率极低的性状有可能从中选择出来。例如植物抗病虫性、抗寒、耐盐、抗除草剂毒性、生理生化变异等的诱发，为进一步筛选和选育提供了丰富的变异材料。目前，用这种方法已筛选到抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的突变体，有些已用于生产。
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