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牛乳中假单胞菌属的PCR检测的方式分析

2015-10-08 10:13 来源:学术参考网 作者:未知

牛乳中假单胞菌属的PCR快速检测

学生姓名:  张董兰                  指导教师:刘士旺
(浙江科技学院生物与化学工程学院)

摘 要:本文主要介绍了牛乳中假单胞菌属的鉴定和PCR快速检测。牛乳在储存过程中,大多数是嗜冷菌,主要是假单胞菌属和一些杆菌属等,会产生耐受巴氏消毒甚至UHT处理的蛋白酶和脂肪酶,分解牛乳中的蛋白质和脂肪。分解产物将导致乳制品风味改变,品质降低,保质期缩短,对产品的形象和消费者的健康都造成了最大的危害。为了探索对这一问题的有效解决方法,本文对低温贮藏原料乳中的嗜冷菌进行了研究。通过生理生化试验,初步确定其所在的菌属,利用通用PCR通用引物,提取假单胞菌属的基因组DNA进行PCR快速检测,最后进行测序比对确定其具体菌属。
关键词:假单胞菌属:生理生化试验:DNA提取;PCR
 
PCR For Rapid detection of Pseudomonas in milk

Student’ s name:Zhang Donglan   Advisor: Liu shiwang
(School of Biological and Chemical Engineering Zhejiang University of Science and Technology)
Abstract: This article is about PCR For Rapid detection of Pseudomonas in milk. Microorganism contamination of dairy products has been a key factor in intense market competition. When lac vaccinum is in reserve, most psychrophilic bacteria, mainly Pseudomonas and Xanthomonas, produce proteinase and lipase which tolerate pasteurization even UHT curing, reducing protein and grease. Cleavage products will change special flavor, deteriorate quality, shorten deadline, heavily influence the quality of dairy products, which will damage the products image and consumer health. In order to research the method to solve the problems, the paper studied the psychrophilic bacteria in the raw milk preserved in low temperature. This study discusses the PCR detection of  Pseudomonas bacteria , and the using the bacteria common PCR primer, collected genome DNA for PCR rapid test, tested and contrasted sequence ,the confirmed the bacterium.
Keywords:Pseudomonas ; Physiological and Biochemical;DNA extraction ;PCR
 
目  录
中文摘要 I
英文摘要 II
目录 Ⅲ
1 绪论 1
1.1 假单胞菌属简介 1
1.1.1  概念 1
1.1.2  分类 1
1.1.3  分布 2
1.1.4  危害 2
1.2 分子生物学研究进展 3
1.2.1  DNA的提取方法简介 3
1.2.2  PCR方法简介 4
1.3 立题的根据与意义 5
2 实验内容 7
2.1 生理生化实验 7
2.1.1 主要药品试剂 7
2.1.2  主要实验仪器 7
2.1.3 培养基 7
2.1.4 生理生化试验 8
2.2 DNA快速提取 9
2.2.1 主要试剂 9
2.2.2主要实验仪器 9
2.2.3 培养基 9
2.2.4 DNA快速提取方法 9
2.3 牛乳中假单胞菌属的PCR快速检测 11
2.3.1 主要试剂及配置 11
2.3.2 主要实验仪器 11
2.3.3 PCR反应 12
3 实验结果与讨论 14
3.1 生理生化试验结果 14
3.2 提取DNA实验现象 15
3.3 PCR快速检测、DNA回收及测序比对结果 16
3.3.1 电泳结果 16
3.3.2 测序比对 17
3.4 实验结果与分析 20
3.4.1 生理生化试验 20
3.4.2 DNA提取和PCR操作 21
4 总结与展望 22
致谢 23
参考文献 24
 
