血红蛋白的检测方法与进展论文

字数可能有点超,你自己截取吧~~ 分子生物学(molecular biology) 在分子水平上研究生命现象的科学。研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结 构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。研究内容包括各种生命过程如光合作用、发育的分子机制、神经活动的机理、癌的发生等。 从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。自20世纪50年代以来，分子生物学是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系 (中心是分子遗传学)和蛋白质-脂质体系（即生物膜）。 生物大分子，特别是蛋白质和核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。现代化学和物理学理论、技术和方法的应用推动了生物大分子结构功能的研究，从而出现了近30年来分子生物学的蓬勃发展。分子生物学和生物化学及生物物理学关系十分密切，它们之间的主要区别在于：①生物化学和生物物理学是用化学的和物理学的方法研究在分子水平，细胞水平，整体水平乃至群体水平等不同层次上的生物学问题。而分子生物学则着重在分子（包括多分子体系）水平上研究生命活动的普遍规律；②在分子水平上，分子生物学着重研究的是大分子，主要是蛋白质，核酸，脂质体系以及部分多糖及其复合体系。而一些小分子物质在生物体内的转化则属生物化学的范围；③分子生物学研究的主要目的是在分子水平上阐明整个生物界所共同具有的基本特征，即生命现象的本质；而研究某一特定生物体或某一种生物体内的某一特定器官的物理、化学现象或变化，则属于生物物理学或生物化学的范畴。 发展简史 结构分析和遗传物质的研究在分子生物学的发展中作出了重要的贡献。结构分析的中心内容是通过阐明生物分子的三维结构来解释细胞的生理功能。1912年英国 .布喇格和.布喇格建立了X射线晶体学，成功地测定了一些相当复杂的分子以及蛋白质的结构。以后布喇格的学生.阿斯特伯里和.贝尔纳又分别对毛发、肌肉等纤维蛋白以及胃蛋白酶、烟草花叶病毒等进行了初步的结构分析。他们的工作为后来生物大分子结晶学的形成和发展奠定了基础。50年代是分子生物学作为一门独立的分支学科脱颖而出并迅速发展的年代。首先是在蛋白质结构分析方面，1951年.波林等提出了 α-螺旋结构，描述了蛋白质分子中肽链的一种构象。1955年F.桑格完成了胰岛素的氨基酸序列的测定。接着 .肯德鲁和.佩鲁茨在X射线分析中应用重原子同晶置换技术和计算机技术分别于1957和1959年阐明了鲸肌红蛋白和马血红蛋白的立体结构。1965年中国科学家合成了有生物活性的胰岛素，首先实现了蛋白质的人工合成。 另一方面，M.德尔布吕克小组从1938年起选择噬菌体为对象开始探索基因之谜。噬菌体感染寄主后半小时内就复制出几百个同样的子代噬菌体颗粒，因此是研究生物体自我复制的理想材料。1940年.比德尔和.塔特姆提出了“一个基因，一个酶”的假设，即基因的功能在于决定酶的结构，且一个基因仅决定一个酶的结构。但在当时基因的本质并不清楚。1944年.埃弗里等研究细菌中的转化现象，证明了DNA是遗传物质。1953年.沃森和.克里克提出了DNA的双螺旋结构，开创了分子生物学的新纪元。在此基础上提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动。遗传密码的阐明则揭示了生物体内遗传信息的贮存方式。1961年F.雅各布和J.莫诺提出了操纵子的概念，解释了原核基因表达的调控。到20世纪60年代中期，关于DNA自我复制和转录生成RNA的一般性质已基本清楚，基因的奥秘也随之而开始解开了。 仅仅30年左右的时间，分子生物学经历了从大胆的科学假说，到经过大量的实验研究，从而建立了本学科的理论基础。进入70年代，由于重组DNA研究的突破，基因工程已经在实际应用中开花结果，根据人的意愿改造蛋白质结构的蛋白质工程也已经成为现实。 基本内容 蛋白质体系 蛋白质的结构单位是α-氨基酸。常见的氨基酸共20种。它们以不同的顺序排列可以为生命世界提供天文数字的各种各样的蛋白质。 蛋白质分子结构的组织形式可分为 4个主要的层次。一级结构，也叫化学结构，是分子中氨基酸的排列顺序。首尾相连的氨基酸通过氨基与羧基的缩合形成链状结构，称为肽链。肽链主链原子的局部空间排列为二级结构。二级结构在空间的各种盘绕和卷曲为三级结构。有些蛋白质分子是由相同的或不同的亚单位组装成的，亚单位间的相互关系叫四级结构。 蛋白质的特殊性质和生理功能与其分子的特定结构有着密切的关系，这是形形色色的蛋白质所以能表现出丰富多彩的生命活动的分子基础。研究蛋白质的结构与功能的关系是分子生物学研究的一个重要内容。 随着结构分析技术的发展，现在已有几千个蛋白质的化学结构和几百个蛋白质的立体结构得到了阐明。70年代末以来，采用测定互补DNA顺序反推蛋白质化学结构的方法，不仅提高了分析效率，而且使一些氨基酸序列分析条件不易得到满足的蛋白质化学结构分析得以实现。 发现和鉴定具有新功能的蛋白质，仍是蛋白质研究的内容。例如与基因调控和高级神经活动有关的蛋白质的研究现在很受重视。 蛋白质－核酸体系 生物体的遗传特征主要由核酸决定。绝大多数生物的基因都由 DNA构成。简单的病毒，如λ噬菌体的基因组是由 46000个核苷酸按一定顺序组成的一条双股DNA（由于是双股DNA，通常以碱基对计算其长度）。细菌，如大肠杆菌的基因组，含4×106碱基对。人体细胞染色体上所含DNA为3×109碱基对。 遗传信息要在子代的生命活动中表现出来，需要通过复制、转录和转译。复制是以亲代 DNA为模板合成子代 DNA分子。转录是根据DNA的核苷酸序列决定一类RNA分子中的核苷酸序列；后者又进一步决定蛋白质分子中氨基酸的序列，就是转译。因为这一类RNA起着信息传递作用，故称信使核糖核酸(mRNA)。由于构成RNA的核苷酸是4种，而蛋白质中却有20种氨基酸，它们的对应关系是由mRNA分子中以一定顺序相连的 3个核苷酸来决定一种氨基酸，这就是三联体遗传密码。 基因在表达其性状的过程中贯串着核酸与核酸、核酸与蛋白质的相互作用。DNA复制时，双股螺旋在解旋酶的作用下被拆开，然后DNA聚合酶以亲代DNA链为模板，复制出子代 DNA链。转录是在 RNA聚合酶的催化下完成的。转译的场所核糖核蛋白体是核酸和蛋白质的复合体，根据mRNA的编码，在酶的催化下，把氨基酸连接成完整的肽链。基因表达的调节控制也是通过生物大分子的相互作用而实现的。如大肠杆菌乳糖操纵子上的操纵基因通过与阻遏蛋白的相互作用控制基因的开关。真核细胞染色质所含的非组蛋白在转录的调控中具有特殊作用。正常情况下，真核细胞中仅2～15％基因被表达。这种选择性的转录与转译是细胞分化的基础。 蛋白质－脂质体系 生物体内普遍存在的膜结构，统称为生物膜。它包括细胞外周膜和细胞内具有各种特定功能的细胞器膜。从化学组成看，生物膜是由脂质和蛋白质通过非共价键构成的体系。很多膜还含少量糖类，以糖蛋白或糖脂形式存在。 1972年提出的流动镶嵌模型概括了生物膜的基本特征：其基本骨架是脂双层结构。膜蛋白分为表在蛋白质和嵌入蛋白质。膜脂和膜蛋白均处于不停的运动状态。 生物膜在结构与功能上都具有两侧不对称性。以物质传送为例，某些物质能以很高速度通过膜，另一些则不能。象海带能从海水中把碘浓缩 3万倍。生物膜的选择性通透使细胞内pH和离子组成相对稳定，保持了产生神经、肌肉兴奋所必需的离子梯度，保证了细胞浓缩营养物和排除废物的功能。 生物体的能量转换主要在膜上进行。生物体取得能量的方式，或是像植物那样利用太阳能在叶绿体膜上进行光合磷酸化反应；或是像动物那样利用食物在线粒体膜上进行氧化磷酸化反应。这二者能量来源虽不同，但基本过程非常相似，最后都合成腺苷三磷酸。对于这两种能量转换的机制，P.米切尔提出的化学渗透学说得到了越来越多的证据。生物体利用食物氧化所释放能量的效率可达70％左右，而从煤或石油的燃烧获取能量的效率通常为20～40％，所以生物力能学的研究很受重视。对生物膜能量转换的深入了解和模拟将会对人类更有效地利用能量作出贡献。 生物膜的另一重要功能是细胞间或细胞膜内外的信息传递。在细胞表面，广泛地存在着一类称为受体的蛋白质。激素和药物的作用都需通过与受体分子的特异性结合而实现。癌变细胞表面受体物质的分布有明显变化。细胞膜的表面性质还对细胞分裂繁殖有重要的调节作用。 对细胞表面性质的研究带动了糖类的研究。糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂等生物大分子结构与功能的研究越来越受到重视。