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放线菌作为生物活性物质的主要产生菌早已成为人们研究的焦点。然而随着放线菌分离和分类研究的不断深入，大量常见菌株已被反复研究，因此从中发现新化合物的几率逐渐降低。由于新物种具有产生新的生物活性物质的潜力，人们开始使用新的方法在尽可能广泛的范围内寻找新的物种，特别是那些用常规方法很少分离到的稀有放线菌 (rare actinornycetes)…。2O世纪 50年代以来人们从稀有放线菌中发现了大量有价值的抗生素，如小单孢菌产生的庆大霉素，诺卡氏菌产生的利福霉素，马杜拉放线菌产生的马杜拉霉素和洋红霉素，糖多孢菌产生的红霉素，游动放线菌产生的游壁菌素，拟无枝酸菌产生的万古霉素等等。这些事实表明稀有放线菌也具有产生新抗生素的巨大潜力ll,21。分离这些稀有放线菌，不仅可以减少对产生已知生物活性物质菌株的重复分离，还可扩展放线菌次生代谢产物的化学多样性。 由于稀有放线菌对生长环境的特殊要求，难以用常规手段分离获得 ，所以要根椐不同类群的特性设计针对这些特定种属的选择性分离方法。近年来，国内外学者在对国家自然科学基金资助项目,云南省自然科学基金重点项目.稀有放线菌选择性分离的研究方面取得了较大进展,同时也用这些选择性分离方法分离到不少稀有放线菌，并显著提高了具有医用前景的生物活性物质的发现机率。此外，这些分离方法的使用也有助于同答这样一个问题 ：稀有放线菌很少被分离到是因为它们在环境中数量稀少，还是仅仅因为它们难以被分离和培养。本文就以上情况介绍了近年来发展起来的几种高选择性分离稀有放线菌的有效方法。 1 胞外多糖胶 (gellan gum)和动孢溶液 (flooding solution)相结合的分离方法 Gellan gum是由Pseudomonas elodea产生的胞外多糖，过去常用来作为植物组织培养的凝固剂，能促进植物生长。Suzuki等人 首先将其用于稀有放线菌的分离，并发现胞外多糖胶能促进很多放线菌的气生菌丝生长和孢子形成.很多物质都能增加放线菌游动孢子的游动性，如蛋[j胨，牛肉膏，含土壤浸汁的磷酸盐缓冲液，脱脂牛奶等。各种动孢溶液对不同的菌影响不同，Suzuki等在使用脱脂牛奶作为动孢溶液时发现不同的菌对脱脂牛奶的浓度、pH、处理时的温度、离心时的速度及时间有不同的要求。另外，使用高压灭菌后的脱脂牛奶比使用未灭菌的脱脂牛奶所获得的游动孢子数少，这可能因刺激孢子游动性的物质对高温高压敏感所致l4]。 1．1 选择性分离鱼孢菌 Suzuki等曾以鱼孢菌作为他们筛选生物活性物质的目标菌，对采自28个国家的466份土样进行了分离，从 2l份土样中分离到了鱼孢菌，发现鱼孢菌广泛分布于亚洲，欧洲，大洋洲，南美洲和北美洲。他们所使用的高选择性分离方法是l4j：200mg土样自然风干一80℃干热处理60min冷却，加 2mL 0．1％脱脂牛奶 (溶于 lOmmol／[ MOPS，pH 8．0)-+27cC温育 60rain,不时摇动以释放游动孢子一1，000×g室温离心 l0min一取上清液梯度稀释后涂布 HVG平板 (0．05％腐殖酸，2mmol／L CaCI ，0．7％胞外多糖胶)，27℃培养 21～28d。HVG培养基是在 HVA培养基的基础上改进的，与 HVA不同的是HVG含有 CaC1，并以胞外多糖胶代替琼脂。加入适量的 CaC1 不仅使胞外多糖胶得以凝固，而且比加入 MgSO 和 MgCI 更有利于某些放线菌的气生菌丝生长和孢子形成 。1．2 选择性分离游动单孢菌 玫瑰色游动单孢菌能产生孢囊霉素，这种含硫的抗生素能通过抑制芽孢杆菌等革兰氏阳性菌的蛋白合成而影响其生K。对游动单孢菌的高选择性分离程序是_6j：500mg土样 自然风下一l00℃干热处理60min 冷却，加入 2mL灭菌的 0．1％脱脂牛奶 (溶于 5mmol／L CHES，pH 9．0) 32℃温育90rain，不时摇动以释放游动孢子一1，000×g，室温离心 l0min一再于32 温育60rain一取上清液梯度稀释后涂布于 HSG平板 (含三甲氧苄二氨嘧啶 20mg／L，萘啶酸 lOmg／L，依诺沙星 20rng／L，氨苄青霉素钠 2mg／L，放线酬 50mg／L，制霉菌素50 mg／L)，35℃培养 l4～21d。用这种方法对 1，200份土样进行分离时，从 137份土样中分离到246株游动单孢菌。并发现委内瑞拉游动单孢菌广泛存在于从热带到温带的土壤中，但在土壤中的密度很低。HSG培养基 组成：0．05％ 腐质 酸，3mmol／L CaC12，0．000l％ FeSO4•7H2 O，0．0001％ MnC12‘4H2O，0．0001％ ZnSO4•7H2O，0．0001％ NiSO4•6H2O，5mmol／L CHES，0．7％胞外多糖胶 ，pH9．0。 1．3 选择性分离游动双孢菌 对游动双孢菌 (Planobispora)的高选择性分离程序是 ：500mg土样 自然风干---~90％干热处理 60min一冷却，加人 2mL 0．1％脱脂牛奶 ，0．01％Tween80，lOOmg／L三甲氧苄二氨嘧啶，lOOmg／L萘啶酸 (溶于5mmol／I CHES,pH 9．0)---~35。【=温育60min，不时摇动以释放游动孢子一1，000×g，室温离心 l0min一 取上清液梯度稀释后涂布 HSG平板 (含三甲氧苄二氨嘧啶 50mg／L，萘啶酸 50mg／L，依诺沙星20mg／L，氨苄青霉素钠 2m L，链霉素 lm L，放线酮 50mg／L，制霉菌素 50 me,／I ，pH9．0)，32oC培养 l4～21d。利用这种方法，对采 自世界各地的 1，467份土样进行的分离中，从5l份土样中分离到 l】9株游动双孢菌，88％的游动双孢菌分离于pH7．0～7．9的土样,并发现游动双孢菌只出现在热带和亚热带的土样中。 2 再水化一离心法 (rehydration-centrifugation) 具游动孢子的放线菌能在干燥时形成孢子或孢子囊，而当再次湿润时释放出活跃的孢子。游动孢子会受到某些物质的吸引，停留下来再次繁殖。对游动孢子的分离方法很多，如使用头发或花粉为诱饵的捕集法；以毛细管来进行的化学趋化法等。这些方法虽然也能分离到某些稀有放线菌，但要么费时费力，要么对设备和操作人员有特殊要求。最近，Hayakawa等人在 Makkar和 Cross的再水化法 基础． 发明了再水化一离心法_9 J，分离稀有放线菌，效果显著。操作具体程序是：取 500mg风干磨细土壤于锥形瓶中一用 50mL含 10％土壤提取液的10mmol／I 磷酸盐缓冲液轻轻润洗一铝箔覆盖，30。【=温育 90min_÷取 8mL润洗液，1，500×g，室温离心20rnjn一静置 30min~0．2mL涂布 HV琼脂 (含三甲氧苄二氨嘧啶20mg／L，萘啶酸 10mg／L，放线酮 50mg／L)。分离平板的总菌落数随土样而不同，有 37％ ～86％是具游动孢子的稀有放线菌，其中以游动放线菌和指孢囊菌为主。在不同 样品中也能分离到放线动孢菌，短链游动菌和动孢囊菌。上述方法经 Otoguro等人I m 改进后可高选择性分离束丝放线菌 (Actinosynnema)。风干搅碎的样品置研钵中按 10：1(w／w)的量加人 CaCO 粉末，混匀一铺于玻璃纤维膜上，加无菌水使样品湿度达 20％ (w／w)一26。