菌物化学成分研究论文

撰文｜程莉

责编｜李晓明

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每千克身价高达几十万，冬虫夏草到底是食品？药品？还是保健品？“身份”扑朔迷离，命运数度“反转”，背后闪现各方利益角逐，但并没有妨碍它成为中草药里炙手可热的“明星”。

近段时间，冬虫夏草包括其产品中的价格之“王”——极草，被国家食品药品监督管理总局(以下简称“国家食药总局”)公开批评，利益相关各方争辩你来我回，舆论一度甚嚣尘上。

自始至终，被捧上天的冬虫夏草是否含有有效成分饱受专业人士诟病。综其一生，不过是一个“中国式”罢了。

1.籍籍无名

中国传统的中医药学和我国绝大多数学者所指的冬虫夏草, 是特指麦角菌科冬虫夏草菌的子座及其寄主蝙蝠蛾科昆虫冬虫夏草蝙蝠蛾幼虫尸体的复合体，主产于四川、青海、西藏、云南等海拔4000～5000米的高山草甸中。其他500多种虫草属真菌寄生并能产生子座的菌物结合体都只能称作虫草。

研究表明，蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢同时存在于天然冬虫夏草中。2005年10月，中国菌物学会确认冬虫夏草的学名是Cordyceps sinensi (Berk.) sacc.，中国被毛孢（Hirsutella sinensis）为冬虫夏草的唯一无性型菌种，异名有蝙蝠蛾多（被）毛孢、中华束丝孢。

我国关于冬虫夏草的记载最早见于清代吴仪洛1757年著就的《本草从新》：“冬在土中，身活如老蚕，有毛能动，至夏则毛出土上，连身俱化为草，若不取，至冬则复化为虫。”此后，多种中医书籍都记载了冬虫夏草。《中华人民共和国药典》1990年版收录了冬虫夏草。不过，解放军总医院心内科主任医师吴海云对此并不为意，他在接受媒体采访时表示采访时说，在中医古籍中，几乎所有东西都是药，诸如指甲、灶灰、粪便都是药，都能在古籍中找到“功效”。

而在传统的藏医学中，虫草产地玉树州治多县的藏药师青梅然丁此前接受新华网采访时称：“虫草往往只发挥药引的作用。”在青海省藏医院数百种复方药物中，只有一种用于治疗妇科疾病的制剂用到了冬虫夏草。藏医药典《甘露本草明镜》中关于虫草的功效也只有一句话：“强身，补肾，用于治疗肝胆系统疾病。”北京中医药大学中药生药系主任张贵君也表示，传统中药配方中虫草用得很少。

虫草酸被认为是冬虫夏草的功效成分或标志性成分，但其实虫草酸就是甘露醇——一种非常普通而便宜的化工产品，被广泛用于食品、药物当中，一千克几十元而已。

1951年,德国科学家Cuningham等观察到被蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂,随后从中分离到一种腺苷类活性物质, 确定其结构式为3’-脱氧腺苷，命名为虫草菌素, 又称虫草素，1960年已经实现了全化学合成。不过化学合成不能规模化生产，所以目前市场上的虫草素主要是通过人工培养蛹虫草（Cordyceps militaris）获得。虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素，也是商家所吹捧的冬虫夏草的另一种活性成分。

但实际上，多项研究表明冬虫夏草中并不含虫草素。中科院微生物所真菌学国家重点实验室研究员董彩虹在接受媒体采访时表示，他们实验室采集了青藏高原不同产地的冬虫夏草，对其标本和液体发酵的菌粉进行检测后发现：“冬虫夏草里虫草素的含量超出了我们的检测范围，我们检测不到它，可以说冬虫夏草里基本不含虫草素。” 而据澎湃新闻报道：早在2011年，中科院上海生科院植物生理生态研究所研究员王成树就发表了关于蛹虫草基因组的研究成果。2013年，其课题组又发表了关于冬虫夏草菌基因组的研究论文。这些研究表明：冬虫夏草菌的基因组并没有合成虫草素的基因，所以是不能合成虫草素的，而蛹虫草菌是可以合成虫草素的。

在20世纪70年代乃至之前，冬虫夏草还非常低调，与传统滋补品人参和鹿茸相比，仅被当作“中药三宝”里最寻常的一种药材。60年代，在西藏1千克冬虫夏草可换两包单价3角钱的香烟;70年代，在青海、西藏，冬虫夏草的国家收购价为每千克21元。1974年，在青海省果洛州，不管什么品相的冬虫夏草的价格都是28元/千克左右。

2.身价暴涨

在野外，幼虫被侵染又长成冬虫夏草的几率很低，因此天然冬虫夏草资源很稀缺，人工培植也还没有获得成功，每年全国总产量仅80～150吨。随着需求增长，冬虫夏草的价格出现了一定程度的上升。1983年，上等冬虫夏草的价格涨到了300元/千克，而同一时期长白山区的人参每千克在60～80元左右，这个价钱相当于当时一个工人一个多月的工资。1990年左右，冬虫夏草价格涨至平均1000元/千克。相反，人参价格降至50元/千克。