从发展趋势看，寡糖与蛋白质或脂质形成的体系将成为分子生物学研究的一个新的重要的领域。 理论意义和应用 分子生物学的成就说明：生命活动的根本规律在形形色色的生物体中都是统一的。例如，不论在何种生物体中，都由同样的氨基酸和核苷酸分别组成其蛋白质和核酸。遗传物质，除某些病毒外，都是DNA，并且在所有的细胞中都以同样的生化机制进行复制。分子遗传学的中心法则和遗传密码，除个别例外，在绝大多数情况下也都是通用的。 物理学的成就证明，一切物质的原子都由为数不多的基本粒子根据相同的规律所组成，说明了物质世界结构上的高度一致，揭示了物质世界的本质，从而带动了整个物理学科的发展。分子生物学则在分子水平上揭示了生命世界的基本结构和生命活动的根本规律的高度一致，揭示了生命现象的本质。和过去基本粒子的研究带动物理学的发展一样，分子生物学的概念和观点也已经渗入到基础和应用生物学的每一个分支领域，带动了整个生物学的发展，使之提高到一个崭新的水平。 过去生物进化的研究，主要依靠对不同种属间形态和解剖方面的比较来决定亲缘关系。随着蛋白质和核酸结构测定方法的进展，比较不同种属的蛋白质或核酸的化学结构，即可根据差异的程度，来断定它们的亲缘关系。由此得出的系统进化树，与用经典方法得到的是基本符合的。采用分子生物学的方法研究分类与进化有特别的优越性。首先，构成生物体的基本生物大分子的结构反映了生命活动中更为本质的方面。其次，根据结构上的差异程度可以对亲缘关系给出一个定量的，因而也是更准确的概念。第三，对于形态结构非常简单的微生物的进化，则只有用这种方法才能得到可靠结果。 高等动物的高级神经活动是极其复杂的生命现象，过去多是在细胞乃至整体水平上研究，近年来深入到分子水平研究的结果充分说明高级神经活动也同样是以生物大分子的活动为基础的。例如，在高等动物学习与记忆的过程中，大脑中RNA和蛋白质的组成发生明显的变化，并且一些影响生物体合成蛋白质的药物也显著地影响学习与记忆的能力。又如，“生物钟”是一种熟知的生物现象。用鸡进行的实验发现，有一种重要的神经传递介质（5-羟色胺）和一种激素（褪黑激素）以及控制它们变化的一种酶，在鸡脑中的含量呈24小时的周期性变化。正是这种变化构成了鸡的“生物钟”的物质基础。 在应用方面，生物膜能量转换原理的阐明，将有助于解决全球性的能源问题。了解酶的催化原理就能更有针对性地进行酶的人工模拟，设计出化学工业上广泛使用的新催化剂，从而给化学工业带来一场革命。 分子生物学在生物工程技术中也起了巨大的作用，1973年重组DNA技术的成功，为基因工程的发展铺平了道路。80年代以来，已经采用基因工程技术，把高等动物的一些基因引入单细胞生物，用发酵方法生产干扰素、多种多肽激素和疫苗等。基因工程的进一步发展将为定向培育动、植物和微生物良种以及有效地控制和治疗一些人类遗传性疾病提供根本性的解决途径。 从基因调控的角度研究细胞癌变也已经取得不少进展。分子生物学将为人类最终征服癌症做出重要的贡献。 [编辑本段]分子生物学的应用 1，亲子鉴定 近几年来，人类基因组研究的进展日新月异，而分子生物学技术也不断完善，随着基因组研究向各学科的不断渗透，这些学科的进展达到了前所未有的高度。在法医学上，STR位点和单核苷酸（SNP）位点检测分别是第二代、第三代DNA分析技术的核心，是继RFLPs（限制性片段长度多态性）VNTRs（可变数量串联重复序列多态性）研究而发展起来的检测技术。作为最前沿的刑事生物技术，DNA分析为法医物证检验提供了科学、可靠和快捷的手段，使物证鉴定从个体排除过渡到了可以作同一认定的水平，DNA检验能直接认定犯罪、为凶杀案、强奸杀人案、碎尸案、强奸致孕案等重大疑难案件的侦破提供准确可靠的依据。随着DNA技术的发展和应用，DNA标志系统的检测将成为破案的重要手段和途径。此方法作为亲子鉴定已经是非常成熟的，也是国际上公认的最好的一种方法。参考资料：蛋白质质谱分析研究进展 摘 要： 随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用，并对其发展前景作出展望。 关键词： 蛋白质，质谱分析，应用 前言： 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上， 作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。 自约翰.芬恩()和田中耕一()发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。 1．质谱分析的特点 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 2．质谱分析的方法 近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。 3．蛋白质的质谱分析 蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。 蛋白质的质谱分析原理 以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。 蛋白质和肽的序列分析 现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI TOF MS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一 [5] 。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白质一级结构(序列)谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。 蛋白质质谱分析研究进展 来自: 免费论文网 蛋白质的质谱分析方式 质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法：一种方法叫蛋白图谱(proteinmapping)，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂.第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(laddersequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。 蛋白消化 蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的赖氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)处将其切断。因此，同一蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。 基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(MALDI-TOF MS) [7] 简而言之，基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号，并依据质量/电荷之比(mass/charge，m/z)来对该多肽进行分析，以判断该多肽源自哪一个蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(matrix)混合，此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发，样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中，样品然后置于激光离子发生器(lasersource)。激光作用于样品混合物，使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽，使之由固态样品混合物变成气态。由于多肽分子倾向于吸收单一光子，故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪(TOFmassanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷的比值成反比，即质量/电荷之比越高，飞行时间越短。最后，由电脑软件将探测器录得的多肽质量/电荷比值同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的质量/电荷比值进行比较，以鉴定该多肽源自何种蛋白.此法称为多肽质量指纹分析(peptidemassfin-gerprinting)。