1绪论
1.1 假单胞菌属简介
1.1.1  概念
假单胞菌属拉丁学名(Pseudomonas Migula 1894) 直或微弯的杆菌,不呈螺旋状, 0.5~1.0μm×1.5~5.0μm。许多种能积累聚-β-羟基丁酸盐为储藏物质。没有菌柄也没有鞘。不产芽孢。革兰氏阴性,以单极毛或数根极毛运动,罕见不运动者。有的种还具短波长的侧毛。需氧,进行严格的呼吸型代谢,以氧为最终电子受体。在某些情况下,以硝酸盐为替代的电子受体进行厌氧呼吸。不产生黄单胞色素。几乎所有的种不能在酸性条件下生长。大多数种不需要有机生长因子。化能营养异养菌,有的种是兼性化能自养。氧化酶阳性或阴性,接触酶阳性。广泛分布于自然界。有的种对人、动物或植物有致病性。 DNA的G+C为58~70mo1%。 模式种:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [1]。
 1.1.2  分类
Kersters等(1996)根据与假单胞菌属rRNA的关系确定应转移到其它已存在的属或新属中的有:贝氏假单胞菌(P.beijerinckii),甜菜假单胞菌(P.beteli)、北城假单胞菌(P.boreopolis),氢碳酸假单胞菌(P.carboxydohydrogena),杜氏假单胞菌(P.doudoroffi),刺状假单胞菌(P.echinoids),伸长假单胞菌(P.elongata),弯曲假单胞菌(P.geniculata),格氏假单胞菌(P.glathei),栖木假单胞菌(P.hibiscicola),哈特假单胞菌(P.huttiensis),勒氏假单胞菌(P.1emoignei),航海假单胞菌(P.nautica),穿孔素假单胞菌(P.pertucinogena),吩嚎假单胞菌(P.phenazinium),皮克特假单胞菌(P.pictorum),吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia),嗜糖假单胞菌(P.saccharophila)和蒲桃假单胞菌(P.syzygii)。系统发育仍未确定的假单胞菌有:抗微生物假单胞菌(P.antimicrobica),桔黄假单胞菌(P.aurantiaca),产氮假单胞菌(P.azotoformans),青紫葛假单胞菌(P.cissicola),弯曲假单胞菌(P.flectens),黄褐假单胞菌(P. lva),石花菜假单胞菌(P.gelidicola),嗜盐假单胞菌(P.halophila),产靛假单胞菌(P.ndigofera),懒惰假单胞菌(P.iners),柳叶刀形假单胞菌(P.1unceolata),臭味假单胞菌(P.mephitica),硝酸基还原假单胞菌(P.nitroreducens),多刺激假单胞菌(P.sphinosa),稻草假单胞菌(P.straminae)。Holmes(1986,1987)根据与假单胞菌间的DNA_DNA 同源水平很低而新建了2个属:金色假单胞菌属(Chryseomonas)和黄色假单胞菌属(Flavimonas) [2]。