冬虫夏草在公众眼中第一次公开高调露面伴随着另一个——马家军。1993年4月，马家军在天津集体刷新女子马拉松全国纪录；8月在斯图加特世锦赛包揽女子1500米、3000米、10000米全部3枚金牌；9月在七运会上狂破世界纪录；10月在西班牙夺世界杯马拉松赛女子个人和团体冠军。震惊世界的同时，马家军也一度被国际质疑服用兴奋剂，马家军拿补品、中草药作挡箭牌。除了大家记忆中非常熟悉的“中华鳖精”，还有冬虫夏草。因此，到了上世纪90年代中期，虫草零售价涨到了2000元／千克，上等冬虫夏草价格则更高。最后作家赵瑜的报告文学《马家军调查》证实马家军确实是服用了兴奋剂，队员成绩和“中草药”无关。

2003年非典时期，传言吃冬虫夏草能增强免疫力，甚至能包治百病，虫草一夜之间变成“神草”，引发市场狂炒，其价格一路暴涨，上等冬虫夏草价格从几千元／千克猛涨到万元／千克。从此，虫草正式步入“奢侈保健品”行列，计价单位也从“千克”变为“克”。

之后的2005年和2006年，冬虫夏草价格持续走高，在2007年时价格更是攀上了历史性巅峰，其中每千克2000条规格的冬虫夏草每千克高达20万元。

2008年，由于金融危机影响，虫草的销量严重受挫，当年均价下降了40%左右。到了2010年和2011年，受生态破坏和地震等自然灾害的影响，不少冬虫夏草产区出现减产，有的地区减产幅度甚至高达40%，供应萎缩使冬虫夏草行情再次上涨，价格重新一路飞涨。2011年7月，虫草价格超过2007年的历史最高点，“西藏商城”显示，2200条规格的冬虫夏草批发价万元/千克，而1800条规格的则达到21万元/千克。此后，冬虫夏草价格一直稳中有升。

而据《南方日报》称，业内人士透露除了产量不高，炒家囤货也是虫草涨价的一大原因。从虫草产区到消费城市，多级经销商层层囤货、层层加价。一些买家常年驻扎在青海西宁，在合适的时机出手购入囤货。

经历了多事的2015年和2016年，冬虫夏草的价格持续走低。从中国中药协会中药材信息中心官方网站中药材天地网上可以看到，2000条／千克规格的冬虫夏草，青海产地价格从2015年4月的万元／千克，降至最近价格万元／千克，西藏市场价格则由21万元／千克降至16万元／千克。尽管如此，四十年来，冬虫夏草价格飞涨了近万倍。而冬虫夏草中的“极品” ——极草5X冬虫夏草价格则更为惊人，在其官网上一瓶极草5X冬虫夏草纯粉片—双层片，售价达16900元。极草号称100%冬虫夏草，按照一瓶45片、每片克规格，可折算其价格每千克超过100万元。

3.食品？药品？还是保健品？

尽管冬虫夏草的身价一路飞涨，但它是食品？药品？还是保健品？其身份扑朔迷离。

虽然《中华人民共和国药典》收录了冬虫夏草，但张贵君表示：“收录了只能说它是中药材，但药材和药品还不是一回事。药材，农民可以随便买卖，但药材不能讲功效，只有药品才能讲功效，而药品对应什么疾病，要有实验药理学验证，对人体的作用应该通过临床实验来验证。” 事实上，对于冬虫夏草的功效，一直没有较高级别的论文证据支撑，这是业内共识。

其实早在2001年，当时的卫生部就已明令限制冬虫夏草这类国家二级保护物种作为保健食品原料，保健食品中的冬虫夏草应以冬虫夏草菌丝体蝙蝠蛾拟青霉替换。2005年，接手保健品监管的国家食药总局进一步明确，保健食品的原料使用了冬虫夏草的，应以人工繁殖的菌丝体予以替换。

2008年，极草以食品类产品许可证上市，当时产品外包装上显示为“青卫食证字(2008)第630000-400025号”。但是2009年8月6日，卫生部发文《蜂胶、冬虫夏草等不得挂“食”字号》明确指出：“卫生部未曾批准过冬虫夏草作为普通食品原料使用。国家中医药管理局组织专家讨论后也认为，目前冬虫夏草尚缺少作为食品长期服用的安全性评价研究数据，建议暂不作为食品原料使用。”

2010年12月国家质检总局也发布《关于冬虫夏草不得作为普通食品原料的通知》，严禁使用冬虫夏草作为食品原料生产普通食品。

于是，青海省卫生监督所在2011年4月发布公告，撤销了“极草”的食品批号，同时规定不得在产品包装上标注卫生许可证。

然而，青海省食药监局2010年12月7日出台了《青海省冬虫夏草中药饮片炮制规范》，将“极草”定义为冬虫夏草中药饮片。2012年6月份，国家食药监总局下发《关于冬虫夏草中药饮片炮制规范有关问题的通知》，指出冬虫夏草粉碎及压制成片不属于中药饮片炮制范畴，明确要求青海省对“规范”予以修正，妥善处理，切实加强对中药饮片的监督管理。

