牛乳中嗜冷性杆菌的分离鉴定及PCR快速检测
吴敏
（生物与化学工程学院 指导教师：刘士旺 ）
摘 要：随着生活的改善，消费者对乳制品质量要求的日渐提高，乳制品中微生物的污染程度成为影响市场竞争的关键因素。牛乳在贮存过程中，大多数嗜冷菌，主要是假单胞菌属和一些杆菌属等，会产生耐受巴氏消毒甚至UHT处理的蛋白酶和脂肪酶，分解牛乳中的蛋白质和脂肪。分解产物将导致乳制品风味改变，品质降低，保质期缩短，对产品的形象和消费者的健康都造成了最大的危害。不同地区的嗜冷菌微生物种类和数量及分布规律有所差异，这种差异主要来自环境、设备及人员等。因此，要减少嗜冷菌的危害，早期对牛奶原料中嗜冷菌的检测和控制是关键。本论文通过牛肉膏蛋白胨培养基及CVT培养基分离纯化牛乳中的嗜冷菌，通过形态学观察和生理生化试验，初步确定其所在的菌属，根据菌属特异性基因序列设计PCR引物，提取基因组DNA进行PCR快速检测，最后进行测序比对确定具体菌属。
关键词：牛乳；嗜冷菌；分离纯化；生理生化试验；PCR
Abstract: As living standards improved, consumers are much more concerned about the quality of dairy products. Microorganism contamination of dairy products has been a key factor in intense market competition. When lac vaccinum is in reserve, most psychrophilic bacteria, mainly Pseudomonas and Xanthomonas, produce proteinase and lipase which tolerate pasteurization even UHT curing, reducing protein and grease. Cleavage products will change special flavor, deteriorate quality, shorten deadline, heavily influence the quality of dairy products, which will damage the products image and consumer health. The species, quantity and distribution of psychrophilic bacteria are different in each area, and the difference lies in environment, equipment and staff. The control and detection of lac vaccinum in early stage is pivotal to reduce the hazard of psychrophilic bacteria. The text discusses the isolation and decontamination, physiological reaction and PCR detection of psychrophilic bacteria,and then according to the bacteria specificity gene sequence, we designed PCR primer,collected genome DNA for PCR rapid test, tested and contrasted sequence,then confirmed the bacterium.
Keywords: Milk; Psychrophile;Isolating; Microbiological characteristics; PCR
1 绪论
1.1 嗜冷菌概述
1.1.1 定义
自从1887年Forster首次发现在0℃条件下生长的微生物以来，出现了不下十种的描述嗜冷菌[1]的名词。目前较为流行的有两种，即“Psychrophile”以及 “Psychrotroph”。Morita[2]将那些最适生长温度≤ l5℃，上限生长温度≤20℃，下限生长温度≤0℃的微生物称为“Psychrophile”；而 Eddy[3] 则将 “Psychrotroph”定义为能在≤5℃条件下生长的微生物，无论其最适及上限生长温度是多少。由此可见，“Psychrotroph”的概念涵盖了“Psychrophile”。目前我们将“Psychrophile”称为专性嗜冷菌，而将除去“Psychrophile”部分称为兼性嗜冷菌，两者合称嗜冷菌。