1.1.3  分布
地球上约80%以上的微生物为永久性低温地区(常年低于5℃),包括大面积的海洋两极地区、常年积雪的高山、冰川、湖泊、部分温带湖泊湖底静水层等。温带土壤、部分海洋和湖泊丧层、洞穴等地区温度随季节变化,为非永久性低温地区,在地球上广泛分布的低温地区生存着大量的嗜冷菌。根据温度变化程度的大小,可将低温环境分为稳定低温环境和不稳定低温环境。从稳定低温环境(深海和冰洞)分离的嗜冷菌通常为专性嗜冷菌,相比之下,在不稳定低温环境难以 分离专性嗜冷菌,从其中分离的兼性嗜冷菌生长的温度范围较宽,在极端环境条件下有较强的生存能力。除上述自然环境外,还存在着很多人造低温环境,如冷库、冰箱等[3]。
嗜冷菌种类繁多,在已知的嗜冷菌中,细菌是数量和种类最多的一类,涉及30多个属,其中属于革兰氏阴性的假单胞菌属(Pseudomonas)和革兰氏阳性的芽
胞杆菌属(Bacillus)的较多 ,这些嗜冷菌广泛地分布于各种低温环境中。除细菌外,人们在南极的土壤和湖泊中发现放线菌、霉菌、酵母,还在冰雪、海冰中发现低温藻类。
 1.1.4  危害
假单胞菌属导致奶产品变质,产品表现为产酸,产气,产黏或者同时产酸产气,蛋白热稳定性下降或者呈粥状,带苦味,且异味严重[5]。
一般的嗜冷菌在低温冷藏时会大量繁殖,这些细菌经过加热即可被杀死,但是其中的假单胞菌属科产生极其耐热的蛋白酶,脂肪酶,这些酶经过140℃的处理,仍然有10%的残留。蛋白酶是导致牛乳凝胶沉淀、产生苦味的原因。脂肪酶科水解牛奶中的脂肪球,产生游离的短链脂肪酸二使保存的牛奶腐败,导致产品发生变化,从而严重影响乳品品质和乳品工业的发展[6]。
1.2 分子生物学研究进展
1.2.1  DNA的提取方法简介
 (1) 浓盐法
利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M 氯纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来。
也可用0.15 M NaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白。
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些。
以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。通常用0.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.
(2) 阴离子去污剂法
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA 。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。
(3) 苯酚抽提法
苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA 的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 。
( 4) 水抽提法  
利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出。然后分别用66% 、80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用。为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS[7]。
 1.2.2  PCR方法简介
(一) PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引 物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝[8]。
(二)  PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系:
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10~100pmol
模板DNA 0.1~2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素: 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物: 引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增[9]。
(三) 引物设计原则[10]
设计引物应遵循以下原则:
①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。
②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
1.3 立题的根据与意义
总所周知,嗜冷菌广泛存在于低温冷藏食品中,是引起低温食品多种致害的主要原因之一。为了探索对这一问题的有效解决方法,本文对低温贮藏原料乳中的嗜冷菌进行了研究。通过形态学及生理生化特性的研究及PCR快速检测,对筛选的嗜冷菌进行了鉴定分析。本研究为乳制品的致害分析、加工工艺、贮存条件和期限的制定提供了一定的理论依据。
原料乳中有许多细菌,其中嗜冷菌污染是现代乳品加工过程中最常见的问题,也是目前进行大规模液态乳工业化生产面 临的难题。大多数嗜冷菌在低温贮藏时产生耐热性的胞外蛋白酶,这些酶类耐受高温处理,使乳产生凝胶、沉淀、苦味、酸败等不良现象的同时影响产品的色泽。导致乳及乳制品风味、质地的变异,缩短保质期,从而影响产品的质量及加工过程的顺利进行。
在世界很多国家对嗜冷微生物研究的影响下,我国于20世纪80年代中后期开始研究来自冷藏食品、海洋及南极的嗜冷菌,内容涉及菌种的分离鉴定及一些低温酶性质的研究。随着研究的深入开展,在不久的将来定会取得丰硕的成果,为嗜冷菌的应用开拓美好的前景。


 