【=培养 l4d_÷样品室温风干至恒重，置于平皿，加 50mL含 10％土壤提取液的 10mmoL／L磷酸盐缓冲液 (pH7．0)一 30。【=浸泡 2h一取 8mI 上述溶液 1，500×g，室温离心20rnjn一静置 30min一取上清涂布 HV琼脂 (含弗氏霉素40mg／L，卡那霉素 40mg／L，三甲氧苄二氨嘧啶 20mg／L，萘啶酸 10mg／L)，30。【=培养 2～3周。Otoguro等人用上述方法对 39份样品进行分离，其中l7份样品分离到束丝放线菌，其检出率占总菌落数的4％ 一86％。对任意选取的29株束丝放线菌进行的抗菌试验发现其中28株具有抗菌活性。HVA培养基 (1L)组成：腐殖酸 0．1g，CaCO3 0．02g，Na2HPO4 0．5g，MgSO4- 7H20 0．5g，KC1 1．7g，FeSO4•7H20 0．01g，核黄素0．5mg，硫胺素0．5mg，维生素B60．5mg，烟酸 0．5mg，肌醇 0．5mg，泛 酸 0．5mg，生物 素 0．25mg，对一氨基苯 甲酸0．5mg，琼脂 18g，pH7．2。 3 极高频辐射法 (extremely high frequency radiation) 应用极高频辐射法 (EHF)分离稀有放线菌的机理在于 EHF能抑制一些原核生物，藻类和单细胞微生物的生长，促进某些异养和光合微生物的生长及休眠菌株的复苏。所以采用极高频辐射 EHF法可以选择性地分离那些能耐受 EHF甚至受到 EHF激活的菌株。 具体过程是… ：取 100mg磨碎混匀的土样悬浮于 lOmL无菌水中，用频率为 1kHz的 EHF照射盛有土壤悬液的试管或平皿底部 (所使用的 EHF无热效应)。处理方式有两种：一种是以5．6mm或 7．1mm单一波长处理；另一种足以3．8mm～5．8mm或 8mm ～11．5mm波长连续处理。处理后州种土样都涂布于 Gauze 2琼脂 (含萘啶酸 10 ms／L，制霉菌素 50 ms／L)。结果显示，以单一波长5．6mm或7．I mm处理不能选择性分离到稀有放线菌。而以 3．8mm～5．8mm和8ram～11．5mm波长连续处理后，稀有放线菌的比例从原来的4．1％ 分别升至8．4％和30．6％。其中马杜拉菌，小四孢菌和野野村荫的绝对数量大为提高， 同时还能分离到那些普通方法无法分离到的菌株，如拟无枝酸芮和拟诺 氏菌。并日,分离物中具抗菌活性菌株分别增加了 13％和20％。在此基础上 Li等人 将极高频辐射法与连续分析相结合，能分离到单独使用这两种方法所不能分离到的稀有放线菌，如珊瑚状放线菌 、原小孢菌、游动放线菌和拟孢囊菌，同时，具有抗菌活性的菌株数量增加了10％ ～20％。具体程序是：加无菌水使土样湿度达 30％ (w／w)一撒在普通琼脂培养基上一+第0，7，14，30，45d分别取样进行 4．6ram～5．8ram和 8mm～1 1．5mm两种波段的 EHF’处理(在取样前 样始终保持30％的湿度)_÷涂 于土壤浸汁琼脂即可 (含 1mL／L维生素 溶液：10rag泛酸钙，10mg尼克酸，1mg硫胺素以及微晕的生物素共同溶于 20mL水；10mg／L荣啶酸；50mg／L制霉菌素)。 4 噬菌体定向分离法 (bacteriophage) 传统的分离方法由于对土样的微生物多样性等基本情况了解较少，加之放线菌生长缓慢，于是可能浪费数月的时问去分离土样中并不存在的菌株，而当目标菌又是稀有放线菌时更是如此。基于这 •原因，Esther等人… 设计了一种以细菌噬菌体作为指示物对环境样品中的野野村菌 (Nonomuria)进行快速筛选和分离的新方法。首先确定土样中是否含有能感染目标菌的噬菌体。具体步骤如下：3g土样悬浮于 100mL PYCa液体中一28℃，250r／rain，培养 24h一培养液3，O00g离心20min一上清液经0．45 m滤膜过滤一取5 T 滤液接种于野野村菌菌苔上一28℃培养48h以上一将含有噬菌斑的琼脂切下，用5mL PYCa洗涤一洗液经0．45Ixm滤膜过滤一点接滤液于长有野野村茼菌苔的琼脂上以确定噬菌体是台可以再牛。对能产生噬菌斑的土样，采用常规的选择性分离方法对 目标菌进行分离。结果， 放线菌l1l 20％为野野村菌。可见其并不是我们以前所认为的那样 “稀有”。同时，我们也可以将适量的只对一种或儿种链霉菌有裂解作用的噬荫体加入土样中来减少非目标菌的数 量。 5 蔗糖梯度离心法 (sucrose-gradient centrifugation) 由于土壤中营养贫乏，放线菌大部分以孢子形式存在，网此可以利用孢子的不同特性对不同的放线菌进行选择性分离。Karwowski 等人曾根据放线菌孢子浮力密度的差异，利用氯化铯密度梯度超速离心有效地从土壤中分离小单孢菌。最近，Yamamura 等人m 根据这一特性，运用蔗糖梯度离心选择性地分离诺卡氏菌，也取得了成功。其方法是：在离心管中从上到下设置各 lmL的 10％、20％、30％、40％ 、50％ (w／v)的蔗糖梯度。将用无菌水稀释为 10。土壤悬液 1mL加入到离心管上层，240×g， 室温离心 30rain。离心后把每层蔗糖取出稀释后涂布 0．2mL于 HV琼脂 (含萘啶酸10mg／L，放线酮 50mg／L，金霉素 10mg／L)。结果，大部分诺卡氏菌 (Nocardia)的孢子出现在 20％的蔗糖层中，小单孢菌可以在20％和 30％蔗糖层发现，但数量较少。游动放线菌等放线菌的游动丝状孢子只能在 10％蔗糖层出现。用这种方法对 l4份土样进行分离时，诺卡氏菌类群的检出率占总菌落数的5％ ～89％，而且 7l％的菌有抗菌活性。 6 结语 不断涌现出的新型稀有放线菌分离方法将成为天然产物筛选中的有用工具 ，也使我们了解到稀有放线菌事实上广泛存在于土壤等环境中，只是由于分离方法和手段的不完善才使得它们较少获得。当然，除了使用特殊方法对稀有放线菌进行分离外，扩大分离范围也是获取稀有放线菌的一个重要手段。比如作者所在单位从 80年代初开始温泉高温菌的研究，发现大量新的高温微生物资源。1991年，该所姜成林和徐丽华建 立了双孢放线菌新属 (Actinobispora)。近几年，该所还从新疆 、青海样品中发现嗜盐放线菌新属一个、嗜冷链霉菌新种一个、嗜盐放线菌新种 6个、嗜碱放线菌新种 4个。这些材料为我们的天然产物筛选奠定了坚实的基础。在寻找下一代化学治疗剂和新的生物活性物质的过程中，放线菌特别足稀有放线菌仍然是重要的目标菌。目前，已有超过 120种抗生素由游动放线菌产生，250多种抗生素是由马杜拉放线菌产生，到 1998年共发现有 32种生物活性物质来源于链孢囊菌，这些化合物都具有广泛的化学多样性，使得这些菌成为工业开发的重点对象。