1.1.2 种类
嗜冷菌的种类繁多，广泛存在于低温环境中。在已经了解的嗜冷菌中，细菌是量和种类最多的一类，常见如革兰氏阴性的假单胞菌属和革兰氏阳性属的较多[4]。嗜冷菌主要分为两类，一类是专性嗜冷菌(Psychrophiles)，最高生长温度不高于20℃，最适生长温度为15℃，在0℃仍然可以生长繁殖；另一类是兼性嗜冷菌(Psychrotrophics)，又名耐冷菌，最高生长温度高于20℃，最适生长温度高于15℃，在0～5℃仍然可以生长繁殖的微生物[5]。专性嗜冷菌主要分布在常冷低温区，对温度的变化比较敏感，20℃以上即很快引起死亡。而兼性嗜冷菌分布范围较宽，从常温到不稳定的低温环境都能分离到。因此，低温保藏的原料乳也是它们的生长环境之一。原料乳中以兼性嗜冷菌为主，目前分离到的有假单胞菌属、一些杆菌属、克雷伯氏菌属[6]。
1.1.3 危害
嗜冷菌导致奶产品变质，产品表现为产酸，产气，产黏或同时产酸产气，蛋白热稳定性下降或呈粥样，带苦味，且异味严重。故嗜冷菌污染是影响保质期的主要因素。
嗜冷菌在低温冷藏时会大量繁殖，这些细菌经加热即可被杀死，但是其中的假单胞菌属可产生极其耐热的蛋白酶，脂肪酶，这些酶经过140℃的处理，仍然有10%的残留。蛋白酶是导致牛乳凝胶沉淀、产生苦味的原因。脂肪酶可水解牛奶中的脂肪球，产生游离的短链脂肪酸而使保存的牛奶腐败，导致产品发生变化，从而严重影响乳品品质和乳品工业的发展[7]。
1.1.4 应用及理论研究前景
低温酶在工业上的应用[8]优势在于这类酶催化反应最适温度较低，可以节约能源。嗜冷菌在发酵过程中能减少中温微生物的污染。而另一方面，利用专性嗜冷菌进行工业生产可能要耗费较多的冷却水，同时会遇到底物在低温条件下溶解性降低等问题。因此嗜冷菌在工业上的应用既有优势也有缺点。
在食品加工方面，低温酶同样具有重要应用价值。加工奶酪过程中的凝乳酶已逐渐由微生物凝乳酶代替。而微生物凝乳酶有较高的热稳定性，在奶酪制作后续工艺中需要在较高温度下将其灭活，过高的温度会影响奶酪的风味，并消耗较多能量，而稳定性较弱的嗜冷菌凝乳酶有助于解决这一问题。不饱和脂肪酸对人类健康有重要作用，嗜冷菌细胞膜不饱和脂肪酸[9]含量很高，是不饱和脂肪酸新的来源。嗜冷菌容易污染冷藏食品，其中一些菌株还能产生耐热毒素，这对人类健康造成威胁。对嗜冷菌的研究将使我们更有效地控制这类微生物对食品的污染。
一些兼性嗜冷的假单胞菌可产生冰核蛋白，提高冰点，易使农作物遭受冻害，人们可以在农田中撒播不产生冰核蛋白的突变株，使其占优势，减轻冻害对农作物造成的影响。利用这类微生物人工造雪制冰，可节约大量能量。嗜冷菌的一个重要应用领域是环境保护。有研究表明嗜冷菌在消除海洋的高山低温环境油污过程中能起到至关重要的作用。
基因工程技术的发展为嗜冷菌的应用提供了更加广阔的前景，人们不仅可以将嗜冷菌的基因克隆至中温宿主菌表达，以获得大量有应用价值的低温酶和蛋白质，还可将中温微生物基因克隆至低温宿主菌表达，赋予后者一些新的特性，拓宽其应用范围。了解低温酶的耐低温机制不仅丰富和加深了人们对酶作用机理的了解，也为人们利用蛋白质工程技术改造天然酶提供理论依据。
1.2 分子生物学研究进展
1.2.1 常用的细菌DNA提取方法
目前常用的细菌DNA提取方法有水煮法，传统法，Genomic DNA Kit法和E.ZNA Kit法。
水煮法的费用低，步骤简洁，耗时短，减少了DNA及外源DNA的污染机会，不需要酚—氯仿抽提及DNA沉淀，避免了有机溶剂对人体的伤害。较其他的方法，提取DNA的量显著增加；但与Genomic DNA Kit法和E.ZNA Kit法相比,DNA的纯度显著降低（P<0.05）。该法比较适用对DNA纯度要求不高的PCR，RAPD实验，因高温使DNA变性，该法不适于限制性内切酶酶切分析。
传统法是目前最可靠的DNA提取方法，所需费用低，但操作繁琐，耗时长，DNA损失量大，产率低，且有污染和毒性作用。与Genomic DNA Kit法和E.ZNA Kit法相比，传统法提取的DNA纯度显著降低(P<0.05)。传统法适用于初学者或经费有限的实验室。