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法操作简便，敏感度高，同许多蛋白分离方法相匹配，而且，现有数据库中有充足的关于多肽质量/电荷比值的数据，因此成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。 电子喷雾电离质谱测量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8 ] 同基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法在固态下完成不同，电子喷雾电离质谱测量法是在液态下完成，而且多肽离子带有多个电荷，由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样本由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。去除这些杂质成分后，多肽离子进入连续质量分析仪(tan- demmassanalyzer)，连续质量分析仪选取某一特定质量/电荷比值的多肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后，依质量/电荷比值对电离片段进行分析并汇集成离子谱(ionspectrum)，通过数据库检索，由这些离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通过蛋白氨基酸序列数据库检索，也可通过核糖核酸数据库检索来进行蛋白鉴定。 蛋白质质谱分析研究进展 来自: 免费论文网 4．蛋白质质谱分析的应用 1981年首先采用FAB双聚焦质谱测定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，质谱中出现准分子离子[M+1]+=1319强峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白质合适用FAB质谱分析，更大分子量的多肽和蛋自质可用MALDI质谱或ESI质谱分析。用MALDI-TOF质谱分析蛋自质最早一例是Hillen Kramp等[9]于1988年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF谱仪上测出质量数高达60kDa蛋白质，精确度开始只有，后改进到。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量，也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究[10,11],三条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。近年来，串联质谱分析仪发展迅猛，其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高，大规模数据库和一些分析软件(如:SEQUEST)的应用使得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前，利用2D电泳及MS技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析，已经鉴定出1484种蛋白质，包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质[12]；分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分[13]，并利用质谱进行鉴定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白(SDNP)的分子结构[15]等。 结束语： 在蛋白质的质谱分析中，质谱的准确性(accuracy)对测定结果有很大影响，因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点，这些都非常适合于现在科学研究的需要。我们相信，随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进，蛋白双向电泳的应用[16]以及质谱技术的不断完善，质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。

王传新教授毕业于山东大学医学院，获医学博士学位，从事免疫学及血液学的临床、教学和科研工作，在国内率先将全血法血小板微粒检测应用于心脑血管疾病的诊断，建立了尿血红蛋白检测新方法，一直从事肿瘤早期诊断及致瘤病毒与HLA的相关性研究。承担山东大学医学院五年制、六年制及七年制《临床免疫学检验》、《实验诊断学》及研究生课程《科研相关技术及进展》的教学任务，曾获山东大学齐鲁医院理论授课优秀教师。 主要研究方向：肿瘤免疫和分子生物学。近几年先后承担山东卫生厅青年基金《APC,hMSH1,hmSH2基因在结肠息肉和结肠癌诊断治疗的作用》，山东省科技厅课题《恶性肿瘤转移的分子机制》等；现承担国家自然基金《宫颈癌发病相关病毒HPV亚型筛查及下调机制的研究》、山东省科技攻关项目《血清差异蛋白在结直肠癌诊断及转移中的研究》、山东省科技厅国际合作研究课题 《HBV感染与宿主MHC-I类分子关系研究》等课题，纵向科研经费45万元。参与完成的课题《肿瘤表面和宿主MHC在部分实体瘤发生和转移中作用研究》获教育部推荐国家科技进步二等奖，主持完成的课题获山东省科技进步三等奖三项，山东省医学科技创新成果二等奖一项。全国高等院校“十一五”规划教材《临床检验免疫学》编委，卫生部科教司全国专科医师培训教材《医学检验与临床》副主编，另主编《现代检验医学技术及质量控制》、《检验与临床肾病分册》等著作五部，参编《分子免疫学与临床》等著作六部。近几年在国内外核心期刊发表学术论文40余篇， SCI论文6篇，其中“Association of human papillomavirus type 16 E7 and HLA class I antigen expression in cervical premalignant and malignant lesions” 参加美国临床化学协会（简称AACC）第五十九次年会被评为优秀论文并获奖励。2009年拟招收博士研究生 2名，所培养研究生可在医院检验科及科研机构工作。1. 《宫颈癌发病相关病毒HPV亚型筛查及机制的研究》 国家自然科学基金，第一位（8万元）2. 《HPV16 E7基因致细胞膜表面HLA-I类分子下调机制研究》 山东省医药卫生杰出学科带头人基金，第一位（10万元）3. 《血清差异蛋白在结直肠癌诊断及转移中的研究》 山东省科技攻关项目，第一位（12万元）4. 《HLA-I类分子在乙型肝炎病毒感染患者中的应用研究》 山东省国际合作项目，第一位（10万元）5. 《HPV致宫颈癌MHC-I类分子下调机制研究》山东省自然科学基金，第一位（5万元）1. Association of human papillomavirus type 16 E7 and HLA class I antigen espression in cervial premalignant and malignant lesions. International journal of Biological Markers 2007,22(2):124-131（通讯作者，SCI收录）2. Establishment of serum protein pattern for screening colorectal cancer using SELDI-TOF-MS. Experimental Oncology 2006,28(4):282-287（通讯作者，SCI收录）3. Expression of HLA class I and II on peripheral blood lymphocytes in HBV infection. （第一作者，SCI收录）4. 应用液相芯片技术筛查山东地区高危人群人乳头瘤病毒基因型，中华流行病学杂志 2007，28（5）：487-490（通讯作者）5. 实时荧光定量PCR测定人乳头瘤病毒16型E7基因方法学的建立及其在宫颈疾病诊断中的应用价值，中华检验医学杂志2007，30（10）（通讯作者）6. 淋巴细胞HLA-A mRNA方法学的建立及在HBV感染患者中的应用，中华检验医学杂志2006,29(8): 708-710（第一作者） 7. 老年性血栓形成患者血小板微颗粒、表面膜糖蛋白Ⅱb-Ⅲa、聚集率的检测，中华老年医学杂志2004,23（6）：390-392（第一作者） 8. ITP患者血小板微颗粒检测与抗血小板膜表面糖蛋白CD62P的相关性，中华医学杂志2003,83(21): 1918-1919（第一作者） 出版学术著作1. 《现代检验医学技术及质量控制》，山东科技出版社，2004，第一主编2. 《检验与临床诊断肾病分册》，人民军医出版社，2006，第一主编3. 《医学检验与临床应用》，人民卫生出版社，2008，副主编4. 《临床检验免疫学》“十一五”国家规划教材，高等教育出版社，2007，编委5. 《分子免疫学与临床》，山东科技出版社，2003，编委