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放线菌作为生物活性物质的主要产生菌早已成为人们研究的焦点。然而随着放线菌分离和分类研究的不断深入，大量常见菌株已被反复研究，因此从中发现新化合物的几率逐渐降低。由于新物种具有产生新的生物活性物质的潜力，人们开始使用新的方法在尽可能广泛的范围内寻找新的物种，特别是那些用常规方法很少分离到的稀有放线菌 (rare actinornycetes)…。2O世纪 50年代以来人们从稀有放线菌中发现了大量有价值的抗生素，如小单孢菌产生的庆大霉素，诺卡氏菌产生的利福霉素，马杜拉放线菌产生的马杜拉霉素和洋红霉素，糖多孢菌产生的红霉素，游动放线菌产生的游壁菌素，拟无枝酸菌产生的万古霉素等等。这些事实表明稀有放线菌也具有产生新抗生素的巨大潜力ll,21。分离这些稀有放线菌，不仅可以减少对产生已知生物活性物质菌株的重复分离，还可扩展放线菌次生代谢产物的化学多样性。 由于稀有放线菌对生长环境的特殊要求，难以用常规手段分离获得 ，所以要根椐不同类群的特性设计针对这些特定种属的选择性分离方法。近年来，国内外学者在对国家自然科学基金资助项目,云南省自然科学基金重点项目.稀有放线菌选择性分离的研究方面取得了较大进展,同时也用这些选择性分离方法分离到不少稀有放线菌，并显著提高了具有医用前景的生物活性物质的发现机率。此外，这些分离方法的使用也有助于同答这样一个问题 ：稀有放线菌很少被分离到是因为它们在环境中数量稀少，还是仅仅因为它们难以被分离和培养。本文就以上情况介绍了近年来发展起来的几种高选择性分离稀有放线菌的有效方法。 1 胞外多糖胶 (gellan gum)和动孢溶液 (flooding solution)相结合的分离方法 Gellan gum是由Pseudomonas elodea产生的胞外多糖，过去常用来作为植物组织培养的凝固剂，能促进植物生长。Suzuki等人 首先将其用于稀有放线菌的分离，并发现胞外多糖胶能促进很多放线菌的气生菌丝生长和孢子形成.很多物质都能增加放线菌游动孢子的游动性，如蛋[j胨，牛肉膏，含土壤浸汁的磷酸盐缓冲液，脱脂牛奶等。各种动孢溶液对不同的菌影响不同，Suzuki等在使用脱脂牛奶作为动孢溶液时发现不同的菌对脱脂牛奶的浓度、pH、处理时的温度、离心时的速度及时间有不同的要求。另外，使用高压灭菌后的脱脂牛奶比使用未灭菌的脱脂牛奶所获得的游动孢子数少，这可能因刺激孢子游动性的物质对高温高压敏感所致l4]。 1．1 选择性分离鱼孢菌 Suzuki等曾以鱼孢菌作为他们筛选生物活性物质的目标菌，对采自28个国家的466份土样进行了分离，从 2l份土样中分离到了鱼孢菌，发现鱼孢菌广泛分布于亚洲，欧洲，大洋洲，南美洲和北美洲。他们所使用的高选择性分离方法是l4j：200mg土样自然风干一80℃干热处理60min冷却，加 2mL 0．1％脱脂牛奶 (溶于 lOmmol／[ MOPS，pH 8．0)-+27cC温育 60rain,不时摇动以释放游动孢子一1，000×g室温离心 l0min一取上清液梯度稀释后涂布 HVG平板 (0．05％腐殖酸，2mmol／L CaCI ，0．7％胞外多糖胶)，27℃培养 21～28d。HVG培养基是在 HVA培养基的基础上改进的，与 HVA不同的是HVG含有 CaC1，并以胞外多糖胶代替琼脂。加入适量的 CaC1 不仅使胞外多糖胶得以凝固，而且比加入 MgSO 和 MgCI 更有利于某些放线菌的气生菌丝生长和孢子形成 。1．2 选择性分离游动单孢菌 玫瑰色游动单孢菌能产生孢囊霉素，这种含硫的抗生素能通过抑制芽孢杆菌等革兰氏阳性菌的蛋白合成而影响其生K。对游动单孢菌的高选择性分离程序是_6j：500mg土样 自然风下一l00℃干热处理60min 冷却，加入 2mL灭菌的 0．1％脱脂牛奶 (溶于 5mmol／L CHES，pH 9．0) 32℃温育90rain，不时摇动以释放游动孢子一1，000×g，室温离心 l0min一再于32 温育60rain一取上清液梯度稀释后涂布于 HSG平板 (含三甲氧苄二氨嘧啶 20mg／L，萘啶酸 lOmg／L，依诺沙星 20rng／L，氨苄青霉素钠 2mg／L，放线酬 50mg／L，制霉菌素50 mg／L)，35℃培养 l4～21d。用这种方法对 1，200份土样进行分离时，从 137份土样中分离到246株游动单孢菌。并发现委内瑞拉游动单孢菌广泛存在于从热带到温带的土壤中，但在土壤中的密度很低。HSG培养基 组成：0．05％ 腐质 酸，3mmol／L CaC12，0．000l％ FeSO4•7H2 O，0．0001％ MnC12‘4H2O，0．0001％ ZnSO4•7H2O，0．0001％ NiSO4•6H2O，5mmol／L CHES，0．7％胞外多糖胶 ，pH9．0。 1．3 选择性分离游动双孢菌 对游动双孢菌 (Planobispora)的高选择性分离程序是 ：500mg土样 自然风干---~90％干热处理 60min一冷却，加人 2mL 0．1％脱脂牛奶 ，0．01％Tween80，lOOmg／L三甲氧苄二氨嘧啶，lOOmg／L萘啶酸 (溶于5mmol／I CHES,pH 9．0)---~35。【=温育60min，不时摇动以释放游动孢子一1，000×g，室温离心 l0min一 取上清液梯度稀释后涂布 HSG平板 (含三甲氧苄二氨嘧啶 50mg／L，萘啶酸 50mg／L，依诺沙星20mg／L，氨苄青霉素钠 2m L，链霉素 lm L，放线酮 50mg／L，制霉菌素 50 me,／I ，pH9．0)，32oC培养 l4～21d。利用这种方法，对采 自世界各地的 1，467份土样进行的分离中，从5l份土样中分离到 l】9株游动双孢菌，88％的游动双孢菌分离于pH7．0～7．9的土样,并发现游动双孢菌只出现在热带和亚热带的土样中。 2 再水化一离心法 (rehydration-centrifugation) 具游动孢子的放线菌能在干燥时形成孢子或孢子囊，而当再次湿润时释放出活跃的孢子。游动孢子会受到某些物质的吸引，停留下来再次繁殖。对游动孢子的分离方法很多，如使用头发或花粉为诱饵的捕集法；以毛细管来进行的化学趋化法等。这些方法虽然也能分离到某些稀有放线菌，但要么费时费力，要么对设备和操作人员有特殊要求。最近，Hayakawa等人在 Makkar和 Cross的再水化法 基础． 发明了再水化一离心法_9 J，分离稀有放线菌，效果显著。操作具体程序是：取 500mg风干磨细土壤于锥形瓶中一用 50mL含 10％土壤提取液的10mmol／I 磷酸盐缓冲液轻轻润洗一铝箔覆盖，30。【=温育 90min_÷取 8mL润洗液，1，500×g，室温离心20rnjn一静置 30min~0．2mL涂布 HV琼脂 (含三甲氧苄二氨嘧啶20mg／L，萘啶酸 10mg／L，放线酮 50mg／L)。分离平板的总菌落数随土样而不同，有 37％ ～86％是具游动孢子的稀有放线菌，其中以游动放线菌和指孢囊菌为主。在不同 样品中也能分离到放线动孢菌，短链游动菌和动孢囊菌。上述方法经 Otoguro等人I m 改进后可高选择性分离束丝放线菌 (Actinosynnema)。风干搅碎的样品置研钵中按 10：1(w／w)的量加人 CaCO 粉末，混匀一铺于玻璃纤维膜上，加无菌水使样品湿度达 20％ (w／w)一26。【=培养 l4d_÷样品室温风干至恒重，置于平皿，加 50mL含 10％土壤提取液的 10mmoL／L磷酸盐缓冲液 (pH7．0)一 30。【=浸泡 2h一取 8mI 上述溶液 1，500×g，室温离心20rnjn一静置 30min一取上清涂布 HV琼脂 (含弗氏霉素40mg／L，卡那霉素 40mg／L，三甲氧苄二氨嘧啶 20mg／L，萘啶酸 10mg／L)，30。【=培养 2～3周。