Genomic DNA Kit法操作简便，整个提取过程仅半小时，提取的DNA纯度虽不及E.ZNA Kit法，但显著高于水煮法、传统法(P<O.05)。该法提取的DNA量较少，费用昂贵，不适于大量标本处理。
E.ZNA Kit法是利用Hibind基质这种新硅基材料可逆结合的特点。结合迷你柱旋转分离技术。再加上一套特别配制的缓冲液系统．使细菌DNA结合到基质上，最后用无菌去离子水洗脱出来。E.ZNA法代表一种新的DNA提取方法，避免了苯酚、氯仿对人体的伤害。提取的DNA量大，提取的纯度高，与其它方法比较有显著差异(P<O.05)。本法所得的DNA可用于测序。酶切、连接、转化、PCR、文库筛选等。但该法操作繁琐，耗时，操作过程中有时会出现蛋白酶消化不完全所致柱子阻塞现象。导致DNA提取量下降或提取失败，适量的蛋白酶及充分温育[10]，可避免此现象。
1.2.2 在PCR引物中加入酶切位点或引入突变点
PCR产物的末端为平端，可以用T4噬菌体多核苷酸酶将其磷酸化并用常规技术克隆到通用载体上；但若在引物中引入适当的酶切位点，可以使PCR产物的克隆效率更高。
引物的5’端存在不配对碱基，并不影响它引导DNA合成的能力。当引物与模板结合时，只要引物的3’端有15个碱基左右的核苷酸序列能正确配对，即可引导DNA链的合成。在引物5’末端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。因此，在引物中可改变几个核苷酸，引入特定酶切位点。
在引物中引入酶切位点时，引物的序列设计与前面提到的方法略有不同。引物序列不能完全取自设计链模板，而只有一部分与待增序列相同或互补。在引物中引入酶切位点，要注意位点的5’端上游不能少于3个核苷酸，否则这个位点是切不开的。有些酶至少需要7个核苷酸。如有可能，特别是有可利用的碱基时，可以把位点放在引物中间。这样设计的引物，扩增效果与扩增后的PCR产物酶切效果都很好。
在PCR的首轮反应中，引物与模板并不完全配对。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板并不配对的序列将被带到双链DNA（PCR产物）中去，因而反应产物既含有目标序列，同时两侧又有新的限制酶切识别位点，用相应的限制酶切割这些位点后，便可将DNA扩增产物高效地插入带有相应末端的载体中去。
在引物设计时，除了可以在5’末端加上限制性内切核酸酶位点，还可以加入其他短的序列，如起始密码子ATG、终止密码子或错配碱基造成突变。
2 实验部分
2.1 嗜冷菌的分离鉴定
2.1.1 主要药品试剂
牛肉浸膏（生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂）；
蛋白胨（生化试剂，南通东海龙生生物制品有限公司）；
酵母浸膏（生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂）；
葡萄糖（分析纯，广东省化学试剂工程技术研究开发中心）；
结晶紫（分析纯，上海远航试剂厂）；
2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)（分析纯，上海华东师范大学化工厂）；
香柏油（上海标本模型厂）；
二甲苯（杭州化学试剂有限公司）。
2.1.2 主要实验仪器
电子天平(TIANYI/JA1003，上海上平仪器公司)；
托盘天平(HC-TP11-10架盘药物天平，上海精科天平)；
高压蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-50SI立式蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；
净化工作台(SW-CJ-1B型单人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司)；
培养箱(MJX-160B-Z，MJX-250B-Z霉菌培养箱，上海博迅实业有限公司)；
显微镜(Nikon/YS100，南京江南光电股份(集团)新兴光学仪器有限公司)；
2.1.3 乳样品
杭州某品牌乳业有限公司提供的6个不同牧场原料乳。
2.1.4 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15～20g，水1000ml；调节pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。