直到2012年8月15日，国家食药总局印发了《冬虫夏草用于保健食品试点工作方案》，第一次允许冬虫夏草直接被用为保健食品的原料，试点时限为批准试点企业相关产品之日起5年。同仁堂、康美药业、青海春天、劲牌有限公司、江中药业五家企业进入了保健品试点企业名单，这终于让冬虫夏草保健品拥有了“临时身份”。

2014年7月，冬虫夏草的热点产品“极草”又一次发生了转变。当时青海省食品药品监督管理局下发了《关于冬虫夏草纯粉片相关事宜的通知》和《关于撤销青海省冬虫夏草中药饮片炮制规范的公告》，明确规定：青海春天生产的冬虫夏草纯粉片的新身份为青海省出产的冬虫夏草经加工制成的产品，为青海省综合开发利用优势资源的试点产品。基于青海春天研发的冬虫夏草纯粉片的创新属性，不归属于既有监管体系中的药品，也不归属于既有监管体系中的食品或保健食品，其产品作为滋补类特殊产品进行管理。这样，极草获得了一个仅包括它一家的“滋补类特殊产品”身份。而根据青海省监管部门的规定，其生产依旧可以获得《药品生产许可证》。

4.陷入纷争

2016年2月4日，国家食药总局在其官网发布了《关于冬虫夏草类产品的消费提示》（以下简称《消费提示》），该提示称：近期，食品药品监管总局组织开展了对冬虫夏草、冬虫夏草粉及纯粉片产品的监测检验。检验的冬虫夏草、冬虫夏草粉及纯粉片产品中，砷含量为～毫克/千克。冬虫夏草属中药材，不属于药食两用物质。有关专家分析研判，保健食品国家安全标准中砷限量值为毫克/千克，长期食用冬虫夏草、冬虫夏草粉及纯粉片等产品会造成砷过量摄入，存在较高风险。

2月6日，青海春天发布公告回应称，控股子公司春天药用生产销售的虫草纯粉片为“唯一具备合法生产、销售身份”的此类产品。公司各项试验结果均显示，以净制冬虫夏草为原料的冬虫夏草纯粉片安全无毒。

不久之后的3月4日，国家食药总局在其官网发布了《关于停止冬虫夏草用于保健食品试点工作的通知》，停止冬虫夏草用于保健食品试点工作，此时距离该期限结束还差2年时间。

迫于各方压力，青海春天向国家食药总局申请信息公开，要求公开《消费提示》所依据的检测文件。于是，3月28日，青海春天收到了国家食药总局的回函《政府信息公开告知书》，从该告知书中可知，早在2015年7月11日，国家食药总局便告知青海省人民政府停止冬虫夏草纯粉片作为综合开发利用优势资源的产品试点以及冬虫夏草用于保健食品试点工作。但青海春天否认瞒而不报，表示在2016年3月28日收到告知书才看到该文。

2016年4月1日，青海省食药监局向青海春天子公司春天药用发出《关于青海春天药用资源科技利用有限公司换发〈药品生产许可证〉的批复》。但相关人士认为，青海春天获得《药品生产许可证》只能说明它有研发药品的能力和资格了，并不代表“极草”含片现在就有了药品身份，因为青海春天的冬虫夏草纯粉片产品目前还未获得药品批准文号。

目前，青海春天控股子公司春天药用资源科技利用有限公司已被要求停止冬虫夏草纯粉片产品试点以及相关产品生产经营。公司股票停牌中。

4月5日晚间青海春天连发两则公告，一方面搬出关联公司三普药业有限公司进行救场，春天药用将获得其冬虫夏草为原料的药品全国总经销权授权；另一方面，将向国家食药总局沟通再度申请其公开发布《关于冬虫夏草类产品的消费提示》所依据的法律法规等。

在国家食药总局网站数据库中含有冬虫夏草成分的国产保健食品共有19条记录，包括同仁堂的总统牌冬虫夏草灵芝提取物西洋参提取物三七提取物口服液、劲牌生物医药有限公司的两款冬虫夏草胶囊。而且所有产品宣称的保健功能都是调节或增强免疫力，个别产品还包括抑制肿瘤或辅助抑制肿瘤。国家保健食品评审专家金宗濂教授指出，我国现有一万多种保健食品，60%都是增强免疫功能的，“增强免疫功能”是保健食品申请进入市场时最容易通过的。

然而，对于宣称的“调节免疫功能”，吴海云认为这是一种含糊而讨巧的说法：“到底是增强还是降低免疫功能?还是增加某一项功能呢?免疫功能非常复杂，比如艾滋病会引起免疫功能低下，但有些疾病却是免疫过度亢进了。很多保健品都使用调节免疫的说法，这是卫生管理部门遗留的后患。听起来能增加抵抗力，但又没有临床依据，就叫调节免疫功能。”