Otoguro等人用上述方法对 39份样品进行分离，其中l7份样品分离到束丝放线菌，其检出率占总菌落数的4％ 一86％。对任意选取的29株束丝放线菌进行的抗菌试验发现其中28株具有抗菌活性。HVA培养基 (1L)组成：腐殖酸 0．1g，CaCO3 0．02g，Na2HPO4 0．5g，MgSO4- 7H20 0．5g，KC1 1．7g，FeSO4•7H20 0．01g，核黄素0．5mg，硫胺素0．5mg，维生素B60．5mg，烟酸 0．5mg，肌醇 0．5mg，泛 酸 0．5mg，生物 素 0．25mg，对一氨基苯 甲酸0．5mg，琼脂 18g，pH7．2。 3 极高频辐射法 (extremely high frequency radiation) 应用极高频辐射法 (EHF)分离稀有放线菌的机理在于 EHF能抑制一些原核生物，藻类和单细胞微生物的生长，促进某些异养和光合微生物的生长及休眠菌株的复苏。所以采用极高频辐射 EHF法可以选择性地分离那些能耐受 EHF甚至受到 EHF激活的菌株。 具体过程是… ：取 100mg磨碎混匀的土样悬浮于 lOmL无菌水中，用频率为 1kHz的 EHF照射盛有土壤悬液的试管或平皿底部 (所使用的 EHF无热效应)。处理方式有两种：一种是以5．6mm或 7．1mm单一波长处理；另一种足以3．8mm～5．8mm或 8mm ～11．5mm波长连续处理。处理后州种土样都涂布于 Gauze 2琼脂 (含萘啶酸 10 ms／L，制霉菌素 50 ms／L)。结果显示，以单一波长5．6mm或7．I mm处理不能选择性分离到稀有放线菌。而以 3．8mm～5．8mm和8ram～11．5mm波长连续处理后，稀有放线菌的比例从原来的4．1％ 分别升至8．4％和30．6％。其中马杜拉菌，小四孢菌和野野村荫的绝对数量大为提高， 同时还能分离到那些普通方法无法分离到的菌株，如拟无枝酸芮和拟诺 氏菌。并日,分离物中具抗菌活性菌株分别增加了 13％和20％。在此基础上 Li等人 将极高频辐射法与连续分析相结合，能分离到单独使用这两种方法所不能分离到的稀有放线菌，如珊瑚状放线菌 、原小孢菌、游动放线菌和拟孢囊菌，同时，具有抗菌活性的菌株数量增加了10％ ～20％。具体程序是：加无菌水使土样湿度达 30％ (w／w)一撒在普通琼脂培养基上一+第0，7，14，30，45d分别取样进行 4．6ram～5．8ram和 8mm～1 1．5mm两种波段的 EHF’处理(在取样前 样始终保持30％的湿度)_÷涂 于土壤浸汁琼脂即可 (含 1mL／L维生素 溶液：10rag泛酸钙，10mg尼克酸，1mg硫胺素以及微晕的生物素共同溶于 20mL水；10mg／L荣啶酸；50mg／L制霉菌素)。 4 噬菌体定向分离法 (bacteriophage) 传统的分离方法由于对土样的微生物多样性等基本情况了解较少，加之放线菌生长缓慢，于是可能浪费数月的时问去分离土样中并不存在的菌株，而当目标菌又是稀有放线菌时更是如此。基于这 •原因，Esther等人… 设计了一种以细菌噬菌体作为指示物对环境样品中的野野村菌 (Nonomuria)进行快速筛选和分离的新方法。首先确定土样中是否含有能感染目标菌的噬菌体。具体步骤如下：3g土样悬浮于 100mL PYCa液体中一28℃，250r／rain，培养 24h一培养液3，O00g离心20min一上清液经0．45 m滤膜过滤一取5 T 滤液接种于野野村菌菌苔上一28℃培养48h以上一将含有噬菌斑的琼脂切下，用5mL PYCa洗涤一洗液经0．45Ixm滤膜过滤一点接滤液于长有野野村茼菌苔的琼脂上以确定噬菌体是台可以再牛。对能产生噬菌斑的土样，采用常规的选择性分离方法对 目标菌进行分离。结果， 放线菌l1l 20％为野野村菌。可见其并不是我们以前所认为的那样 “稀有”。同时，我们也可以将适量的只对一种或儿种链霉菌有裂解作用的噬荫体加入土样中来减少非目标菌的数 量。 5 蔗糖梯度离心法 (sucrose-gradient centrifugation) 由于土壤中营养贫乏，放线菌大部分以孢子形式存在，网此可以利用孢子的不同特性对不同的放线菌进行选择性分离。Karwowski 等人曾根据放线菌孢子浮力密度的差异，利用氯化铯密度梯度超速离心有效地从土壤中分离小单孢菌。最近，Yamamura 等人m 根据这一特性，运用蔗糖梯度离心选择性地分离诺卡氏菌，也取得了成功。其方法是：在离心管中从上到下设置各 lmL的 10％、20％、30％、40％ 、50％ (w／v)的蔗糖梯度。将用无菌水稀释为 10。土壤悬液 1mL加入到离心管上层，240×g， 室温离心 30rain。离心后把每层蔗糖取出稀释后涂布 0．2mL于 HV琼脂 (含萘啶酸10mg／L，放线酮 50mg／L，金霉素 10mg／L)。结果，大部分诺卡氏菌 (Nocardia)的孢子出现在 20％的蔗糖层中，小单孢菌可以在20％和 30％蔗糖层发现，但数量较少。游动放线菌等放线菌的游动丝状孢子只能在 10％蔗糖层出现。用这种方法对 l4份土样进行分离时，诺卡氏菌类群的检出率占总菌落数的5％ ～89％，而且 7l％的菌有抗菌活性。 6 结语 不断涌现出的新型稀有放线菌分离方法将成为天然产物筛选中的有用工具 ，也使我们了解到稀有放线菌事实上广泛存在于土壤等环境中，只是由于分离方法和手段的不完善才使得它们较少获得。当然，除了使用特殊方法对稀有放线菌进行分离外，扩大分离范围也是获取稀有放线菌的一个重要手段。比如作者所在单位从 80年代初开始温泉高温菌的研究，发现大量新的高温微生物资源。1991年，该所姜成林和徐丽华建 立了双孢放线菌新属 (Actinobispora)。近几年，该所还从新疆 、青海样品中发现嗜盐放线菌新属一个、嗜冷链霉菌新种一个、嗜盐放线菌新种 6个、嗜碱放线菌新种 4个。这些材料为我们的天然产物筛选奠定了坚实的基础。在寻找下一代化学治疗剂和新的生物活性物质的过程中，放线菌特别足稀有放线菌仍然是重要的目标菌。目前，已有超过 120种抗生素由游动放线菌产生，250多种抗生素是由马杜拉放线菌产生，到 1998年共发现有 32种生物活性物质来源于链孢囊菌，这些化合物都具有广泛的化学多样性，使得这些菌成为工业开发的重点对象。
在国内外期刊发表论文90多篇,2000年后发表论文70多篇：其中Sci论文4篇、核心期刊47篇、第一作者42篇、通讯作者10篇。主编（译）专著5部；参与编写、翻译出版专著8部。完成农业部“水稻病虫害网络专家诊断系统”病害部分内容。 1. 南方优质稻米生产技术：中鉴100和中香1号生产技术 黄发松主编、参编 中国农业出版社ISBN7 -80119-433-O/ 2002-062. 浙江效益农业百科全书：优质稻 参编 中国农业出版社ISBN7 -80119-433-O/ 2002-063. 水稻杂草防除—全球综合状况（原著：联合国粮农组织之粮农组织植物生产与保护论文集139） 参译（第11章） 中国农业科学技术出版社 2002-104. 优势农产品生产技术规范 (水稻病虫害综合防治技术) 参编 中国农业出版社 2004-025. 水稻病虫害诊断与防治原色图谱 傅强、黄世文主编 金盾出版社 2005-036. 农民增收百项关键技术丛书：优质水稻品种及栽培关键技术 参编 中国三峡出版社农业科教出版中心 2006-017. 超级稻栽培技术 黄世文副主编 金盾出版社 2006-128. 