红细胞生存的周期一般只有120天，做糖化血红蛋白测定可以观察到患者的血糖在120天之内，是否是稳定的。一般能和葡萄糖结合的血红蛋白只是占到了一小部分，可能只有4%到6%，所以说糖化血红蛋白测定的正常值也就在这个范围之内，可以代表我们身体在120天左右内血糖的平均值，结果更具参考性。对于糖尿病患者来说，进行糖尿病治疗，平时最重要的就是使血糖趋于稳定，在这过程我们要及时了解血糖到底有没有控制住，因此，血糖的测量是必须要做的事情，除了在家用血糖仪进行检测外，还可以用三诺的A1CNow+糖化血红蛋白检测仪进行检测，一般三个月检测一次就行。

【关键词】 蛋白质组 【关键词】 线粒体；蛋白质组 0引言 线粒体拥有自己的DNA（mtDNA），可以进行转录、翻译和蛋白质合成. 根据人类的基因图谱，估计大约有1000~2000种线粒体蛋白，大约有600多种已经被鉴定出来. 线粒体蛋白质只有2%是线粒体自己合成的，98%的线粒体蛋白质是由细胞核编码、细胞质核糖体合成后运往线粒体的，线粒体是真核细胞非常重要的细胞器，在细胞的整个生命活动中起着非常关键的作用. 线粒体的蛋白质参与机体许多生理、病理过程，如ATP的合成、脂肪酸代谢、三羧酸循环、电子传递和氧化磷酸化过程. 线粒体蛋白质结构与功能的改变与人类许多疾病相关，如退行性疾病、心脏病、衰老和癌症. 尤其是在神经退行性疾病方面，线粒体蛋白质的研究日益受到关注. 蛋白质组研究技术的产生与发展为线粒体蛋白质组的研究提供了有力的支持，使得从整体上研究线粒体蛋白质组在生理、病理过程中的变化成为可能. 1线粒体的结构、功能与人类疾病 线粒体一般呈粒状或杆状，也可呈环形、哑铃形或其他形状，其主要化学成分是蛋白质和脂类. 线粒体由内外两层膜封闭，包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个部分. 线粒体在细胞内的分布一般是不均匀的，根据细胞代谢的需要，线粒体可在细胞质中运动、变形和分裂增殖. 线粒体是细胞进行呼吸的主要场所，在细胞代谢旺盛的需能部位比较集中，其主要功能是进行氧化磷酸化，合成ATP，为细胞生命活动提供直接能量. 催化三羧酸循环、氨基酸代谢、脂肪酸分解、电子传递、能量转换、DNA复制和RNA合成等过程所需要的一百多种酶和辅酶都分布在线粒体中. 这些酶和辅酶的主要功能是参加三羧酸循环中的氧化反应、电子传递和能量转换. 线粒体具有独立的遗传体系，能够进行DNA复制、转录和蛋白质翻译. 线粒体不仅为细胞提供能量，而且还与细胞中氧自由基的生成、细胞凋亡、细胞的信号转导、细胞内离子的跨膜转运及电解质稳态平衡的调控等有关. 许多实验证实，线粒体功能改变与细胞凋亡〔1〕、衰老〔2〕、肿瘤〔3，4〕的发生密切相关；另外，有许多人类疾病的发生与线粒体功能缺陷相关，如线粒体肌病和脑肌病、线粒体眼病，老年性痴呆、帕金森病、2型糖尿病、心肌病及衰老等，有人统称为线粒体疾病〔5〕. 2线粒体蛋白质组学研究现状 线粒体蛋白质组的蛋白质鉴定Rabilloud等〔6〕在1998年，以健康人的胎盘作为组织来源，分离提取线粒体进行蛋白质组研究，试图建立线粒体蛋白质组的数据库，为研究遗传性或获得性线粒体功能障碍时线粒体蛋白质的变化提供依据. 他们使用IPG（pH ）双相电泳技术, 共获得1500个蛋白点. 通过MALDITOFMS和PMF等技术鉴定其中的一些蛋白点，鉴于当时基因组信息的局限性，只有46种蛋白被鉴定出来. 随着人类基因组图谱的完成，应该有更多的蛋白点被鉴定出来. Fountoulakis等〔7〕从大鼠的肝脏中分离线粒体，并分别利用宽范围和窄范围pH梯度IPG对线粒体蛋白质进行双相电泳，通过MALDIMS鉴定出192个基因产物，大约70%的基因产物是具有广谱催化能力的酶，其中8个基因产物首次被检测到并且由一个点构成，而大多数蛋白质都是由多个点构成，平均10~15个点对应于一个基因产物. Mootha等〔8〕从小鼠大脑、心脏、肾脏、肝脏中分离提取线粒体蛋白质，进行线粒体蛋白质组研究，他们参照已有的基因信息共鉴定出591个线粒体蛋白质，其中新发现了163个蛋白质与线粒体有关. 这些蛋白质的表达与RNA丰度的检测在很大程度上是一致的. 不同组织的RNA表达图谱揭示出线粒体基因在功能、调节机制方面形成的网络. 对这些蛋白与基因的整合分析使人们对哺乳动物生物起源的认识更加深入，对理解人类疾病也具有参考价值. 线粒体亚组分的研究线粒体对维持细胞的体内平衡起着关键作用，因此加速了人们对线粒体亚组分的研究. 线粒体内膜不仅包含有呼吸链复合物，它还包含多种离子通道和转运蛋白. 对线粒体发挥正常的功能起着重要作用. Cruz等〔9〕专注于线粒体内膜蛋白质的研究，他们通过二维液相色谱串联质谱技术鉴定出182个蛋白质，pI（），MW（Mr 6000~527 000），这些蛋白与许多生化过程相关，比如电子传递、蛋白质运输、蛋白质合成、脂类代谢和离子运输. 线粒体蛋白质复合物的研究线粒体内膜上嵌有很多蛋白质复合物，对于线粒体的功能具有重要作用，应用常规的双相电泳很难将这些蛋白质复合物完整地分离出来. Devreese等〔10〕采用Bluenative polyacrylamide gel electrophoresis（BNPAGE）分离线粒体内膜上的五个氧化磷酸化复合物，结合肽质量指纹图谱，成功地鉴定出氧化磷酸化复合物中60%的已知蛋白质. BNPAGE在分离蛋白质复合物时可以保持它们的完整性，因此这项技术可以用于研究在不同的生理病理状态下蛋白质复合物的变化及临床诊断等. 线粒体蛋白质组数据库目前人们查询最多的线粒体蛋白质组数据库有MITOP, MitoP2和SWISSPROT三种. MITOP〔11〕是有关线粒体、核编码的基因和相应的线粒体蛋白质的综合性数据库，收录了1150种线粒体相关的基因和对应的蛋白质，人们可依据基因、蛋白质、同源性、通道与代谢、人类疾病分类查询相关的信息.MitoP2〔12〕数据库中主要为核编码的线粒体蛋白质组的数据，MitoP2数据库将不同来源的线粒体蛋白质的信息整合在一起，人们可以根据不同的参数进行查询. MitoP2数据库既包括最新的数据也包括最初的MITOP〔11〕数据库中的数据. 目前数据库中主要为酵母和人的线粒体蛋白质组的数据，以后还将收录小鼠、线虫等的数据. 数据库旨在为人们提供线粒体蛋白质的综合性数据. SWISSPROT数据库包含269种人类线粒体蛋白质，其中与人类疾病相关的蛋白质有225种. 数据库中有相当一部分蛋白质没有明确的定位和功能信息的描述. 随着线粒体研究热潮到来和蛋白质组学技术的发展，将有更多的数据被填充到数据库中. 3线粒体蛋白质组研究中存在的问题 线粒体碱性蛋白质与低分子量蛋白质线粒体蛋白质中，具有碱性等电点的蛋白质占有很大比例，在等电聚焦时难以溶解，一些碱性程度很大的蛋白质如细胞色素C（pH ）在pH 3~10的IPG胶上不能被分离出. 线粒体蛋白质中相当一部分蛋白是低分子量蛋白，因此在SDSPAGE电泳时要分别应用高浓度和低浓度分离胶，以更好地分离低分子量蛋白质和高分子量蛋白质. 线粒体膜蛋白质线粒体是一个具有双层膜结构的细胞器，内膜和外膜上整和有很多膜蛋白质，这些膜蛋白质对于线粒体功能的发挥具有重要作用，但是膜蛋白质具有很强的疏水性，在等电聚焦时，用常规的水化液难以溶解，因此用常规的IPG胶检测不出来. 换用不同的裂解液对膜蛋白的溶解具有帮助. 有研究人员在等电聚焦缓冲液中加入SB310以增加膜蛋白的溶解性. 在等电聚焦前对样品进行有机酸处理也可以增加膜蛋白的溶解性. 在研究中人们发现,不同的样品应该选用不同的裂解液，没有一种裂解液能够适合于所有的膜蛋白质.百事通针对膜蛋白质的难溶和等电聚焦时的沉淀，一些研究人员另辟径，避开双相电泳而进行一维SDSPAGE电泳，如Taylor等〔13〕先通过蔗糖梯度离心将线粒体蛋白质分成不同的组分，而后将每一个组分进行一维电泳，一维电泳中SDS可以很好地溶解疏水性蛋白质和膜整合蛋白质，他们鉴定出600多种线粒体蛋白质，其中有很多蛋白质以前应用双相电泳没有被鉴定出来. 