而在药品数据库中，药品生产企业包括青海珠峰冬虫夏草原料有限公司、青海国草冬虫夏草资源开发有限公司、青海珠峰冬虫夏草药业有限公司、桓仁满族自治县恒宝参药有限公司、华东医药股份有限公司、杭州中美华东制药有限公司6家。国产药品仅有三种：青海珠峰冬虫夏草原料有限公司生产的发酵冬虫夏草菌粉、百令片和杭州中美华东制药有限公司生产的发酵冬虫夏草菌粉。不过，发酵虫草菌粉并非野生冬虫夏草，而是人工分离出冬虫夏草菌种后在人工环境下培养的，1988年获国家卫生部正式生产批件并获名“发酵虫草菌粉”。而且这三种药品都是作为中药审批的，而中药获批门槛较低。

食品生产许可获证企业(QS)包括两家，一家是青海久泰冬虫夏草酒业有限公司，其官网宣称“久泰所产产品均为保健品酒类，有虫草酒和浆果酒两种类型。而利用发酵冬虫夏草菌粉发酵液，继续发酵生成酒精，制成的虫草酒，其保留发酵冬虫夏草菌粉的多种多糖及营养物质，既有酒的香醇，又有冬虫夏草的功效。” 按照国家法规，食品不能声称功效，该企业产品的功效宣称只能是一句空话。

另一家是扬州凯尔生物科技有限公司，不过使用的是北冬虫夏草，也就是蛹虫草，与冬虫夏草不是一个东西。蛹虫草可以人工培育，能作为食品原料，价格很低。

此外，被当作中药材售卖的冬虫夏草不在食品、保健食品、药品管辖范围内，而我国中药材中标准中并没有砷含量的限量指标。

而被视为“极品”的极草则在食品、保健食品、药品数据库中，都没有找到。

冬虫夏草是青海省的重要支柱产业，据估计，青海省的冬虫夏草年交易额超过200亿元，而全国虫草产业的产值超过300亿元。冬虫夏草的去向，牵扯多方利益。但《冬虫夏草化学成分及其药理活性研究》一文中表明目前冬虫夏草的成分已基本清楚：野生冬虫夏草中含水分，粗蛋白～33%, 粗脂肪, 总糖～, 粗纤维, 水分, 灰分。此外还含有氨基酸、脂肪酸、核苷类物质、甾醇、7%～9％的甘露醇、多糖等, 这些成分是冬虫夏草发挥可能的生理活性或药效的主要物质基础。董彩虹表示，这些物质并不是冬虫夏草特有的，目前也并没有发现冬虫夏草中含有特有的活性成分。

参考文献：

1、朱佳石，郭英兰，姚艺桑，等.冬虫夏草成熟过程中中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉DNA共存及竞争增殖力、化学成分变化[J].菌物研究,2007

2、刘高强, 王晓玲, 杨青, 等.冬虫夏草化学成分及其药理活性研究[J].营养研究, 2007,(1):202-206.

3、杨涛，董彩虹.虫草素的研究进展[J] 菌物学报, 2011, 30(2): 180-190

4、中华人民共和国卫生部新药审批品种(1988年3月)

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植物保护专业本科毕业论文（设计）开题报告

紧张又充实的大学生活即将结束，大学生们马上就要开始最难熬的毕业设计阶段，而我们做毕业设计之前要先写好开题报告，快来参考开题报告是怎么写的吧！以下是我整理的植物保护专业本科毕业论文（设计）开题报告，欢迎大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。

毕业论文题目：

菌寄生真菌纤细齿梗孢蛋白酶基因的克隆与表达

姓名： xx 学号： xxxx

年级： xxx 专业： 植物保护

指导教师：姓名 xxx 职称 教授

学科 植物病理

山东农业大学教务处

20XX年x月x日

一、选题依据（拟开展研究项目的研究目的、意义）

菌寄生(Mycoparasitism)是发生在菌寄生真菌与寄主真菌之间的一种寄生方式，是自然界普遍存在的一种真菌与真菌之间的相互作用。一直以来，生物间相互作用及信号传导的分子机制，是当今生命科学研究的热门。利用菌寄生真菌与寄主真菌作为研究的模式系统来揭示生物相互之间的相互作用机制有重要理论和实践意义。李多川(Li,1996)先生发现纤细齿梗孢(Olpitrichum tenellum)和串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)的菌寄生关系以来，我们实验室试图通过研究纤细齿梗孢和串珠镰刀菌，来建立菌寄生真菌与寄主真菌相互作用机制研究的模式系统，从而揭示菌寄生真菌与寄主真菌之间相互作用的分子机制。纤细齿梗孢(Olpitrichum tenellum)是串珠镰刀菌的一种重寄生真菌，该菌是一种接触性活体重寄生菌，离体试验发现其分生孢子只有在串珠镰刀菌细胞壁提取物刺激下才能萌发。这说明两者之间的重寄生关系是建立在二者识别与互作的分子机制上的(Li,2004)。在纤细齿梗孢和串珠镰刀菌相互作用过程中，几丁质酶、蛋白酶等细胞壁裂解酶可能起到重要作用。其中，蛋白酶在木霉属菌寄生真菌中的功能已经得到初步证明，而纤细齿梗孢的蛋白酶的研究还未见报道。因此，克隆纤细齿梗孢蛋白酶编码基因对于从分子水平上研究重寄生真菌和寄主识别和互作机制有着重要的意义。