CVT选择性培养基：酵母膏2.5g，蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，结晶紫0.001g，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)0.05g，琼脂15.0g，水1000ml；调节pH6.0，121℃灭菌20min。
2.1.5 稀释液
氯化钠2.250g，氯化钾0.105g，氯化钙0.060g，碳酸氢钠0.050g，蒸馏水1000ml；调节pH6.9±0.1，121℃灭菌15min[11]。
2.1.6 样品乳嗜冷菌的分离鉴定
采用稀释涂布平板法与平板划线分离结合的方法，分离纯化牛乳中的嗜冷菌后，进行革兰氏染色镜检。
在超净工作台中，用1ml、10ml无菌移液管分别移取1ml样品乳和9ml稀释液于无菌空三角烧瓶中混匀。
用1ml移液管移取0.1ml稀释样品乳涂布在牛肉膏蛋白胨和CVT平板培养基表面，放置于4℃、15℃和20℃中倒置培养，记录培养情况。
待菌落生成，挑取单菌落在CVT培养基上进行划线分离纯化，标注菌种来源、培养时间和温度。
单菌落分离纯化数次后，挑取菌落细胞进行革兰氏染色镜检。
2.2 生理生化试验
2.2.1 主要试剂
3%过氧化氢（分析纯，中外合资上海远大过氧化物有限公司）；
甲基红（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；
肌酸（生化试剂，国药集团化学试剂有限公司）；
对二甲基苯甲醛（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；
对氨基苯磺酸（分析纯，五联化工厂）；
α-萘胺（分析纯，上海亭新化工
试剂厂）；
二苯胺（分析纯，远航试剂厂）。
2.2.2 培养基
①甲基红(V.P)培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO4(NaCl) 5g，水1000ml，PH 7.0~7.2。
②淀粉培养基：在肉汁胨中加0.2%可溶性淀粉。
③硝酸盐还原培养基：肉汁胨培养基，pH7.0~7.6。
④吲哚培养基：1%胰胨水溶液，pH7.2~7.6。
2.2.3 嗜冷菌的生理生化试验
①接触酶试验
将24h培养的斜面菌种,以铂丝环接种针取一小环涂抹于已滴有3%过氧化氢的玻片上,如有气泡产生则为阳性,无气泡产生则为阴性。
②甲基红试验
将接种试验菌于甲基红培养液中，每次两个重复，置适温培养2、6天。在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性反应，黄色为阴性反应（甲基红变色范围4.4红至6.0黄）。
③V-P测定
取培养液和40%氢氧化钠等量相混。加少许肌酸，10min如培养液出现红色，即为试验阳性反应，有时需要放置更长时间才出现红色反应。
④淀粉水解
取新鲜斜面培养物点种于淀粉水解试验平板，适温培养。观察2-5天，形成明显菌落后，在平板上滴加碘液平板呈蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈，表示淀粉水解为阳性；仍为蓝黑色为阴性。
⑤硝酸盐还原
将测定菌种接种于硝酸盐液体培养基中，置适温培养1，3，5天。每株菌作二个重复，另留两管不接种作对照。取二支干净的空试管中倒入少许培养1，3，5天的培养液，再各加一滴上述配制的A液和B液，在对照管中同样加入A液，B液各一滴。当培养液中滴入A、B液后，溶液如变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加一、二滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，则表示培养液中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用。如不呈蓝色蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质，故仍应按硝酸盐还原阳性处理。
⑥吲哚试验
接种试验菌于吲哚试验液体培养基中，每次两个重复，置适温培养1、2、4、7天。培养后，沿管壁缓慢加入3～5毫米高的吲哚试剂于培养液表面，在液层界面产生红色，即为阳性反应，若无为阴性反应。
2.3 嗜冷菌的DNA快速提取
2.3.1 主要试剂
十六烷基三甲基溴化铵（分析纯，上海伯奥生物科技有限公司）；
乙二胺四乙酸钠（分析纯，天津市顶福化工总厂）；