中国现代水稻 参编第13章4万字 金盾出版社 2007-019. 2009年中国水稻产业发展报告 参编 中国农业出版社 2009-0810. 水稻生产100问：水稻技术100问/现代农业产业技术一万个为什么 参编 中国农业出版社 2009-0311. 水稻病虫害及防治原色图册 傅强、黄世文、谢茂成主编 金盾出版社 2009-1112.水稻主要病虫害防控关键技术解析 黄世文、王玲、刘连盟主编 金盾出版社 2010-0413. 稻田浮萍：农业综合体系中多功能小型水生植物,原著：Ronald A. 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海洋生物来源药物先导化合物的研究进展【摘要】海洋生物中活性物质丰富，本篇文章对国内外近3年来从海洋生物中分离提取到的萜类化合物以及糖苷类化合物进行了归纳，并对其研究趋势进行了展望。这些新发现的萜类化合物广泛分布于海藻、珊瑚、海绵以及一些海洋真菌等海洋生物中，主要以单萜、倍半萜、二萜、三萜结构型式存在；而糖苷类化合物在海藻、海绵、海参、海星等海洋生物中发现大部分以糖苷脂、甾体糖苷、萜类糖苷型式存在。【关键词】海洋生物萜类化合物糖苷类生物活性【Abstract】.【Keywords】Marineorganism;terpenoid;glycoside;bioactivity海洋是生命之源，由于海洋环境的特殊性，具有高压、低营养、低温（特别是深海）、无光照以及局部高温、高盐等生命极限环境，海洋生物适应了海洋独特的生活环境，必然造就了海洋生物具有独特的代谢途径和遗传背景，必定也会有新的、在许多陆地生物中未曾发现过的新结构类型和特殊生物活性的化合物。萜类物质是一类天然的烃类物质，其分子中具有异戊二烯(C5H8)的基本单位。故凡由异戊二烯衍生的化合物，其分子式符合(C5H8)n通式的均称萜类化合物(terpenoids)或异戊二烯类化合物（isopenoids）。但有些情况下，在分子合成过程中由于正碳离子引起的甲基迁移或碳架重排以及烷基化、降解等原因，分子的某一片断会不完全遵照异戊二烯规律产生出一些变形碳架，它们仍属于萜类化合物。海洋生物中萜类化合物主要以单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜为主，三萜和四萜种类和数量都较少，且大部分以糖苷形式存在。萜类化合物是海洋生物活性物质的重要组成部分，广泛分布于海藻、珊瑚、海绵、软体动物等海洋生物中，具有细胞毒性、抗肿瘤活性、杀菌止痛等活性作用。糖苷的分类有多种方法，按照在生物体内是原生的还是次生的可将其分为原生糖苷和次生糖苷（从原生糖苷中脱掉一个以上的苷称为次生苷或次级苷）；按照糖苷中含有的单糖基的个数可将糖苷分为单糖苷、双糖苷、三糖苷等；按照糖苷的某些特殊化学性质或生理活性可将糖苷分为皂苷、强心苷等；按照苷元化学结构类型可分为黄酮糖苷、蒽醌糖苷、生物碱糖苷、三萜糖苷等，海洋类的糖苷大部分是按照此特点分类的，主要包括鞘脂类糖苷、甾体糖苷、萜类糖苷和大环内酯糖苷等，在很多海洋生物如海藻、珊瑚、海参、海绵等中均发现有糖苷类化合物存在。已有的研究表明海洋糖苷类成分大都具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、增强免疫力等生物活性。抗白血病和艾氏癌药物阿糖胞苷Ara-C(D-arabinosylcytosine)1、抗病毒药物的Ara-A2以及Ara-C的N4-C16-19饱和脂肪酰基化衍生物3是海洋糖苷类药物成功开发的典范〔1〕。本篇文章对国内外自2005年来从海洋生物中分离提取到的萜类化合物以及糖苷类化合物进行了总结。1萜类化合物单萜2005年等人〔2〕对从红藻Plo
放线菌作为生物活性物质的主要产生菌早已成为人们研究的焦点。然而随着放线菌分离和分类研究的不断深入，大量常见菌株已被反复研究，因此从中发现新化合物的几率逐渐降低。由于新物种具有产生新的生物活性物质的潜力，人们开始使用新的方法在尽可能广泛的范围内寻找新的物种，特别是那些用常规方法很少分离到的稀有放线菌 (rare actinornycetes)…。2O世纪 50年代以来人们从稀有放线菌中发现了大量有价值的抗生素，如小单孢菌产生的庆大霉素，诺卡氏菌产生的利福霉素，马杜拉放线菌产生的马杜拉霉素和洋红霉素，糖多孢菌产生的红霉素，游动放线菌产生的游壁菌素，拟无枝酸菌产生的万古霉素等等。这些事实表明稀有放线菌也具有产生新抗生素的巨大潜力ll,21。分离这些稀有放线菌，不仅可以减少对产生已知生物活性物质菌株的重复分离，还可扩展放线菌次生代谢产物的化学多样性。 由于稀有放线菌对生长环境的特殊要求，难以用常规手段分离获得 ，所以要根椐不同类群的特性设计针对这些特定种属的选择性分离方法。近年来，国内外学者在对国家自然科学基金资助项目,云南省自然科学基金重点项目.稀有放线菌选择性分离的研究方面取得了较大进展,同时也用这些选择性分离方法分离到不少稀有放线菌，并显著提高了具有医用前景的生物活性物质的发现机率。此外，这些分离方法的使用也有助于同答这样一个问题 ：稀有放线菌很少被分离到是因为它们在环境中数量稀少，还是仅仅因为它们难以被分离和培养。本文就以上情况介绍了近年来发展起来的几种高选择性分离稀有放线菌的有效方法。 1 胞外多糖胶 (gellan gum)和动孢溶液 (flooding solution)相结合的分离方法 Gellan gum是由Pseudomonas elodea产生的胞外多糖，过去常用来作为植物组织培养的凝固剂，能促进植物生长。Suzuki等人 首先将其用于稀有放线菌的分离，并发现胞外多糖胶能促进很多放线菌的气生菌丝生长和孢子形成.很多物质都能增加放线菌游动孢子的游动性，如蛋[j胨，牛肉膏，含土壤浸汁的磷酸盐缓冲液，脱脂牛奶等。各种动孢溶液对不同的菌影响不同，Suzuki等在使用脱脂牛奶作为动孢溶液时发现不同的菌对脱脂牛奶的浓度、pH、处理时的温度、离心时的速度及时间有不同的要求。另外，使用高压灭菌后的脱脂牛奶比使用未灭菌的脱脂牛奶所获得的游动孢子数少，这可能因刺激孢子游动性的物质对高温高压敏感所致l4]。 1．1 选择性分离鱼孢菌 Suzuki等曾以鱼孢菌作为他们筛选生物活性物质的目标菌，对采自28个国家的466份土样进行了分离，从 2l份土样中分离到了鱼孢菌，发现鱼孢菌广泛分布于亚洲，欧洲，大洋洲，南美洲和北美洲。他们所使用的高选择性分离方法是l4j：200mg土样自然风干一80℃干热处理60min冷却，加 2mL 0．1％脱脂牛奶 (溶于 lOmmol／[ MOPS，pH 8．0)-+27cC温育 60rain,不时摇动以释放游动孢子一1，000×g室温离心 l0min一取上清液梯度稀释后涂布 HVG平板 (0．05％腐殖酸，2mmol／L CaCI ，0．7％胞外多糖胶)，27℃培养 21～28d。HVG培养基是在 HVA培养基的基础上改进的，与 HVA不同的是HVG含有 CaC1，并以胞外多糖胶代替琼脂。加入适量的 CaC1 不仅使胞外多糖胶得以凝固，而且比加入 MgSO 和 MgCI 更有利于某些放线菌的气生菌丝生长和孢子形成 。1．2 选择性分离游动单孢菌 玫瑰色游动单孢菌能产生孢囊霉素，这种含硫的抗生素能通过抑制芽孢杆菌等革兰氏阳性菌的蛋白合成而影响其生K。