2 实验内容
2.1 生理生化实验
2.1.1 主要药品试剂
牛肉浸膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、酵母浸膏、葡萄糖、胰蛋白胨;结晶紫、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC);香柏油、二甲苯、乙醚;过氧化氢、卢哥氏碘液、蒸馏水。
2.1.2  主要实验仪器
烧杯、量筒、玻璃棒、涂棒、移液管、培养皿、烧瓶、试管、酒精灯等。
电子天平(TIANYI/JA1003,上海上平仪器公司)。
托盘天平(HC-TP11-10架盘药物天平,上海精科天平)。
灭菌器(YXQ-LS-50SI立式蒸汽灭菌器,上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
净化工作台(SW-CJ-1B型单人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司)。
培养箱(MJX-160B-Z,MJX-250B-Z霉菌培养箱,上海博迅实业有限公司)。
显微镜(Nikon/YS100,南京江南光电股份(集团)新兴光学仪器有限公司)。
2.1.3 培养基
  改良LA培养基  蛋白胨5g,酵母膏2.5 g,葡萄糖1g,脱脂奶粉1 g,琼脂18 g,CPC 0.05 g,结晶紫0.002 g,调节pH7.2,121℃灭菌20分钟。
  LA培养基 蛋白胨5g,酵母膏2.5 g,葡萄糖1g,脱脂奶粉1 g,乳清粉1g,琼脂18 g,调节7.2,121℃灭菌20分钟
甲基红(M.R)试验液体培养基 蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO4(或NaCl)5g、水1000mL,调节pH7.0~7.2,每试管分装4~5mL ,调节pH7.0~7.2,121℃灭菌20分钟。
肉汁胨液体培养基 牛肉浸膏3g、蛋白胨10g、水1000 ml,调节pH7.0~7.2,121℃灭菌20分钟。
淀粉培养基 在肉汁胨固体培养基中加0.2%可溶性淀粉,121℃灭菌20分钟。
硝酸盐还原试验液体培养基 肉汁胨液体培养基1000mL、KNO3 1g,pH7.0~7.6,每试管分装4~5mL,121℃灭菌20分钟。
吲哚试验液体培养基 1%胰胨水溶液,调节pH7.2~7.6,分装1/3~1/4试管,121℃灭菌20分钟。
2.1.4 生理生化试验
接触酶试验 将24小时培养的斜面菌种,以铂丝接种环取一小环涂抹于已滴有3%过氧化氢的玻片上,如有气泡产生则为阳性,无气泡为阴性。
甲基红(M.R)试验 接种试验菌于甲基红(M.R)试验液体培养基中,每次两个重复,置适温培养2、6天(如为阴性可适当延长培养时间)。培养后,在培养液中加入一滴甲基红试剂,红色为甲基红试验阳性反应,黄色为阴性反应。
V-P测定 接种培养方法与甲基红(M.R)试验相同。培养后,取培养液和40%氢氧化钠等量相混。加少许肌酸,10分钟如培养液出现红色,即为V-P试验阳性反应,无红色出现则为V-P试验阴性反应。
淀粉水解试验 取新鲜斜面培养物点种于淀粉培养基,适温培养2~5天,形成明显菌落后,在夹板上滴加碘液。平板呈蓝黑色,菌落周围如有不变色透明圈,表示淀粉水解阳性反应;仍是蓝黑色,表示淀粉水解阴性反应。
硝酸盐还原试验 将测定菌接种于硝酸盐还原试验液体培养基中,置适温培养1、3、5天。每株作两个重复,另留两管不接种作对照。培养后,取两支干净的空试管或在比色瓷盘小窝中倒入少许培养1、3、5天的培养液,再各加一滴格里斯氏(Griess)试剂A液及B液,在对照管中同样加入A液及B液各一滴。溶液如变成粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在,为硝酸盐还原阳性反应。如无红色出现,则可加1~2滴二苯胺试剂,此时如呈蓝色反应,则表明培养液中仍有硝酸盐,又无亚硝酸盐反应,表示无硝酸盐还原作用,为硝酸盐还原阴性反应;如不呈蓝色反应,表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他特技,故仍应按硝酸盐还原阳性反应处理。
吲哚试验 接种试验菌于吲哚试验液体培养基中,每次两个重复,置适温培养1、2、4、7天。培养后,沿管壁缓慢加入3~5毫米高的吲哚试剂于培养液表面,在液层界面产生红色,即为阳性反应,若无为阴性反应。
葡萄糖氧化试验  以18-24h幼龄菌种作种子,穿刺接种,每株4支;其中2支用灭菌的凡士林石蜡油(溶化的2/3凡士林加入1/3液体石蜡,高压灭菌)封盖,约0.5-1cm厚,以隔绝空气为闭管。另2支不封油为开管,同时还要有不接种的闭管和开管对照。15℃培养1,2,3,7,14天观察结果。只有开管产酸变黄者为氧化型;开管和闭管均产酸变黄者为发酵型[2]。
2.2 DNA快速提取
2.2.1 主要试剂
EDTA.Na, RNase A, 溶菌酶,10%SDS,protein K,24:1氯仿:异戊醇
无水乙醇,ETOH。
2.2.2主要实验仪器
台式离心机(Centrifuge 5415D,德国艾本德股份公司)
水浴锅(DK-8D型电热恒温水槽,上海森信有限公司)
振荡器(GL-901 bortex,其林贝尔仪器制造公司)
2.2.3 培养基
LB液体培养基:蛋白胨10g,酵母提取物5g,Nacl 10g,溶于800ml去离子水中,用NaOH调至PH7.5,加去离子水至总体积1000ml,高压下灭菌20分钟。
2.2.4 DNA快速提取方法
目前,实验室中采用的细菌DNA的提取方法有多种,各种方法的操作步骤、所需时间和成本均不同。本次试验用了试剂盒法和CTAB法提取DNA,进行比较。
CTAB法:
① 将菌悬液倒入1.5ml的离心管中,在12000rpm下离心1分钟,去上清液,反复两次。
② 在上述离心管中加入125μl 0.5M 的EDTA.Na,加入10μlRNaseA,10μl溶菌酶
③ 悬浮5分钟,放入37℃水浴锅保温30分钟
④ 加入70μl 10%SDS,5μl 10mg/ml protein K,然后反复冻融三次
⑤ 放入37℃水浴锅保温5分钟,取出后再放入55℃水浴锅保温30分钟
⑥ 加入70μl 5M Nacl,混均匀,让入冰浴中保温30分钟
⑦ 取出后在12000rpm下离心20分钟
⑧ 取上清液,加入等体积的24:1 氯仿:异戊醇
⑨ 放在12000rpm下离心10分钟
⑩ 取上清液,加入2倍体积的无水乙醇,在-20℃冰箱中放置10分钟
⑪ 取出后在12000rpm下离心10分钟
⑫ 弃上清液,在沉淀用倒入75% ETOH洗一遍
⑬ 加入20μl重蒸水,混匀,放入4℃冰箱保存。