他们鉴定的蛋白质中有很多具有跨膜结构域，如adenine nucleotide translocator（ANT1）和VDACs蛋白质，这些蛋白质对于调节线粒体的功能具有关键作用而且应用常规双相电泳很难被鉴定出来. 提高质谱鉴定的灵敏性对于一维SDSPAGE电泳后蛋白质分析鉴定具有很大的帮助，Pflieger等〔14〕应用液相色谱串联质谱（LCMS/MS）成功地鉴定出179种线粒体蛋白质，其中43%是膜蛋白质而且23%具有跨膜结构域. 液相色谱串联质谱（LCMS/MS）检测灵敏度较高，SDS可以很好地溶解膜蛋白，因此这种方法比传统的双相电泳具有更高的灵敏性而且不受蛋白质等电点、分子量、疏水性的限制. 线粒体样品的纯度线粒体样品的纯度对于蛋白质组分析非常重要，在样品制备的过程中，具有与线粒体相同沉降系数的成分会同线粒体一起沉降下来，如内质网、微粒体、胞浆蛋白的一些成分. 这些蛋白斑点出现在双相电泳胶上，会影响整体蛋白质组分析的结果. 因此提高样品的纯度至关重要. Scheffler等〔15〕采用多步percoll/metrizamide密度梯度离心纯化线粒体样品，双相电泳后鉴定出61个蛋白质，几乎全部是线粒体蛋白质. 4未来展望 随着人类基因组工作草图的完成，生命科学的研究进入后基因组时代，蛋白质组学的研究遂成为重点. 蛋白质组学旨在采用全方位、高通量的技术路线，确认生物体全部蛋白质的表达和功能模式，从一个机体、一个器官组织或一个细胞的蛋白质整体活动来揭示生命规律，并研究疾病的发生机制、建立疾病的早期诊断和防治方法. 抗体技术在线粒体蛋白质组学领域中具有重要的应用价值. 单克隆抗体还具有高度的特异性，应用于亲和层析技术中不仅可以去除组织细胞样品中高表达的蛋白质成分，同样也可以富集表达量极低的组分. 结合蛋白免疫转印、流式细胞术和免疫组织细胞化学，实现对相应蛋白质的定性、定量和细胞（内）定位分析. 与微阵列技术（芯片）结合，可以研制出含有成百上千种抗体的蛋白(抗体)芯片，这种新技术使得研究人员可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度，能够检测到样品中浓度很低的抗原，以实现蛋白质组学对复杂组分高通量、高效率的检测. 某些抗体可以特异性识别蛋白质翻译后修饰的糖基化或磷酸化位点、降解产物、功能状态和构象变化，成为基因芯片检测不可替代的补充. 抗体捕获组分的分析有助于蛋白质复合物及其相互作用的研究，也在新的蛋白质发现和确认方面提供重要信息和证据. 随着抗体技术的不断提高，抗体数目的不断增多，蛋白质组学的研究也将更加深入. 线粒体不仅参与细胞重要的生命活动，而且对于生物进化的研究也有重要意义. 随着线粒体研究热潮的到来，将有更多的蛋白质被发现，对于蛋白质功能的研究也将更加深入，相信线粒体蛋白质组的研究对于人类疾病的发病机制和早期诊断将做出重要贡献. 【参考文献】 〔1〕 Jiang X, Wang X. Cytochrome Cmediated apoptosis 〔J〕. Annu Rev Biochem, 2004,73: 87-106. 〔2〕 Chen XJ, Wang X, Kaufman BA, et al. Aconitase couples metabolic regulation to mitochondrial DNA maintenance 〔J〕. Science, 2005,307(5710): 714-717. 〔3〕 Petros JA, Baumann AK, RuizPesini E, et al. mtDNA mutations increase tumorigenicity in prostate cancer 〔J〕. PNAS, 2005,102(3):719-724. 〔4〕 Wonsey DR, Zeller KI, Dang CV. The cMyc target gene PRDX3 is required for mitochondrial homeostasis and neoplastic transformation 〔J〕. PNAS, 2002, 99(10): 6649-6654. 〔5〕 Taylor RW, Turnbull DM. Mitochondrial DNA mutations in human disease〔J〕. Nat Rev Genet, 2005,6:389-402. 〔6〕 Rabilloud T, Kieffer S, Procaccio V, et al. Twodimensional electrophoresis of human placental mitochondria and protein identification by mass spectrometry: toward a human mitochondrial proteome 〔J〕. Electrophoresis, 1998,19:1006-1014. 〔7〕 Fountoulakis M, Berndt P, Langen H, et al. The rat liver mitochondrial proteins〔J〕. Electrophoresis, 2002,23:311-328. 〔8〕 Mootha VK, Bunkenborg J, Olsen JV, et al. Integrated analysis of protein composition, tissue diversity, and gene regulation in mouse mitochondria 〔J〕. Cell, 2003,115(5): 629-640. 〔9〕 Cruz SD, Xenarios I, Langridge J, et al. Proteomic analysis of the mouse liver mitochondrial inner membrane 〔J〕. J Biol Chem, 2003, 278(42): 41566-41571. 〔10〕 Devreese B, Vanrobaeys F, Smet J, et al. Mass spectrometric identification of mitochondrial oxidative phosphorylation subunits separated by twodimensional bluenative polyacrylamide gel electrophoresis 〔J〕. Electrophoresis, 2002,23: 2525-2533. 〔11〕 Scharfe C, Zaccaria P, Hoertnagel K, et al. MITOP, the mitochondrial proteome database: 2000 update 〔J〕. Nuc Acid Res, 2000,28(1):155-158. 〔12〕 Andreoli C, Prokisch H, Hortnagel K, et al. MitoP2, an integrated database on mitochondrial proteins in yeast and man 〔J〕. Nuc Acid Res, 2004,32(90001):459-462. 〔13〕 Taylor SW, Warnock DE, Glenn GM, et al. An alternative strategy to determine the mitochondrial proteome using sucrose gradient fractionation and 1D PAGE on highly purified human heart mitochondria 〔J〕. J Proteome Res, 2002,1(5):451-458. 〔14〕 Pflieger D, Le Caer JP, Lemaire C, et al. Systematic identi?cation of mitochondrial proteins by LCMS/MS 〔J〕. Anal Chem, 2002,74:2400-2406. 〔15〕 Scheffler NK, Miller SW, Carroll AK, et al. Twodimensional electrophoresis and mass spectrometric identification of mitochondrial proteins from an SHSY5Y neuroblastoma cell line〔J〕. Mitochondrion, 2001,1(2):161-179.