对游动单孢菌的高选择性分离程序是_6j：500mg土样 自然风下一l00℃干热处理60min 冷却，加入 2mL灭菌的 0．1％脱脂牛奶 (溶于 5mmol／L CHES，pH 9．0) 32℃温育90rain，不时摇动以释放游动孢子一1，000×g，室温离心 l0min一再于32 温育60rain一取上清液梯度稀释后涂布于 HSG平板 (含三甲氧苄二氨嘧啶 20mg／L，萘啶酸 lOmg／L，依诺沙星 20rng／L，氨苄青霉素钠 2mg／L，放线酬 50mg／L，制霉菌素50 mg／L)，35℃培养 l4～21d。用这种方法对 1，200份土样进行分离时，从 137份土样中分离到246株游动单孢菌。并发现委内瑞拉游动单孢菌广泛存在于从热带到温带的土壤中，但在土壤中的密度很低。HSG培养基 组成：0．05％ 腐质 酸，3mmol／L CaC12，0．000l％ FeSO4•7H2 O，0．0001％ MnC12‘4H2O，0．0001％ ZnSO4•7H2O，0．0001％ NiSO4•6H2O，5mmol／L CHES，0．7％胞外多糖胶 ，pH9．0。 1．3 选择性分离游动双孢菌 对游动双孢菌 (Planobispora)的高选择性分离程序是 ：500mg土样 自然风干---~90％干热处理 60min一冷却，加人 2mL 0．1％脱脂牛奶 ，0．01％Tween80，lOOmg／L三甲氧苄二氨嘧啶，lOOmg／L萘啶酸 (溶于5mmol／I CHES,pH 9．0)---~35。【=温育60min，不时摇动以释放游动孢子一1，000×g，室温离心 l0min一 取上清液梯度稀释后涂布 HSG平板 (含三甲氧苄二氨嘧啶 50mg／L，萘啶酸 50mg／L，依诺沙星20mg／L，氨苄青霉素钠 2m L，链霉素 lm L，放线酮 50mg／L，制霉菌素 50 me,／I ，pH9．0)，32oC培养 l4～21d。利用这种方法，对采 自世界各地的 1，467份土样进行的分离中，从5l份土样中分离到 l】9株游动双孢菌，88％的游动双孢菌分离于pH7．0～7．9的土样,并发现游动双孢菌只出现在热带和亚热带的土样中。 2 再水化一离心法 (rehydration-centrifugation) 具游动孢子的放线菌能在干燥时形成孢子或孢子囊，而当再次湿润时释放出活跃的孢子。游动孢子会受到某些物质的吸引，停留下来再次繁殖。对游动孢子的分离方法很多，如使用头发或花粉为诱饵的捕集法；以毛细管来进行的化学趋化法等。这些方法虽然也能分离到某些稀有放线菌，但要么费时费力，要么对设备和操作人员有特殊要求。最近，Hayakawa等人在 Makkar和 Cross的再水化法 基础． 发明了再水化一离心法_9 J，分离稀有放线菌，效果显著。操作具体程序是：取 500mg风干磨细土壤于锥形瓶中一用 50mL含 10％土壤提取液的10mmol／I 磷酸盐缓冲液轻轻润洗一铝箔覆盖，30。【=温育 90min_÷取 8mL润洗液，1，500×g，室温离心20rnjn一静置 30min~0．2mL涂布 HV琼脂 (含三甲氧苄二氨嘧啶20mg／L，萘啶酸 10mg／L，放线酮 50mg／L)。分离平板的总菌落数随土样而不同，有 37％ ～86％是具游动孢子的稀有放线菌，其中以游动放线菌和指孢囊菌为主。在不同 样品中也能分离到放线动孢菌，短链游动菌和动孢囊菌。上述方法经 Otoguro等人I m 改进后可高选择性分离束丝放线菌 (Actinosynnema)。风干搅碎的样品置研钵中按 10：1(w／w)的量加人 CaCO 粉末，混匀一铺于玻璃纤维膜上，加无菌水使样品湿度达 20％ (w／w)一26。【=培养 l4d_÷样品室温风干至恒重，置于平皿，加 50mL含 10％土壤提取液的 10mmoL／L磷酸盐缓冲液 (pH7．0)一 30。【=浸泡 2h一取 8mI 上述溶液 1，500×g，室温离心20rnjn一静置 30min一取上清涂布 HV琼脂 (含弗氏霉素40mg／L，卡那霉素 40mg／L，三甲氧苄二氨嘧啶 20mg／L，萘啶酸 10mg／L)，30。【=培养 2～3周。Otoguro等人用上述方法对 39份样品进行分离，其中l7份样品分离到束丝放线菌，其检出率占总菌落数的4％ 一86％。对任意选取的29株束丝放线菌进行的抗菌试验发现其中28株具有抗菌活性。HVA培养基 (1L)组成：腐殖酸 0．1g，CaCO3 0．02g，Na2HPO4 0．5g，MgSO4- 7H20 0．5g，KC1 1．7g，FeSO4•7H20 0．01g，核黄素0．5mg，硫胺素0．5mg，维生素B60．5mg，烟酸 0．5mg，肌醇 0．5mg，泛 酸 0．5mg，生物 素 0．25mg，对一氨基苯 甲酸0．5mg，琼脂 18g，pH7．2。 3 极高频辐射法 (extremely high frequency radiation) 应用极高频辐射法 (EHF)分离稀有放线菌的机理在于 EHF能抑制一些原核生物，藻类和单细胞微生物的生长，促进某些异养和光合微生物的生长及休眠菌株的复苏。所以采用极高频辐射 EHF法可以选择性地分离那些能耐受 EHF甚至受到 EHF激活的菌株。 具体过程是… ：取 100mg磨碎混匀的土样悬浮于 lOmL无菌水中，用频率为 1kHz的 EHF照射盛有土壤悬液的试管或平皿底部 (所使用的 EHF无热效应)。处理方式有两种：一种是以5．6mm或 7．1mm单一波长处理；另一种足以3．8mm～5．8mm或 8mm ～11．5mm波长连续处理。处理后州种土样都涂布于 Gauze 2琼脂 (含萘啶酸 10 ms／L，制霉菌素 50 ms／L)。结果显示，以单一波长5．6mm或7．I mm处理不能选择性分离到稀有放线菌。而以 3．8mm～5．8mm和8ram～11．5mm波长连续处理后，稀有放线菌的比例从原来的4．1％ 分别升至8．4％和30．6％。其中马杜拉菌，小四孢菌和野野村荫的绝对数量大为提高， 同时还能分离到那些普通方法无法分离到的菌株，如拟无枝酸芮和拟诺 氏菌。并日,分离物中具抗菌活性菌株分别增加了 13％和20％。在此基础上 Li等人 将极高频辐射法与连续分析相结合，能分离到单独使用这两种方法所不能分离到的稀有放线菌，如珊瑚状放线菌 、原小孢菌、游动放线菌和拟孢囊菌，同时，具有抗菌活性的菌株数量增加了10％ ～20％。具体程序是：加无菌水使土样湿度达 30％ (w／w)一撒在普通琼脂培养基上一+第0，7，14，30，45d分别取样进行 4．6ram～5．8ram和 8mm～1 1．5mm两种波段的 EHF’处理(在取样前 样始终保持30％的湿度)_÷涂 于土壤浸汁琼脂即可 (含 1mL／L维生素 溶液：10rag泛酸钙，10mg尼克酸，1mg硫胺素以及微晕的生物素共同溶于 20mL水；10mg／L荣啶酸；50mg／L制霉菌素)。 4 噬菌体定向分离法 (bacteriophage) 传统的分离方法由于对土样的微生物多样性等基本情况了解较少，加之放线菌生长缓慢，于是可能浪费数月的时问去分离土样中并不存在的菌株，而当目标菌又是稀有放线菌时更是如此。基于这 •原因，Esther等人… 设计了一种以细菌噬菌体作为指示物对环境样品中的野野村菌 (Nonomuria)进行快速筛选和分离的新方法。