二、文献综述内容(在充分收集研究主题相关资料的基础上，分析国内外研究现状，提出问题，找到研究主题的切入点，附主要参考文献)

纤细齿梗孢(Olpitrichum tenellum)是李多川教授分离得到的一种活体营养接触型菌寄生真菌[1~3]，其寄主包括Fusarium moniliformeAlternaria alternata等。近年来，我们实验室一直在努力以其为基础研究菌寄生真菌与寄主真菌之间的相互作用的分子机制。经过多年的研究，人们渐渐认识到真菌细胞壁蛋白在细胞与外界的相互作用过程中扮演着重要的角色。细胞壁蛋白研究已经成为生物间相互识别机制研究的热点。鉴于以上原因，我们实验室成功分离纯化了纤细齿梗孢的寄主之一Alternaria alternata菌丝细胞壁上的一种特异性糖蛋白——凝集素，并初步证明其在和孢子吸附过程中起到识别因子的作用[4]。近年来，菌寄生真菌细胞壁裂解蛋白酶在菌寄生过程中的作用被人们逐渐重视起来。克隆和表达菌寄生真菌的蛋白酶编码基因变得很有意义。本研究试图以菌寄生真菌纤细齿梗孢(Olpitrichumtenellum)作为研究材料克隆了其蛋白酶基因。根据氨基酸的保守序列设计兼并引物，然后采用RT-PCR和RACE是一个较为快速、简单和高效的方法。本实验根据同源保守序列设计兼并引物，通过RT-PCR及RACE-PCR的方法，克隆了蛋白酶的编码基因的全长cDNA序列，并对该基因进行了序列分析，为后续试验打下了基础。

由于Olpitrichum tenellum在离开寄主的人工培养基中很难生长，纯化其蛋白酶变得非常困难。因此，我们需要使用外源蛋白表达系统得到蛋白，进一步研究其性质，从而搞清楚其在重寄生过程中的作用。在过去的几十年间，随着DNA重组技术的不断发展，通过构建遗传工程菌株，人们可以较容易地使各种各样的天然酶的基因在微生物系统中高效表达，从而在很大程度上摆脱对天然酶源的依赖。

基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统是目前了解最深入，实际应用最为广泛的表达系统。与其他表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强等特点。在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具[5]。

Pichia pastoris基因表达系统经过十几年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因在宿主基因组中稳定整合，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因[6]，证实该系统是高效、实用、简便，能提高表达量并保持产物生物学活性的外源基因表达系统。表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品[7]。

我们已经分离到蛋白酶的编码基因，本研究中将该基因的去掉信号肽序列的正确阅读框融合于原核表达载体pET-22b(+)和毕赤酵母表达载体pPIC9K上，分别转化 BL21及Pichia pastoris GSxx5，以期在这些菌株中有效表达该基因的编码产物，从而为以后功能研究打下基础。

1 李多川.1998.菌寄生真菌分子生物学研究进展.吉林农业大学学报,20：37~65.

2 21.李多川.1998.菌寄生真菌分子生物学研究进展.微生物学通报，25：345~347.

3 .李多川，沈崇尧.1997.菌寄生菌物与寄主菌物相互作用的研究进展.西北农业学报，6：94~98.

4 张成省，李多川，孔凡玉. alternata菌丝细胞壁凝集素的纯化与特性研究.植物病理学报，35(2)：141~147.

5 .xx.何诚，朱运松.1998.甲醇营养型酵母表达系统的研究进展.生物工程进展,18：7~xx.

6 彭毅，杨希才，康良仪.2000.影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素.生物技术通报，4：33~36.

7 韩雪清，刘湘涛，尹双.2003.毕赤酵母表达系统.微生物学杂志，3：35~40.

三、研究方案(主要研究内容、目标，研究方法、进度)：

1、研究内容：

本课题选择纤细齿梗孢(Olpitrichum tenellum)做为研究对象，通过RT-PCR及RACE技术分离克隆了其丝氨酸蛋白酶基因，并进行原核及真核表达，并对其的性质进行了研究，为进一步的研究工作打下基础。

2、研究的目标：

克隆了纤细齿梗孢(Olpitrichum tenellum)的丝氨酸蛋白酶基因，进行原核及真核表达，并对其的性质进行了研究。

3、研究方法：

将纤细齿梗孢(Olpitrichum tenellum)接种到LB培养基上，培养14个小时后，收集菌丝，然后采用总Trizol法提取RNA。再从GenBank数据库中搜索到大量的蛋白酶氨基酸序列，并根据同源性进行分类，分别设计兼并引物。再通过RT-PCR、3’-RACE、5’-RACE获得全长cDNA、DNA克隆，并将其连接到载体上，然后采用电击法将将重组质粒转入到全长cDNA、DNA克隆中，通过透析纯化蛋白酶，最后研究其特性。