罗建明腰椎间盘突出症的主要症状为腰背腿痛，轻者可给患者生活及工作带来痛苦和困难，重者丧失生活和工作的能力。美国每年因腰腿痛而支付的医疗费和丧失劳动力的补偿费用达500亿美元。显然该病已成了一个社会问题，更是我们治疗学上的一个重要内容。“髓核摘除术”，就是外科手术治疗腰椎间盘突出症的一种主要手段。不可否认，在60年代、70年代，不失为一种被外科手术家们引以为豪的治疗办法。几十年过去了，可手术家们还视此（髓核摘除术）为传家之宝，认为腰腿痛的主要原因是髓核突出对硬膜囊和神经根造成的机械性压迫所致，为此手术时力求除恶务尽方显效果。然而临床疗效却不尽人意，手术疗效不佳，后遗症多，复发率高，更有甚者一次手术不成功，再来第二次最后造成患者终身痛苦。资料表明，经手术摘除髓核后，约有30%的患者症状没有丝毫减轻，个别患者病情反而加重。倘若腰腿痛是因突出的髓核机械性压迫所致，手术摘除髓核后症状随即消失，可事实并非如此，更甚的是，许多并非是由突出的间盘压迫所致的腰腿痛被误诊而行手术治疗，其结果非但未减轻症状反而加重。诸如此类大量事实，不得不引发诸多学者对腰椎间盘突出症引起腰腿痛的发病机制和手术摘除髓核能解除腰腿痛的理论质疑。据美国骨科杂志一篇对2000例患者分别作了1年、3年和5年的随访调查，结果术后1年复发率33%；3年为；5年则高达。突出的间盘已切除，症状却又复现，这足以说明髓核摘除并不能解除腰突症中的腰背腿痛，说明引发腰腿痛症状另有原因。腰椎间盘突出机械性压迫就是引起腰腿痛的根本原因？手术摘除突出的髓核是否能解决腰背腿痛等症状？就临床治疗中相关的问题和治疗机理中尚存争议的观点，阐述本人的观点与同道作一探讨。1、突出的椎间盘机械性压迫和刺激是导致腰背腿痛的主要原因吗？笔者将1990年至2001年采用针刀治疗的500例经CT和MRI确诊的腰椎间盘突出症患者的治疗结果加以分析，认为突出的间盘压迫和刺激并非是导致腰腿痛的根本原因。针刀治疗腰椎间盘突出症，并非针刀能进入椎管将突出的间盘切除或剥离掉，而是松解椎管外的软组织，再结合手法恢复腰椎的力平衡。《黄帝内经·素问》提出人体有阴阳和气，阴阳平衡则可协助生命之气循行十四经络。若气行之处出现阻塞和渗溢，则表明存在阴阳失衡，因此产生疾病和疼痛。中医通过针灸等疗法疏通经络，纠正阴阳失衡，以达到治病去痛之目的。用针刀来松解椎管外软组织、针灸等疗法疏通经络，便可达到治病去痛之目的。说明导致腰腿痛主要不是突出的间盘机械性的压迫所致。、影像学显示：在25~50岁正常男性体力劳动者进行L4~5，L5~S1间隙CT扫描结果，发现有45%的人显示有腰椎间盘突出，部分显示对硬膜囊和神经根有不同程度的压迫现象，而临床却没有任何腰腿痛症状。反之有的腰突症患者CT扫描显示，突出的间盘无硬膜囊和神经根压迫，却腰腿痛症状十分明显，这说明导致腰腿痛除突出的间盘压迫外，另有原因。2、腰腿痛是机械性压迫所致还是无菌性炎症或化学物质所致？传统观点认为，腰椎间盘突出引起坐骨神经痛的机制，是髓核突出物单纯的机械性压迫腰骶脊神经根所致。可临床事实并非如此。Crarfin（1991）对神经根性疼痛提出的机械性压迫问题认为，机械性压迫不是致痛的唯一因素，他报道4例有根性痛的患者，未发现与神经根有关的结构有任何改变，根性痛却渐渐缓解。宣蛰人（1976）经椎管探索手术证实髓核突出物压迫神经根引起神经机能障碍，而无硬膜外结缔组织的继发性、无菌性炎症病变者，视不同的压迫程度而出现下肢的麻木或麻痹，临床上并无腰腿痛现象。只有神经根鞘膜外脂肪组织产生无菌性炎症病变，临床上才会出现腰腿痛。也就是说，炎症反应是产生剧烈疼痛直接的重要因素。然而，腰椎椎管内神经鞘膜与硬膜外炎性反应是如何产生的？其又与间盘髓核突出有何因果关系？椎间盘具有双重神经支配，其外侧部和前纵韧带接受交感神经灰交通支支配，后外侧支及后纵韧带接受灰交通支与窦神经双重支配，呈不均匀分布，大部分分布于外侧与后侧，该区也是椎间盘易损伤部位。组织学观察椎间盘的微损不易引起炎症和愈合，还有间盘的无血运的特性也限制了炎症和愈合反应，原不良愈合导致组织强度下降，反复损伤，最终导致持续性的炎症。Seal（1990）发现，手术切除的间盘组织中的磷脂酸A（PLA）含量增高，说明其参与炎症过程。该学者又将从间盘组织中提取的PLA注入大鼠的后掌，诱发出明显的炎性反应。也表明间盘组织中增高的PLA参与炎症反应。吴闻文等（1996）对20例腰突症患者手术获取的髓核组织进行PLA活性测定，研究结果表明患者髓核组织中PLA活性显著高于自身血液中和健康人间盘髓核中PLA活性水平，患者腰腿痛程度与髓核中PLA活性明显相关。椎间盘髓核组织是体内最大的、无血运的封闭结构，间盘突出后纤维环破裂，髓核基质里的酶蛋白β神经根鞘膜具有强烈的化学刺激性，导致椎管内结缔组织炎性反应及局部组织破坏，使内源性疼痛介质释放（如缓激肽、血清素、组织胺、乙酰胆碱、前列腺素E1E2和三烯B4等）。这样在椎管内神经根机械性压迫损害功能障碍之前，产生了较强烈的无菌性炎症反应，其中非神经源性疼痛介质与神经源性疼痛物质均在腰腿痛中起重要的介导作用。机械性致压因素可以导致神经介导功能障碍，临床上表现为感觉和运动的缺失。神经根无神经外膜，为结缔组织所紧密包裹，外围有鞘膜覆盖。实验证明，神经根营养供应，⑴来自内部血供系统；⑵来自脑脊液。