试剂盒法:
① 把菌悬液倒入2ml的离心 管中,放在12000g(11400rpm)下离心30秒,弃上清,再重复一次,加入150μl Buffer S(含RNase),混匀
② 加入20μl溶菌酶,混匀,在室温下放置5分钟
③ 加入30μl 0.25 M EDTA(PH8.0),混匀,在冰浴中放置5分钟
④ 加入450μl Buffer G-A,剧烈振荡15秒,在65℃水浴锅中放置10分钟
⑤ 加入400μl Buffer G-B,1ml Buffer DV,剧烈振荡,在12000g(11400rpm)下离心2分钟
⑥ 弃蓝色上层液,留中层和下层(尽量把上层液吸干净)
⑦ 加入1ml Buffer DV,混匀,在12000g(11400rpm)下离心2分钟
⑧ 弃上层液,移下层液至spin-filter,放入microfuge tube 中,在12000g(11400rpm)下离心1分钟
⑨ 取滤液,加400μl Buffer BV,混匀
⑩ 混合液转入miniprep column中,静置1-2分钟,在12000g(11400rpm)下离心1分钟
⑪ 弃滤液,将miniprep column移入2ml microfuge tube中,加入500μl Buffer W1,静置,在12000g(11400rpm)下离心1分钟
⑫ 弃滤液,加入700μl Buffer W2,在12000g(11400rpm)下离心1分钟,重复一次
⑬ 弃滤液,在12000g(11400rpm)下离心1分钟
⑭ 将miniprep column移入1.2ml microfuge tube中,加入50μl重蒸水或洗脱液,室温下放置1分钟,在12000g(11400rpm)下离心1分钟,放入4℃冰箱保存。
2.3 牛乳中假单胞菌属的PCR快速检测
2.3.1 主要试剂及配置
重蒸水、dNTPs、上下游引物、TransTaq DNA Polymerase、DNA模板
TBE缓冲液:称取Tris54g,硼酸27.5g,并加入0.5mol/L EDTA(pH8.0)20ml,定容至1000ml;使用时,取20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液即可。
1%琼脂糖胶液:称取0.5g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉(或电炉)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀。
溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB【配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,置于室温下保存;使用时,稀释至0.5μg/ml。
PCR反应体系液(25μl):模板DNA 2μl,Buffer 2.5μl,dNTP 2μl,引物5μl,TransTaq 聚合酶0.5μl,H2O 13μl。分装若干PCR管。
2.3.2 主要实验仪器
加样枪(法国iGilson)
BIOER基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)
PTC-100(MJ Research Inc)
凝胶成像系统(Gene Genius Bio Imaging System,A Division of Synoptics,Ltd.)
GE-100电泳槽(Hangzhou DAHE THERMO-MAGNETICS Co.LTD)
WFH-202B紫外透射分析仪(上海精科实业有限公司)
UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)
2.3.3 PCR反应
(1)PCR的引物设计
根据参考资料文献,设计细菌通用引物,如下表所示:
表2-1 设计的引物序列
引物名称                                   引物序列
M16S-27F                      5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
M16S-1429R                    5’-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3’
 