四、研究进度：

20xx年5月23日~20xx年5月29日 整理收集资料，并跟着研究生学习基本实验技术。

20xx年5月30日~20xx年6月18日 提取RNA，设计引物、全长cDNA、DNA克隆 。

20xx年6月19日~20xx年7月15日 转化大肠杆菌、毕赤酵母表达，获得纯纯产物，并研究其特性。

20xx年3月~20xx年6月 对实验结果不理想的实验重做，整理实验数据，完成毕业论文，并准备毕业答辩。

五、技术路线：

收集菌丝

总RNA提取

同源序列 设计引物

特性研究

RT-PCR、

3’-RACE、5’-RACE

纯化表达产物

全长cDNA、DNA克隆 转化大肠杆菌、毕赤酵母

四、进程计划(各研究环节的时间安排、实施进度、完成程度)

20xx年5月23日~20xx年5月29日 整理收集资料，并跟着研究生学习基本实验技术。完成实验的1%。

20xx年5月30日~20xx年6月18日 提取RNA，设计引物、全长cDNA、DNA克隆。完成实验的50%。

20xx年6月19日~20xx年7月15日 转化大肠杆菌、毕赤酵母表达，获得纯纯产物，并研究其特性。完成实验的95%。

20xx年3月~20xx年6月 对实验结果不理想的实验重做，整理实验数据，完成毕业论文，并准备毕业答辩。完成100%。

五、导师对文献综述的评语

签字：

20xx年xx月xx日

六、专业意见

专业主任签字：

20xx 年 月 日

七、学院意见

学院(章)： 负责人签字：

20xx年xx月xx日

摘要：

针对目前浙江农林大学植物保护研究法实验教学方法、内容及手段等方面存在的一系列问题，提出了相关改革对策：优化实验课程内容，整合实验模块，学生自行设计实验方案等教学方法和手段的改革，以及课程考核方式和时间安排的调整，旨在培养学生的科研兴趣及创新能力。

关键词：

植物保护论文

目前，国内外很多农业院校的植物保护专业均开设了昆虫研究法和植病研究法课程。为优化本科培养方案，浙江农林大学通过调整教学大纲，将植病研究法、昆虫研究法和农药研究法合并成一门植物保护研究法课程。植物保护研究法是植物保护专业重要的专业限选课程之一，是植物保护研究的重要组成部分，也是培养和提高学生专业实验技能和学习兴趣的重要课程，是一门专业性、实践性很强的实验学科。通过这门课程的教学，能使学生掌握植物保护研究的基本方法及基本原理，培养植物保护研究常规操作能力，以及查阅资料、设计实验方案和实际操作能力，提高学生的逻辑思维、整理资料、总结归纳和论文撰写的能力。笔者分析了浙江农林大学植物保护研究法实验教学中存在的问题，提出教学改革内容，并总结了改革成效。

1.实验教学存在的问题

传统实验教学的弊端传统实验教学的主要特征是“灌输式”“填鸭式”，学生在2个小时的实验过程中就是简单地按照实验指导书和实验大纲中的实验方法和步骤依葫芦画瓢，实验完成后，又按照统一的模式填写实验报告。在整个实验过程中，学生无需独立思考和分析，更谈不上发挥创新能力了。因此，很难让学生对实验产生兴趣，培养学生的创造性思维就更无从谈起了。虽然这种传统实验模式简明、清晰，有利于学生对相关结论的认可、理解和记忆，也有利于教师对整个教学过程的控制，教师和学生很轻松愉快地就能完成实验教学任务。学生走上工作岗位后，传统实验教学的弊端立即显现。学生缺乏设计实验的能力，在实验过程中缺乏发现问题、分析问题和解决问题的能力，实验后缺乏正确分析实验结果的能力。因此，传统的实验教学模式急需改革。

实验教学内容系统性不强植物保护研究法是植物保护专业本科学生的一门专业课程，其涉及的内容有昆虫研究法、植病研究法和农药研究法。在以往的实验课程中，只是简单地把这3门课的实验合在一起上，并没有把内容紧密联系在一起，如昆虫实验时，指导教师一般是教授昆虫学科的教师;而在进行植病实验时，则由讲授植病学科的教师指导。这样的实验模式难以使植物病虫害系统联系起来，学生学习专业知识不够系统和深入，容易造成理解上的片面性和孤立性，不利于掌握该专业的系统知识和技能。

实验考核不科学以往实验课程成绩评定的主要依据是实验报告，而每次实验课结束后，学生递交的实验报告只是把实验大纲(包括实验口的、原理、仪器与试剂、内容及方法)原文不动地抄一遍，实验结果更是千篇一律，这样实验就变成了预演过程，学生在实验中缺乏思考，不利于培养发现问题、提出问题、分析问题和解决问题的能力，背离了实验课教学的初衷。同时，还会导致每位学生的实验成绩差异微乎其微，不具有良好的区分度。