神经根的毛细血管内血浆蛋白向神经内运转少于脊神经节和周围神经，易发生水肿，尤其是严重的腰椎间盘突出患者，压迫导致椎管内静脉瘀血，动静脉短路开放，毛细血管通透性增高，神经根水肿更加明显，（52mmHg）压迫2分钟，足以引起水肿，继而阻断毛细血管的回流，最终出现神经根营养不良及机能障碍，临床上表现为麻林或麻痹。据有关报道证实，腰椎间盘突出患者下腰部深层肌（棘肌）中磷脂酸A含量增高。PLA是一种炎性化学致痛物质，除了椎管内炎症反应参与腰椎间盘突出症的神经根性痛的形成外，椎管外软组织损害性炎症反应很可能是引发腰腿痛的重要因素。此种炎症可导致腰腿痛和肌痉挛两个继发性发病因素。综合上述观点认为：⑴单纯机械性压迫正常神经根不引起疼痛，而是产生麻木或麻痹。⑵神经根鞘膜外和硬膜外脂肪组织的无菌性炎症病变所产生的化学刺激是疼痛的原因。⑶髓核摘除并不能解除腰突症引起的腰腿痛。⑷腰椎是人体腰部活动的中心轴，是腰部力的支撑点，起着杠杆的作用，以此保持腰部的动态平衡。髓核摘除术，破坏腰椎的正常结构，小关节被破坏，造成腰椎的力平衡失调，因此手术后出现后遗症和并发症是不难想象的。⑸手术治疗病人痛苦大，医疗费用昂贵，病人不易接受。为此临床上治疗腰突症不仅要消除椎管内硬膜外和神经根鞘膜外脂肪组织的炎性刺激，还要消除椎管外软组织损害性炎症反应，这是解除疼痛的重要环节，必须配合手法纠正椎体力平衡，用针刀调整软组织动态平衡失调问题，解除对硬膜囊和神经根的压迫。 《世界中医骨科杂志》2005年第一期刊发罗建明寰枢椎错位错位综合症，是指枢椎齿状突偏移或前倾，导致寰椎与颈椎不在一个中轴力线上，颈椎上段推曲变直、钩椎关节错缝、椎体旋转；椎动脉因此而扭曲或痉挛，导致基底动脉供血不足、小脑失氧、平衡失调；颈1、2、3神经受刺激而出现头痛，甚至耳鸣、眼花、面瘫；颈上交感神经节受到刺激而致咽喉不适、胸闷、恶心或者失眠、健忘等系列症状体征。对本症认识还是近几年的事情，既往多将上述症候归类为椎动脉型颈椎病。因为有人认为，寰枢关节不对称，可以有解剖变异，因此，大多数颈椎的X光片都忽略了张口位，未能观察寰枢关节。我国著名整脊专家韦以宗首先在他主编的《中国骨伤科学词典》，将此病收录①；并在《现代中医骨科学》一书中，明确了本病的诊断依据和诊断分型②。现简介如下：诊断依据：患者有后枕不适、头晕头痛或偏头痛、方位性眩晕等头面症状，X线片张口位齿状突偏歪或前倾；侧位C1、2、3有成角旋转，颈曲有改变，触诊可摸到侧偏之寰枢（即两风池穴不对称）局部有压痛者。分型：1) 侧偏型：X线张口位之齿状突偏移，寰枢旋转；侧位片C2、3后成角，颈曲改变不大，颈部活动正常。2) 前倾型：X线片张口位之齿状突前倾，寰枢后倾，出现双边征；侧位颈曲加大，C2、3呈阶梯状改变，颈部活动屈伸受限，旋转尚可。3) 混合型：指前倾与侧偏同时存在。各家疗法：潘东华等③报道根据寰枢椎的分型辩证治疗寰枢椎错缝，根据颈椎张口位X线片的改变，把寰枢椎错缝分为侧偏型和前倾型，治疗方法：首先用理筋手法，寰枢椎错缝不宜作布兜牵引，先行膏摩（药熨）、骨空针调压以理筋松筋，3~5天后行整骨。整骨方法：宜辩证施治，侧偏型：术者用左肘提患者下颌（轻提），右拇、食指二指分别置于寰枢两侧（相当于风池穴），行欲合先离手法旋转复位，前倾型：术式同上，但拇指按压第二颈椎棘突，反复2~3次。治疗结果本组67例，均临床治愈，病程最短5天，最长一个月，平均2周，效果显著。作者强调用韦氏桡动脉实验诊断寰枢椎错缝，准确率达100%。葛冰等④报道不同整骨手法治疗寰枢关节紊乱疗效比较，方法：将52例寰枢关节紊乱的患者随机分成两组，分别采用牵引下郑复手法（27例）与传统的颈椎旋转定位扳法（25例）治疗，观察两组疗效。结果提示牵引下整复手法的疗效优于颈椎旋转定位扳法（P<）.骆大富等⑤报道运用仰卧拨伸旋转法治疗寰枢椎错位，方法：患者仰卧位，颈部垫一薄枕，先在颈部施行按、揉、点手法，重点在风池、天柱、哑门、嫛明、肩井等穴位上，使颈部肌肉充分放松，然后去枕，医者一手拇指固定在患者偏歪的横突部，一手拖住下颌，呈纵轴方向边拔伸牵引边旋转，使患者肩部与床沿基本平齐，头颈水平线略低于床的水平面30度，然后逐渐加大旋转角度，先健侧旋至极度，略加力顿挫一下，接着患侧旋至极度，也略用力顿挫一下，若觉手下有移动感或咯噔声响，且患者自觉症状减轻，头颈旋转自如，即表示复位成功。1~2日1次，用5~8次。结果：本组120例，痊愈88例，显效22例，好转7例，无效2例，恶化1例，总有效率。姚新苗等⑥运用手法配合中药治疗寰枢椎错缝，方法：手法整复：患者取低座位，颈部自然放松，医者立于患者背后，先以按、揉、推、滚法使颈部周围肌肉充分放松，然后点按两侧风池穴。寰椎向右侧错位者，术者以左前臂环抱患者下颌部，右手托其针部，沿颈椎生理弯曲弧的方向提拉牵引1~3分钟，以不加重原有症状为度，然后右手拇指指腹用力按于患者枢椎棘突，双手交叉用力，常可听到喀嚓声，按枢椎棘突之拇指常可感到有一错位之落空感。接着术者改用右手环抱患者下颌，用左手拇指指腹按住患者寰椎右侧横突，以同样方法向右旋转，术毕，颈部周围行理筋手法，缓解软组织痉挛、粘连。然后X线摄片检查复位情况，不理想者隔日1次。并用基本方，药物组成：生芪30g，当归12g，葛根20g,川芎30g，玄胡10g，天麻15g，钩藤12g，地龙30g，泽泻20g，甘草6g。随症加减：病之初，有明显外伤史加红花、五灵脂；反复发作，病久深入，耗及气血肝肾亏虚者加党参、鸡血藤、杜仲、萸肉。结果：本组87例，痊愈38例，显效28例，有效14例，无效7例。