首先确定土样中是否含有能感染目标菌的噬菌体。具体步骤如下：3g土样悬浮于 100mL PYCa液体中一28℃，250r／rain，培养 24h一培养液3，O00g离心20min一上清液经0．45 m滤膜过滤一取5 T 滤液接种于野野村菌菌苔上一28℃培养48h以上一将含有噬菌斑的琼脂切下，用5mL PYCa洗涤一洗液经0．45Ixm滤膜过滤一点接滤液于长有野野村茼菌苔的琼脂上以确定噬菌体是台可以再牛。对能产生噬菌斑的土样，采用常规的选择性分离方法对 目标菌进行分离。结果， 放线菌l1l 20％为野野村菌。可见其并不是我们以前所认为的那样 “稀有”。同时，我们也可以将适量的只对一种或儿种链霉菌有裂解作用的噬荫体加入土样中来减少非目标菌的数 量。 5 蔗糖梯度离心法 (sucrose-gradient centrifugation) 由于土壤中营养贫乏，放线菌大部分以孢子形式存在，网此可以利用孢子的不同特性对不同的放线菌进行选择性分离。Karwowski 等人曾根据放线菌孢子浮力密度的差异，利用氯化铯密度梯度超速离心有效地从土壤中分离小单孢菌。最近，Yamamura 等人m 根据这一特性，运用蔗糖梯度离心选择性地分离诺卡氏菌，也取得了成功。其方法是：在离心管中从上到下设置各 lmL的 10％、20％、30％、40％ 、50％ (w／v)的蔗糖梯度。将用无菌水稀释为 10。土壤悬液 1mL加入到离心管上层，240×g， 室温离心 30rain。离心后把每层蔗糖取出稀释后涂布 0．2mL于 HV琼脂 (含萘啶酸10mg／L，放线酮 50mg／L，金霉素 10mg／L)。结果，大部分诺卡氏菌 (Nocardia)的孢子出现在 20％的蔗糖层中，小单孢菌可以在20％和 30％蔗糖层发现，但数量较少。游动放线菌等放线菌的游动丝状孢子只能在 10％蔗糖层出现。用这种方法对 l4份土样进行分离时，诺卡氏菌类群的检出率占总菌落数的5％ ～89％，而且 7l％的菌有抗菌活性。 6 结语 不断涌现出的新型稀有放线菌分离方法将成为天然产物筛选中的有用工具 ，也使我们了解到稀有放线菌事实上广泛存在于土壤等环境中，只是由于分离方法和手段的不完善才使得它们较少获得。当然，除了使用特殊方法对稀有放线菌进行分离外，扩大分离范围也是获取稀有放线菌的一个重要手段。比如作者所在单位从 80年代初开始温泉高温菌的研究，发现大量新的高温微生物资源。1991年，该所姜成林和徐丽华建 立了双孢放线菌新属 (Actinobispora)。近几年，该所还从新疆 、青海样品中发现嗜盐放线菌新属一个、嗜冷链霉菌新种一个、嗜盐放线菌新种 6个、嗜碱放线菌新种 4个。这些材料为我们的天然产物筛选奠定了坚实的基础。在寻找下一代化学治疗剂和新的生物活性物质的过程中，放线菌特别足稀有放线菌仍然是重要的目标菌。目前，已有超过 120种抗生素由游动放线菌产生，250多种抗生素是由马杜拉放线菌产生，到 1998年共发现有 32种生物活性物质来源于链孢囊菌，这些化合物都具有广泛的化学多样性，使得这些菌成为工业开发的重点对象。
分离放线菌用高氏1号培养基加10%的酚数滴以抑制细菌的生长。将高氏1号培养基熔化，冷却至50℃左右时，加入10%的酚数滴，然后到平板，并标记稀释倍数。将10克土样倒入盛有玻璃珠和90毫升无菌水的三角瓶中，震荡30分钟，制成悬浊液。再取一支1毫升无菌移液管，吸取毫升土悬液注入盛有毫升无菌水的试管中取另一支1毫升无菌移液管吹吸三次，吸取毫升注入另一盛有毫升无菌水的试管中，以此类推，稀释四次。接下来，取一支1毫升无菌移液管吸取不同浓度的悬液各毫升于相应的平板上，用无菌涂棒涂匀。将培养皿倒置于28℃恒温箱中培养3~4天即可转管 。
乌龟(Chinemys reevesii)是一种常见的爬行动物,也是一种著名的滋补品。现代中医药学研究表明,龟类有较大的药用价值,龟肉、龟甲、龟血、龟胆汁甚至龟尿都可以入药。 本文对巴西龟(Trachemys scripta)尿液中12种主要活性成分的含量进行了测定,并通过将不同的尿液样本作用于10种供试菌种的抑菌实验研究。研究结果表明:巴西龟尿液中总蛋白、尿酸等成分含量的平均值均高于人尿中的含量;而且不同的尿液样本中一些成分存在着一定的变化,例如尿酸的浓度范围在～μmol/L、总蛋白的浓度范围在～、三甲氧苄二氨基嘧啶的浓度范围在～;同时研究发现巴西龟的尿液具有一定的抑菌作用,特别是对一些常见鱼病的致病菌,例如:肠型点状气单胞菌(Aeromonas punctata fintertinalis)、荧光极毛杆菌(Pseudomonas fluorescens)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、苏伯利气单胞菌(Aeromonas sobria)、鲁克氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)、鱼害粘球菌(Myxococeus piscicola)等细菌具有良好的抑制作用,其尿液抑菌的最底抑菌浓度(MIC)为30%,通过对不同尿液样本中12种主要成分含量与对应尿液抑菌圈面积之间相关系数的计算,我们发现只有尿酸和三甲氧苄二氨基嘧啶两种成分与尿液抑菌效果的相关系数rr_()=,因此可以确定巴西龟尿液的抑菌作用效果与尿液中的两种物质即尿酸和三甲氧苄二氨基嘧啶的浓度变化存在着明显的正相关性,从而初步揭示巴西龟尿液的抑菌作用是上述两种成分作用的结果。 本论文是从实验室的角度开展巴西龟尿液主要成分分析及初步阐明巴西龟尿液的抑菌作用,通过前期的实验室研究工作为即将开展的在水产养殖中对家鱼的一些常见病、多发病的防治工作研究从理论上打下铺垫,同时为开展龟鱼混养以龟的尿液排泄物代替化学药物防治鱼病、减少渔业养殖上的农药施用和水体污染、丌展无公害生念养殖提供了科学依据和新的思路。 解剖冬眠及冬眠后禁食期间的乌龟，发现其腹腔内有一巨型储满尿液的膀胱泡．用荧光、紫外、全自动生化分析和液相色谱进一步分析冬眠乌龟体液和尿液中的生化成分，发现了一些与长寿密切相关的特点：1、具有独特的抗氧化特性：冬眠状态乌龟尿液在体外十几个小时内有抗氧化功效；冬眠乌龟尿液中脂过氧化物水平和老年色素类代谢垃圾物质水平都很低，2、冬眠乌龟尿液和血清中都含有多种有特殊功效的生物酶类和抗氧化物质：例如，血清中乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量特别高，分别达2321mol／L和4524mol／L；抗氧化剂尿酸在血清中浓度较低，而在尿液中浓度大大提高，3、与正常乌龟相比，冬眠状态乌龟尿液中游离氨基酸成分发生了较大的变化，这些结果对于乌龟的长寿和耐应激生理机制提供了一些初步的生化解释
论文陈述可以很好地组织和发展论点，并为读者提供关于论点的“指南”。
论文陈述包含以下内容：
1、陈述你对这个主题的主要观点
陈述观点时一定要表达一个主要思想，并陈述你的立场或看法。关于主题，需思考：
2、给出几个支持主要观点的理由
理由要写清楚，一定要用符合逻辑的事实和证据来支持这个理由。
3、给出一个与主要观点相反的观点
一个好的论文陈述要承认论点存在另一面。所以，同学可以在论文陈述中给出一个反论点。
论文陈述写作示例：
1、首先，从一个问题开始。例如：互联网对教育有正面或负面的影响吗?