2.教学改革内容

重视教学环节在以往的实验课程中，实验教学所需要的实验用具和材料大多数都是实验教辅人员提前准备，导致他们的工作量非常大。让学生参与实验材料的准备和管理，一方面提高了教辅人员的工作效率;另一方面可以让学生对实验过程有全面了解，获得整个科研实践过程的训练，从而养成好的实验习惯，在未来的科研工作中做到计划周密、有条不紊地安排和实施实验计划。同时，在实验教学过程中，必须教育学生认真操作、仔细观察、实事求是地记录实验结果，并对实验进行科学分析。一日_发现弄虚作假的学生，一定要严厉批评，同时帮助他们分析失败的原因，找出解决的方法，有条件的情况下，让其重新做实验，让学生充分意识到科学研究允许失败，但是不能有半l从虚假。提高学生的实践能力实践教学是培养和训练学生实践操作能力，独立分析问题、解决问题能力的重要手段，尤其对于学生创新能力的培养，具有其独特的地位和作用。该项口分别以某种农作物病虫害为主轴展开一系列的实践性实验教学，要求学生自主设计实验和执行各项实验内容，指导教师负责答疑和提供技术帮助。学生通过自己分组、调查、取样、鉴定、查阅资料、讨论制订实验方案和动手实验等一系列步骤，不仅可以很好地将课堂上所学的理论知识与实践相结合，而且还有助于提高自学能力、实践能力和团队协作能力，进一步培养科学思维和创新能力。优化实验教学内容结构将整个实验课程设置成一个综合性的大实验：分别以某个农作物上的病虫害发生规律及防治措施贯穿整个课程。将口前昆虫研究法的昆虫标本的采集与制作、昆虫人工饲养技术、昆虫生态学研究方法、昆虫生理生化研究方法、昆虫分子生物学研究方法和害虫综合治理研究方法5个实验和植病研究法的植物病害调查、植物病原菌分离与鉴定技术、植物病原菌分子生物学鉴定技术、植物病原真菌遗传转化技术和植物病害综合治理技术5个实验合并成1个综合性大实验，将植物病虫害研究以故事的形式紧密地整合在一起，让学生将课堂知识与田间实际应用有机地联系在一起，加深对理论知识的理解，提高学习兴趣。整个实验就是以具体的作物病虫害发生为时间轴，具有很强的连贯性和系统性，学生只有认真完成每一个实验，才能很好地保证后续实验的顺利进行，有助于增强学生的责任感和团队合作精神，同时也改变了学生实验报告千篇一律的`现象。改革成绩评定方式实验课成绩一方面是对学生实验完成好坏的肯定，另一方面也对学生起到了一定的督促作用。为了做到对学生的全面评价，实验成绩除实验报告和考勤成绩外，应将实验过程中学生的学习主动性、动手操作能力、实验结果记录规范性量化纳入成绩考核。在实验过程中，教师应主动观察并记录每个学生的实际动手、操作能力，量化后按一定比例记入总成绩，对那些既有独立操作能力，又有创新意识的学生，适当给予创新学分。实验过程中，学生是否遵守实验室规则、是否具有团队合作精神，实验结束后，学生是否打扫卫生、是否清洗实验器材等，这些看似小问题，但也体现着一个人的品质和素养，做得好的学生也可以适当加分。

3.改革成效

提高学生的专业技能及其对专业知识重要性的认识学生能在同一时间完成植病研究法、昆虫研究法和农药研究法3门实验课程，体现了实验课程很强的连贯性和系统性。学生在实践过程中将这3门课程的相关内容紧密、有机地联系起来，对植物病虫害防治有了更深入的认识，同时也提高了学生的专业技能及其对专业知识重要性的认识。在实验的过程中，强调把学生的动手能力放在首位，让学生更多地参与到实验中，切身体会到所学专业的意义。

培养学生发现、提出、分析和解决问题的能力植物保护研究法实验教学模式具有系统化和整体化特点，同时涉及昆虫研究法、植病研究法、农药研究法等相关学科课程。在实验过程中，学生在对病虫害的认知及其防治等问题的处理上始终处于主体地位，在独立思考、查找资料、咨询专业教师、综合分析之后，拟定出具体的处理方案，能够融会贯通地掌握植物保护学科的理论知识和基本实践技能。

提高指导教师的业务水平新的实验教学模式综合运用了3门相关课程的理论知识，加强了课程的综合实践环节，因此指导教师自身的知识面、操作技术、实践应用和协调能力都需要提升。所以，这种实验教学模式促使教师在教学过程中同学生一起不断学习，丰富专业理论知识，完善专业实践体系，提高发现、提出、分析和解决问题的能力，了解和掌握学科及相关学科的发展动态、研究的新进展、出现的新技术，从而提高了指导教师的业务水平。

4.结语

植物保护研究法在植物保护专业2013级和2014级本科生实验课程教学中进行了实践，通过问卷调查，95%的学生认为在实验过程中有较多的动手机会，激发了自己对实验的兴趣，提高了自己分析和解决问题的能力。因此，认为该教学方法可以发挥学生的主观能动性、拓展学生的科研思路、激发学生的创新创造力和提高学生的独立应用实践能力，具有良好的教学效果。