(2) PCR的基本反应及凝胶电泳成像:
①95℃预变性4分钟,94℃变性1分钟,58℃退火30秒,72℃延伸2分钟,共进行35次的循环。反应完毕后将样品取出置于冰箱中待用。
②用移液枪小心将PCR反应后的样品加入琼脂糖胶板样品槽中,大约5μl。每加完一个样品要更换枪头,防止污染,注意上样时要小心操作,避免戳破凝胶。
③加完样后,放入电泳槽中,立即接通电源,控制电压保持在100V左右。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前约2cm,停止电泳。
④电泳完毕后,将凝胶移入0.5μg/ml EB溶液中,室温下染色20分钟左右。
⑤用凝胶成像系统观察染色后的凝胶,并拍摄凝胶电泳图像。
(3) PCR产物回收:
①把电泳结束后的凝胶放在紫外透射仪下,DNA存在的位置呈现橙黄色的荧光。把该位置的胶割下来,根据编号放到相应的Eppendorf管中。
②加入Binding Buffer,在65℃水浴中溶化。
③加入到DNA胶回收试剂盒中,敞口放置2分钟以上,在76000rpm下离心30秒,去下层液。
④加入500μl洗脱液,在76000rpm下离心30秒。
⑤重复④步,并在12000g(11400rpm)下离心30秒,移去洗脱液。
⑥将样品转移至PCR管中,加入20-30μl水,溶解DNA。
⑦在65℃水浴中放置1分钟,并在12000rpm下离心2分钟。
(4)基因组DNA测序
由上海生工生物工程有限公司进行测序。
 

3 实验结果与讨论
3.1 生理生化试验结果
根据资料,对菌种做了革兰氏染色、基红试验、VP试验、吲哚试验、葡萄糖氧化试验、淀粉水解试验等生理生化试验,生理生化结果图在如下图1-图6所示:

革兰氏染色:                        甲基红试验:
             
图1革兰氏染色显微形态观察图                  图2甲基红试验结果


VP试验:                              吲哚试验:
           
图3  VP试验结果                        图4  吲哚试验结果
葡萄糖氧化试验:                 淀粉水解试验:
            
图5 葡萄糖氧化试验结果                   图6 淀粉水解实验结果

总结以上几种生理生化试验所得的结果,如下表3-1所示:
表3-1 生理生化反应结果
生化实验                              结果
甲基红试验                            阴性              
VP试验                               阴性
吲哚试验                              阴性
葡萄糖氧化试验                        阳性
接触酶试验                            阳性
淀粉水解试验                          阳性

3.2 提取DNA实验现象
根据资料内容,利用两种不同的方法提取基因组DNA,CTAB法提取基因组DNA过程中的现象如下表3-2所示,试剂盒法提取基因组DNA过程中的现象如下表3-3所示。

表3-2 CTAB提取基因组DNA过程中的现象
步骤                      现象
        ①                    离心管底有白色沉淀
②-⑥                 开始为白色絮状沉淀,保温后为白色浑浊溶液
⑦                   分三层,从上至下分别为:上清液、杂质、有机溶剂
⑩                    静置分两层,上层为油状,下层透明;
                      离心后分三层,从上至下分别为:上清液、白色薄膜、有机溶剂