Tris(生化试剂，上海思吉生物制品有限公司)。
2.3.2 溶液的配制
CTAB/NaCl溶液 4.1g NaCl溶解于800ml H2O中，缓慢加入10g CTAB，加水至100ml。
TE缓冲液 10mmol/L Tris•Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0），高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
溶菌酶溶液 用10mmol/L Tris•Cl（pH8.0）溶液配制成10mg/mL，并分装成小份（如1.5mL）保存于-20℃中，每一小份一次性使用。
氯仿：异戊醇（24：1）、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、异丙醇、70%乙醇、10% SDS、蛋白酶K（20mg/ml或粉剂）、5mol/L NaCl。
2.3.3 主要实验仪器
台式离心机（Centrifuge 5415D，德国艾本德股份公司）、水浴锅（HB-100恒温金属浴，FerroTec），移液枪（法国Gilson）。
2.3.4 培养基
LB液体培养基:蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调至pH7.5，加去离子水至总体积1000ml，高压下灭菌20分钟。
2.3.5 DNA快速提取
目前，实验室中采用的细菌DNA的提取方法有多种，各种方法的操作步骤、所需时间和成本均不同。主要有沸水法、酚-氯仿法、试剂盒法、Chelexl00法、CTAB/NaCl法等。
本论文采用如下改动的CTAB/NaCl法。
①将菌悬液倒入离心管中，各菌种分别若干管。在12000rpm下离心1min，去上清液。
②同①连续离心两次。
③在上述离心管中加入584μlTE，30.7μl10%SDS，10μlLys。将上述溶液混匀后，37℃摇床保温1h左右，然后在95℃水浴中保温5min。
④加入92.3μl5mol/LNaCl和CTAB/NaCl混匀，在65℃水浴中保温20min。
⑤加入700μl的氯仿：异戊醇（24：1），在11000rpm下离心10min，提取上清液于新的离心管中，加入氯仿：异戊醇（24：1），静置3min左右，在11000rpm下离心10min。
⑥提取上清液，加无水乙醇，在-20℃放置10min，沉淀DNA。
⑦在12000rpm下离心8min，倒掉溶液，加入70%乙醇。静置后，倒掉溶液，并且吸干较多残留液。离心5~6s，干燥。
⑧每管加入30μl重蒸水，混匀，离心5~6s，4℃下保藏。
2.4 牛乳中嗜冷菌的PCR快速检测
2.4.1 主要试剂及配制
双蒸水、10×Buffer（含20mmol/L Mg2+，上海英骏生物技术有限公司提供）、dNTPs、上下游引物（上海英骏生物技术有限公司合成）、Taq DNA聚合酶、DNA模板。
TBE缓冲液（5×） 称取Tris 54g、硼酸27.5g，并加入0.5mol/L EDTA（pH8.0）20mL，定容至1000mL；使用时，取20mL加水至200mL，配制成0.5×TBE稀释缓冲液即可。
1%琼脂糖胶液 称取0.5g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入50mL 0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉（或电炉上）加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀。
溴化乙锭（EB）溶液母液 将EB配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，于室温下保存；使用时，稀释至0.5μg/mL。
DNA回收柱 EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit（BIO BASIC INC.）。
PCR反应体系液：
①PCR反应体系液1（20μl）：模板2μl， Buffer 10×2μl，dNTP1.5μl，16S引物1μl， Taq聚合酶0.5μl，H2O12μl。分装若干PCR管（其中为样品管和一个空白管。）
②PCR反应体系液2（50μl）：模板2μl，Buffer 10×，dNTP，16S引物， Taq聚合酶0.5μl，H2O12μl。分装若干PCR管。