何宗宝⑦运用颈椎定位斜扳治疗寰椎综合症，方法：于枕部行一指禅推法，揉按风池、风府、天、点拨压痛点以病侧为主。斜扳手法：医生立于患者身后，以左手拇指按顶偏右的棘突，右手握持下颌，使患者头颈部保持略前倾位，两手相对缓缓用力向右上方旋转，此时多感觉拇指下关节移动，并可闻及响声。术后尚未纠正可重复1次头部行五指拿法，请叩法。每日1次，6次为1疗程。配合针灸丝竹空透率谷、风池、外关。结果：观察150例中痊愈120例，有效30例。廖善军⑧采用针刺为主治疗寰枢关节紊乱症184例，另设西药对照组181例。结果：治疗组临床总有效率，对照组为，治疗组疗效明显优于西药组（P<）许舜沛等⑨报道针推并治寰枢椎错缝，对19例患者进行了针刺风池（双）、风府、哑门、天柱（双）、后溪（双）等结合枕颌牵旋侧扳复位法治疗。结果治愈13例，占；有效6例，占；总有效率100%。认为针刺配合推拿手法治疗本病可活血化瘀、解痉止痛、整复错移，治疗效果显著;同时也强调病愈后应保持坐、卧姿的正确位置，才能巩固疗效，防止复发。杨友刚等【12】综合国内外文献，对先天性，外伤性和病理性引起的寰枢关节错位进行了综述，认为寰枢椎不稳和脱位临床较常见，易导致上颈髓受压，其临床表现主要有枕颈部症状（如枕颈部疼痛、颈部旋转活动受限）；部分患者有脊髓受压表现（如四肢无力、行走不稳、四肢麻木、疼痛以及感觉过敏、手部精细动作障碍等）和椎动脉型颈椎病的表现（如眩晕、视觉模糊、猝倒）。开口位X线片可明确齿状突的外形、齿状突与寰枢侧快间距是否对称，颈椎侧位片主要测量寰齿间距（ADI），正常成人为3mm，如大于此值，可诊断为寰枢关节不稳或脱位。寰枢椎不稳和脱位手术方法有寰枢椎植骨融合术，钢丝固定术，椎扳夹内固定术，关节突螺钉内固定术和寰枢椎椎弓根螺钉固定术，单纯寰枢椎植骨融合术，齿状突螺钉内固定术，经枢椎椎体寰椎侧块螺钉固定术，经口咽前路寰枢椎钢板内固定术。杨氏同时也指出各种手术方式都存在弊端，也未达到完全理想的生理要求。即单纯的减压和复位不能纠正寰枢关节不稳，而内固定虽然能稳定寰枢关节，但又丧失了寰枢关节的运动功能，导致术后病人头颈活动特别是旋转活动明显受限，从而继发上下关节退变和不稳。而且寰枢椎解剂结构特殊、毗邻结构复杂、周围有重要神经和血管，手术难度大、风险高。手法治疗注意问题：寰枢椎错位手法需十分谨慎。特别施行旋转法或斜扳法，需特别注意，否则易引起寰椎或齿状突骨折、脱位，并发延髓损伤，轻者高位截瘫，重者可致死亡。已有报道运用斜扳法导致寰椎脱位致高位截瘫及死亡，齿状突骨折5例报告【10 11】。因此，在世界骨联制订的“中国整脊法治疗规范”中，明确对寰枢椎错位慎用旋转法，对颈椎病禁用斜扳法【12】，这是本症的诊疗过程中的经验教训。所以，临床医师在治疗本症应用手法时，需注意治疗的规范。参考文献：1) 韦以宗，中国骨伤科学词典，北京：中国中医药出版社，2001：5762) 韦以宗，现代中医骨科医学，背景：中国中医药出版社，2004：806-8093) 潘东华，韦春德等，寰枢椎错缝诊断分型和辩证施治。世界中医骨伤科杂志，2001,2（3）77-784) 葛冰，金益，王耀，潘崇海。不同整骨手法治疗寰枢关节紊乱疗效比较。上海中医药杂志，，2000,34（11）30-315) 骆大富，伍先光。仰卧拨伸旋转法治疗寰枢椎错位120例疗效观察。按摩与引导，2000,16（6）396) 姚新苗，高宏。手法配合中药治疗寰枢椎错缝临床分析。中国骨伤，2002,15（5）3097) 何宗宝。颈椎定位斜扳治疗寰椎综合症150例初探。针刺研究，1998,23（3）2088) 廖善军。针刺为主治疗寰枢关节紊乱症184例疗效观察。中国针灸，2000,20（11）655-6569) 许舜沛，柴铁劬。针推并治寰枢椎错缝19例临床观察。心中医，2001,33（5）42-4310) 淡宇武，强力斜扳致高位截瘫一例报导，按摩与导引，1992,1（43）11) 吴道贵等，推拿按摩致齿状突骨折4例，中国骨伤，1994年增刊12) 杨友刚，权正学。寰枢椎不稳和脱位的诊治进展[J]。颈腰痛杂志，2005,26（3）：230-232。13) 中国接骨法整脊法治疗诊疗规范标准，中国中医药报，2004,8,9 从事儿科医疗、教学、科研21年，专长儿童血液系统疾病及肿瘤疾病，科研方向：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的检测和溶血机制，科研成果：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶试纸的研制和应用，已在10多省推广使用20多万例，获97年度广西科技进步贰等奖和广西医药卫生科技进步贰等奖，98年获首届广西优秀青年科技创业奖荣誉称号。主要论文：《血红蛋白H病复合葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏的临床和试验诊断探讨 中华血液学 1991;12(11):578》;《红细胞平均血红蛋白浓度对高铁血红蛋白还原试验的影响 中华血液学杂志 1992;13(10):547》；《高铁血红蛋白还原试验的再改进 中华血液学杂志 1998;19(10):548》；《试纸法测定孕产妇和新生儿的G-6-PD活性 中国小儿血液 1996；(2):75》；《G-6-PD试纸的特点和应用 中国小儿血液 1998；(3):134》。