表3-3 试剂盒法提取基因组DNA过程中的现象
       步骤     现象
       ①
②-④

⑦ 离心管底油白色沉淀
白色浑浊溶液
溶液分三层,从下之下分别为:蓝色溶液,白色杂质薄膜,透明溶液
分两层,下层为白色杂质薄膜,下层为透明溶液
分两层,上层为油状,下层透明

3.3 PCR快速检测、DNA回收及测序比对结果
3.3.1 电泳结果
利用两种不同方法提取DNA的凝胶电泳图:
 
图7 DNA电泳图
备注:上图中从左到右的三条分别为:试剂盒法提取的DNA ,CTAB法提取的DNA,Mark。
PCR产物电泳结果图:
 
图8 PCR产物电泳图
3.3.2 测序比对
对测得的PCR产物序列与假单胞菌属的基本序列进行比对,得到结果如下图9所示:
ref|NZ_ACOQ01000017.1|  Pseudomonas sp. UK4 Contig17, whole geno me shotgun sequence
 gb|ACOQ01000017.1|  Pseudomonas sp. UK4 Contig17, whole genome shotgun sequence
Length=1605
Score = 1801 bits (975),  Expect = 0.0
 Identities = 1020/1039 (98%), Gaps = 14/1039 (1%)
 Strand=Plus/Plus

Query  13    ACACATGC-AGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGA  71
             |||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  69    ACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGA  128

Query  72    GTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACC  131
             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  129   GTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACC  188

Query  132   GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTA  191
             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  189   GCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTA  248

Query  192   GGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCT  251
             ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  249   GGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCT  308

Query  252   GAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA  311
             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  309   GAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA  368

Query  312   GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAG  371
             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  369   GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAG  428

Query  372   GTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGCAA  431
             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  429   GTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGCAA  488


Query  432   TTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC  491
             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  489   TTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC  548

Query  492   AGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAA  551
             |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||
Sbjct  549   AGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTAGTTAA  608

Query  552   GTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAG  611
             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  609   GTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCAAAACTGACTGACTAGAG  668

Query  612   TATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAA  671
             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  669   TATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAA  728

Query  672   CACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGG  731
             ||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  729   CACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGG  788

Query  732   AGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGG  791
             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  789   AGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGG  848

Query  792   AAGCCTTGAGCTTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGC  851
              ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  849   GAGCCTTGAGCTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGC  908


Query  852   CGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTT  911
             ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  909   CGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTT  968

Query  912   TAATTCGAAGCAACGCGA-GA-CCTTACCAG-CCTTGACATC-A-TGA-CTTTCTAGAGA  965
             |||||||||||||||||| || ||||||||| |||||||||| | ||| |||||||||||
Sbjct  969   TAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGA  1028

Query  966   TAGAT-GGTGC-TTCGG-A-CATTGAGACAG-TGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC  1020
             ||||| ||||| ||||| | ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  1029  TAGATTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTC  1088