2.4.2 主要实验仪器
BIOER基因扩增仪（杭州博日科技有限公司）；
PTC-100(MJ Research Inc)；
凝胶成像系统（Gene Genius Bio Imaging System，A Division of Synoptics,Ltd.）；
WFH-202B紫外透射分析仪（上海精科实业有限公司）；
GE-100电泳槽（Hangzhou DAHE THERMO-MAGNETICS Co.LTD）；
加样枪（附枪头若干）（法国Gilson）。
2.4.3 PCR反应
⑴ PCR的引物设计：
表2-1 设计的引物序列
引物名称 引物序列
M16S-F 5′-CGCATGGTGGGTGTTGGAAAGA-3′
M16S-R 5′-GACACGAGCTGACGACAACCA-3′
⑵ PCR的基本反应及凝胶电泳成像:
①95℃预变性3min左右，94℃变性30-
60s，54℃退火30-60s，70-72℃延伸30-60s，共进行30次左右的循环。末轮循环在72℃延伸7min左右。反应完毕后将样品取出置于冰浴中待用。
②用微量移液枪小心将PCR反应后的样品液加入琼脂糖胶板样品槽中，总体积在5～7μl。每加完一个样品要更换枪头，防止污染，注意上样时要小心操作，避免戳破凝胶。
③加完样后，放入电泳槽中，立即接通电源，控制电压保持在60～80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前约2cm时，停止电泳。
④电泳完毕后，将凝胶移入0.5μg/mL的EB溶液中，室温下染色20分钟左右。
⑤用凝胶成像系统观察染色后的凝胶，并拍摄凝胶电泳图像。
⑶ PCR产物回收:
①把电泳结束后的凝胶放在紫外透射仪下，DNA存在的位置呈现橙黄色的荧光。把该位置的胶割下来，根据编号放到相应的Eppendorf管中。
②加入Binding Buffer，在65℃水浴中溶化。
③加入到DNA胶回收试剂盒中，敞口放置2min以上，在76000rpm下离心30s，去下层液。
④加入500μl洗脱液，在76000rpm下离心30s。
⑤重复④步，并在11400rpm下离心，以去洗脱液。
⑥将样品转移至PCR管中，加入20-30μl水，溶解DNA。
⑦在65℃水浴中放置1min，并在12000rpm下离心2min。
⑷ 基因组DNA测序：
由上海英骏生物技术有限公司进行测序。
3 实验结果与讨论
3.1 菌种分离纯化
3.1.1 原料奶中菌种的分离纯化
表3-1 原料奶中菌种的形态学观察
形态学观察 3-1 6-6
备注：
实验从6个牧场分别分离出6株菌，经后续的生理生化试验，初步确定表3-2中的3-1，6-6分别表示具有代表性的嗜冷菌的单菌落，其中3-1 为杆菌，6-6为球菌。
3.2 生理生化实验结果
生化实验 3-1 6-6
H2O2试验 ＋ ＋
吲哚试验 － －
甲基红试验 ＋ －
淀粉试验 ＋ ＋
硝酸盐还原试验 － ＋
表3-2 生化反应结果
3.3 提取DNA实验现象
表3-3 提取基因组DNA过程中出现的现象
步 骤 现 象
①-② 离心管底有沉淀
③-④ 开始为白色絮状沉淀，保温后为白色混浊溶液
⑤ 分三层，从上至下分别为：上清液、杂质、有机溶剂
⑦ 静置分两层，上层为油状，下层透明；
离心后分三层，从上至下分别为：上清液、白色薄膜、有机溶剂
备注：用溶菌酶代替蛋白酶K，37℃保温1小时，95℃水浴保温5分钟的条件。亦能基本裂解蛋白质的效果。用氯仿:异戊醇（24:1）代替酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），既能达到实验结果，又能避免饱和酚对人体可能造成的危害。
3.4 PCR快速检测、DNA回收及测序比对结果
3.4.1 电泳结果
电泳结果如图１所示：
图１ 电泳图
备注：从左到右各孔代表1-5，3-1，4-2，4-4，6-6，最后一孔为负对照。从图1中可以清楚地看到，菌3-1出现了特异性的扩增条带。
3.4.2 测序比对
图2 杆菌3-1测序图
备注：鉴于课题的要求，本实验对杆菌3-1进行了测序。从上述的图得知，细菌基因组的DNA序列与不动杆菌属的基因序列有99%同源性。结合前面的形态学观察，生理生化试验，可以确定所分离的菌株为嗜冷的不动杆菌属。
3.5 实验结果与分析
3.5.1 菌种分离纯化
综合分析整个实验过程记录，得出以下结论：