导读： 2011年3月11日日本东北地区级地震发生后，受海啸影响，福岛第一电厂发生核泄漏，引发社会大众对核辐射的恐惧，也让许多人着实慌乱了一阵，抢购含碘盐、碘片，买辐射防护服等，无奇不有。之后，为了消除慌乱与恐惧，新闻媒体大量刊载有关核辐射的常识，以及预防核辐射的方法，其中不乏有关中药和保健食品。由此，我回顾了灵芝抗辐射作用的研究。 最早的灵芝抗辐射研究 20世纪70年代后期，为了观察灵芝子实体提取物增强小鼠抵抗恶劣环境（条件）的影响，我们设计了一系列实验，如抗缺氧、抗寒冷、抗高温、 抗疲劳、抗辐射等。 当时，我们还没有钴-60的辐射设备，所以每次都要用学校的小轿车护送几十只实验用的小鼠，去中国农业科学院的辐照实验室进行照 射，在那个全民骑自行车的年代，也算是很奢侈的了。 实验时，把每只小鼠固定在特制的玻璃圆筒中，等距离环绕在钴-60源周围，接受钴-60γ射线全身照射15分钟，钴-60射线剂量率为（约 ），总照射剂量为906R（约）。 照射后将小鼠运回实验室饲养，观察30天的死亡率。 结果发现，事先给小鼠灌胃灵芝提取液（相当于子实体10g/kg）20天，小鼠照射后30天的死亡率为，而灌胃生理食盐水的对照组小鼠则为。在钴-60γ射线照射后，给小鼠注射同样剂量的灵芝液治疗，两组照射后30天死亡率无明显差异，但可使动物的平均存活时间明显延长。此一发现于1980年以中、英文发表于《科学通报》上，是第一篇灵芝抗辐射的研究论文，受到学术界的关注。 科学是经得起重复的 科学的实验结果是应该能经得起重复的。时隔十余年后，一些实验室的研究也获得相似的结果： （1）灵芝提取物对小鼠X线照射所致损伤具有一定的保护作用，可轻度增加照射30天的存活率，促进照射后小鼠体重和血液指标的恢复。 （2）灵芝提取物预防性给药，对4Gy γ射线照射小鼠所致损伤有明显的保护作用，能明显改善因照射引起的白细胞减少和免疫功能降低。 （3）给小鼠灌胃灵芝孢子粉，能减轻钴-60 γ射线引起的白细胞减少，并 提高小鼠的存活率。 （4）在X射线照射前，给小鼠喂食灵芝菌丝体水提取物（MAK），对小鼠X射线照射损伤具有保护作用，可显著延长小鼠存活时间，并增加小肠腺细胞的存活率。 这些研究都证明灵芝子实体、菌丝体和孢子粉具有抗辐射损伤作用。 临床有效才是最科学的 灵芝的抗辐射作用目前已用到临床，其一是减轻肿瘤放射治疗的损伤， 如白细胞减少、胃肠道反应（如呕吐）、免疫功能降低等，这些内容我在专栏中已多次提及。 其二是治疗白细胞减少症。 白细胞减少症是指外周血液里的白细胞低于* 10 ^9/L，其原因尚未完全清楚，可能与环境中物理化学污染的影响、身体的遗传或免疫机制障碍等有关，前者中就包括各种辐射因素的影响。 从临床白细胞正常值标准的变化，也可以看出人类生存环境的恶化。1960年我在临床实习时，白细胞总数的正常值下限是 10 ^9/L，随时间推移，此值降至 10 ^9/L，再降至今天的 10 ^9/L，可说是每况愈下。 一些初步的临床观察显示，灵芝对各种原因引起的白细胞减少症有效。 例如：使用灵芝胶囊（含灵芝菌丝及其固体培养基的乙醇提取物）治疗白细胞威少症52例，治疗前白细胞总数均少于4000/mm³。每次口服灵芝胶囊4粒，一日3次，共10〜14天。治疗后，52例患者的白细胞总数平均提高1028/mm³，总有效率。 其中白细胞总数较服药前增加2000/mm³以上者（显效）有11例，占 、白细胞总数较服药前增加1000〜2000/mm³者（进步）有12 例，占；白细胞总数较服药前增加500〜1000/mm³者（好转）有 21例，占和；无效者8例，占。治疗后白细胞总数升高至4000〜 6700/mm³者共计30例，其中用药20天的受试者，又比用药10天者的疗效更好。 又如：使用灵芝菌丝片（所用的菌丝包括固体培养基成分）治疗60例白细胞减少症患者，该组病例治疗前白细胞总数均在4500/mm³以下，病因明确者9例（因长期接触汽油、柴油者3例，慢性疾病者6例），不明原因者51例。经服用灵芝菌丝片（每片，每次3片，每日2次）10〜30天后，白细胞总数平均提高1428/mm³，总有效率，恢复正常者占75%；头晕、乏力、失眠等自觉症状亦有不同程度的改善。 上述各项研究结果说明，灵芝对辐射损伤确实有一定的保护作用，也许久用灵芝保健的人群，对核辐射的抵抗力要比一般人更强一些。 当然此一假设还需要进一步的研究来加以证明。来自：林志彬《灵芝纵横谈》