Query  1021  GTGAGATGT-GGGT-AAGT  1037
             ||||||||| |||| ||||
Sbjct  1089  GTGAGATGTTGGGTTAAGT  1107

图9 假单胞菌属测序图

    备注:鉴于课题的要求,本实验对菌种进行了测序。从上述的图9可知,细菌基因组的DNA序列与假单胞菌属的基因序列有98%同源性。
3.4 实验结果与分析
3.4.1 生理生化试验
综合分析整个实验过程记录,得出以下结论:
菌株的生化代谢特征与相关文献中所报道的嗜冷菌假单胞菌属的生化特性一致。
VP测定加入试剂后,没有立刻有颜色变化,需要放置长时间才会出现红色反应。
吲哚实验总,若颜色不明显,可以加4-5滴乙醚至培养液,摇动,使乙醚分散于液体中,将培养液静置片刻,加入吲哚试剂。如培养液中有吲哚时,吲哚可被提取在乙醚层中,浓缩的吲哚和试剂反应,颜色会更明显。
3.4.2 DNA提取和PCR操作
DNA的提取采用了两种不同的方法,通过电泳图相比较得知,试剂盒法提取的DNA浓度较高,没有RNA残留物,比较干净。CTAB法提取的DNA浓度相比试剂盒法所提取的DNA浓度低,而且电泳条末端有白色区域,说明还有残留的RNA,但是这些残留的RNA对PCR产物的回收测序是没有影响的。
PCR的操作必须在超净工作台上进行,且要避免样品间的相互污染。本次试验的引物是原核细菌通用的引物,不是根据假单胞菌属所特定设计的一段特定引物,所以本次试验的重点就是设置不同的PCR退火温度来达到实 验结果。
理想状态下,实验要求退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,但同时还要足够高,以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。因为本次实验的引物不是特定引物,所有本次试验设置了42℃、54℃、56℃、58℃的不同的退火温度来进行试验,42℃、54℃的退火温度后,凝胶电泳图上没有任何特异性条带和非特异性条带,56℃退火温度时凝胶电泳图上出现非特异性条带,最后设置58℃退火温度后,凝胶电泳图上出现特异性条带,实验完成。
 

4 总结与展望
本文主要内容是牛乳中嗜冷菌假单胞菌属的鉴定和PCR快速检测。
快速提取假单胞菌属基因组DNA采用了CTAB法和试剂盒法。设计了一个通过引物,采用PCR反应扩增模板DNA,琼脂糖凝胶成像系统判断扩增结果,再通过测序进行比对,对牛乳中嗜冷菌假单胞菌属进行快速检测。
嗜冷菌在工业,食品加工,农业,环境保护等方面有着广泛的应用前景。低温脂肪酶及蛋白酶可作为洗涤剂添加剂,这种洗涤剂可直接加入未经加热的自来水中用来洗衣服,既经济实惠,又可保护衣物。不饱和脂肪酸对人类健康有重要的作用,人们现在一般从植物种子和鱼油摄取不饱和脂肪酸,但在资源和生产周期上受到限制。采用微生物发酵生产科弥补这一不足,而嗜冷菌细胞膜不饱和脂肪酸含量很高,是不饱和脂肪酸的一个新的来源。嗜冷菌的一个重要应用领域是环境保护,特别是通过生物降解作用在原位清除低温环境中的污染物方面显示出其独特的优势。
低温微生物在低温条件下可对污染物进行降解和转化;低温发酵可生产许多风味食品,节约能源及减少中温菌的污染;此外,从海洋低温微生物中分离的生物活性物质可用于医药、食品等。但嗜冷菌的主要应用意义在于微生物源的嗜冷酶,微生物学家已从深海和南北极的海洋环境发现的嗜冷茵群中分离到各种嗜冷酶。嗜冷酶的特殊性质使其在工业生产应用中具有一些优势:低温下催化反应可防止污染(同源的嗜温酶不活泼);经过温和的热处理即可使嗜冷酶的活力丧失,而低温或适温处理不会影响产品的品质。近年来有关低温微生物的研究日益增多,相信随着研究的持续深入以及生物工程技术的充分利用,低温微生物在生物技术及生命科学研究中的地位将会越来越重要。
 
致谢
本次毕业实验是在我的导师刘士旺老师的指导下完成的。非常感谢刘老师对我实验的精心指导和无私的帮助,能够让我在短时间内完成我的毕业试验,并且对PCR有了很深的认识。感谢刘老师解答实验过程中的所有问题,并且给我实验很大的自由发挥的空间,让我顺利完成实验。无论是刘老师的实验思路,还是教授的实验技能都对我有非常大的帮助,进一步掌握生物工程实验基本技能,在此再一次由衷感谢。
另外,感谢浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所的吴学龙老师,在DNA提取和PCR扩增反应及后续试验中给予我的指导,让我受益匪浅。
也要感谢实验室同学的热情帮助与关怀,这几个月来的一起努力一起成长,谢谢大家。
张董兰
2009年6月10日  于杭州
 
参考文献
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