1．当地原料奶中的嗜冷菌以阴性杆菌为主；在CVT培养基上呈现多种菌落特征。本实验分离鉴定出的杆菌3-1呈较湿润的暗红色，周边呈不规则状，且周围有一层较薄的半透明状的粘质。
2．嗜冷菌在20℃培养1-2d有可见菌落生成；在15℃培养3-5d有可见菌落生成；在4℃培养7-10d有可见菌落生成(除专性嗜冷菌5-6d)。
3.5.2 生理生化试验
菌株的生化代谢特征且与相关文献中所报道的嗜冷菌的生化特性一致。
若甲基红（M.R）试验测试的是芽孢杆菌的细胞时，用5gNaCl代替K2HPO4，它有缓冲作用。
V-P测定加试剂后有时需要放置长时间才出现红色反应。
还原硝酸盐反应是在厌氧条件下进行的，实验中没有用矿油封液面，但分装试管时液层不宜太薄，尤其是对生长缓慢的细菌。对不同种的细菌来说，亚硝酸盐可以是硝酸盐还原的最终产物，也可以是整个还原过程的中间产物，有的种还原极为迅速，有的种还原缓慢，因而第一次检查反应结果要及时（以不超过一天为宜），对阴性反应的菌株应连续观察，并且对于未呈现亚硝酸盐反应的测定应检查是否仍有硝酸盐（二苯胺测定），然后才能判断有无硝酸盐的还原反应[12]。
吲哚试验中，若颜色不明显，可加4～5滴乙醚至培养液，摇动，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，等乙醚浮液面后再加吲哚试剂。如培养液中有吲哚时，吲哚可被提取在乙醚层中，浓缩的吲哚和试剂反应，则颜色明显[12]。
3.5.3 PCR操作
PCR操作必须在超净工作台上进行，且要避免样品间的相互污染。实验中设置了严格的阴性对照。前几次实验中曾出现扩增反应总是阴性结果的现象，通过增加酶的浓度，增加靶DNA浓度（由1μl增加至2μl），提纯样品（将粗制品的模板进行提纯），增加扩增次数等不断改变PCR体系液的措施来实现得到阳性结果。在第四次等实验中出现了非特异性产物，是通过提高退火温度等措施来解决的。
4 总结与展望
本论文主要的内容是嗜冷菌的分离鉴定和PCR快速检测。在进行PCR反应前，需根据菌属设计引物并提取细菌基因组DNA。
嗜冷菌的分离鉴定采用的是基本的牛肉膏蛋白胨培养基及专门的CVT选择性培养基，通过革兰氏染色镜检，形态学特征观察，常见细菌生理生化试验（氧化酶试验、M.R试验、V-P试验等）[12]鉴定出所分离的菌株，推测嗜冷菌所属菌属。
接下来根据菌属特异性基因序列设计PCR引物，提取菌株的基因组DNA进行PCR扩增，回收扩增产物DNA进行测序、比对分析。
快速提取嗜冷菌基因组DNA采用改动的CTAB/NaCl法， PCR实验证明了此法提取的基因组DNA满足了PCR的反应要求。设计不同的通用性引物和特异性引物，采用PCR反应扩增模板DNA，琼脂糖凝胶成像系统判断扩增结果，EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit过柱回收DNA进行测序比对，可对牛乳中嗜冷菌分离株进行快速检测。经测序比对确证，进行DNA试剂盒的研发，应用于原料奶和乳制品中嗜冷菌的快速检测，及时有效地控制嗜冷菌的危害，提高乳制品的质量。
嗜冷菌在工业，食品加工，农业，环境保护等
方面有着广泛的应用前景。低温脂肪酶及蛋白酶可作为洗涤剂添加剂，这种洗涤剂可直接加入未经加热的自来水中用来洗衣服，既经济实惠，又可保护衣物。不饱和脂肪酸对人类健康有重要作用，人们现在一般从植物种子和鱼油摄取不饱和脂肪酸，但在资源和生产周期上受到限制。采用微生物发酵生产可弥补这一不足，而嗜冷菌细胞膜不饱和脂肪酸含量很高，是不饱和脂肪酸的一个新的来源。嗜冷菌的一个重要应用领域是环境保护， 特别是通过生物降解作用在原位清除低温环境中的污染物方面显示出其独特的优势。
近年来有关嗜冷微生物的研究日益增多，相信随着研究的持续深入以及生物工程技术的充分利用，嗜冷微生物在生物技术及生命科学研究中的地位将会越来越重要
致 谢
本次毕业设计是在我的导师刘士旺副教授的指导下完成的。老师的实验思路与方法，令我受益匪浅，使得实验中的一些问题能够及时得到解决。他严谨和负责的态度给我留下了深刻的印象。
感谢浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所的吴学龙老师，在PCR扩增反应及后续实验中给予我的关怀与指导。他娴熟的实验操作技术和严格的实验要求，同样使我收获颇丰。
最后感谢搭档叶剑钦同学在实验过程中，给予我的帮助，使得我得实验技能有了一定的提高。
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