2、其次，表明你对这个问题的立场。例如：互联网对教育的正面影响大于负面影响。
3、最后，发展你的答案。例如：互联网使用的负面影响被其对教育的诸多好处所抵消：互联网有助于学生和老师更容易地获取信息、接触不同的观点，以及这是一个灵活的学习环境。
1. 响应曲面法优化黄参酸奶生产工艺.食品科学（CSCD核心库期刊），2011,32（12）：39-44（第一作者）2. 荷叶离褶伞菌丝体深层发酵及胞内外多糖含量的变化.中国酿造（CSCD核心库期刊），2011，230（5）：56-59（第一作者）3. 荷叶离褶伞子实体、菌丝体及发酵液蛋白质营养价值评价伤.菌物学报（CSCD核心库期刊），2010，29（4）：603-607（第三作者）4. 葡萄表面所得酵母的筛选及其鉴定.食品工业科技（CSCD核心库期刊），2010，31（6）：182-184（第二作者）5. 人参果酸奶制作工艺的研究.中国酿造（CSCD核心库期刊），2009，212（11）：167-169（第一作者）6.肉苁蓉多糖提取工艺及抑菌作用的研究.安徽农业科学（CSCD核心库期刊），2009，37（32）：15855-15856,15878（第一作者）7.极大螺旋藻酸奶加工工艺的研究.中国酿造（CSCD核心库期刊），2009，213（12）：155-158（第一作者）8.荷叶离褶伞子实体发酵液营养成分分析.食品科学（CSCD核心库期刊），2009，31（6）：155-157（第三作者）9.酿酒酵母菌的紫外诱变及其突变株的性能测定.中国酿造（CSCD核心库期刊），2009，211（10）：66-68（第二作者）10.荷叶离褶伞多糖的提取工艺及其抑菌作用的研究.中国食品工业，2009，(12)：51-53（第一作者）11.曼陀罗种子生物碱提取物抑菌活性的研究. 甘肃农业，2009，（5）：90--92（第一作者）12.”Ni2+“对大蒜根尖细胞有丝分裂的影响. 作物杂志（CSCD核心库期刊），2008，（1）：37-40（第一作者）13.黄花蒿不同溶剂提取液的抑菌作用研究，中国野生植物资源，2008，（3）：45-48（第一作者）通讯作者14.镉胁迫对红果龙葵幼苗生理生化的影响. 沈阳农业大学学报，2008，（2）：（第三作者）15.”Cd2+“对龙葵根尖细胞有丝分裂的影响. 河西学院学报，2007，（5）：48-50（第一作者）16.工业废水对黄瓜幼苗生长及叶片抗氧化系统的影响.干旱地区农业研究（CSCD核心库期刊），2006，24（4）：76-80（第三作者）
食用菌栽培技术的不断发展，使得食用菌不仅成为了富含人类生活所需的各种蛋白质，还能够广泛用于医药等领域。下面是由我整理的食用菌栽培技术论文，希望能对大家有所帮助。食用菌栽培技术论文篇一：《食用菌(平菇)的温室栽培技术》 摘要：食用菌的生长发育是由其生长习性和所处环境两种因素共同影响的，这两种因素共同作用影响着食用菌的产量和质量。随着国民经济的迅速发展，人们的物质生活极大丰富，进而导致人们的消费需求大幅度增加，从而对于食物的要求也从原来追求的吃饱转向吃好，大都讲究营养均衡。食用菌味道鲜美，营养价值高，越来越得到人们的青睐。生产食用菌的厂商为了获得更多的经济效益，也为了满足人们日益增长的多样化需求，由此开始采用温室栽培技术培育食用菌。本文以平菇为代表，从平菇的基本情况、鄂尔多斯达拉特旗王爱召镇地区的气候、地理位置条件出发，对食用菌温室栽培的技术要求和益处进行了综合论述。 1 平菇的基本情况 类型 平菇可以分为三种类型伞菌目、口蘑科、侧耳属。 品种类型多 除了平菇之外，还可以栽种许多侧耳属科目的菌类，例如凤尾菇、红平菇等等。 营养丰富 平菇营养丰富，味道鲜美。研究表明，平菇中含有多种微量元素和丰富的维生素，食用后可以给人补充丰富的营养，有极高的营养价值和食用价值。 药用价值高 平菇具有较高的药用价值，例如平菇可以抑制人体内癌细胞的产生和发展;降低血液中血脂、胆固醇等物质的浓度;促进人体肠胃蠕动，从而帮助消化;可以起到改善人体生理机能、促进新陈代谢等作用。 2 内蒙古鄂尔多斯达拉特旗王爱召镇地区的概述 地理位置 内蒙古鄂尔多斯达拉特旗王爱召镇地区位于鄂尔多斯高原北边、黄河中游地区的南岸部分，是“金三角”经济中心地带的中心处;并且当地所跨地形区域类型复杂，由此导致海拔相对高度差较大，进而使得温差较大，还有就是内蒙古鄂尔多斯达拉特旗王爱召镇地区经济发达，综合下来可以很好地满足食用菌温室培养所需的温度、水源、交通、经济等方面的因素，非常有利于食用菌的买卖流转。 气候条件 内蒙古鄂尔多斯达拉特旗王爱召镇地区是典型的温带大陆性气候，具有冬冷夏热，昼夜温差大，全年干燥少雨，降水主要集中在夏季，日照时间长等气候特点。特别是在冬季时节，昼夜温差大，更有利于子实体的分裂分化，促进食用菌的生长发育。 人口因素 内蒙古鄂尔多斯达拉特旗王爱召镇地区土壤资源丰富，灌溉便利，是我国有名的粮食产地和农业开发区。而且是经济发达的中心地带，人口聚集，人口数目众多。人口众多，对食用菌的需求量较大。 3 食用菌温室栽培的选用标准 位置要求 在冬天，温室栽培是最有效的栽培方式，应将大棚位置选在比较冷的地方。在比较冷的地方可以实行管道、暖气或者人工供暖，应采用最适合的供暖方式，冷暖的交替，可以促进子实体的生长发育，实现低成本、高利润的栽培。且在冬季栽培出来的平菇等食用菌病虫危害少，产量高、质量好、营养价值高。 原料要求 生料栽培是平菇温室栽培的首选 方法 。搭配合适的比例，将营养料在适当的条件下加工进行平菇栽培。让平菇在高温的条件下快速生长。 管理 措施 平菇等食用菌应采用定位出菇法，且装袋时应该提前留出孔，为食用菌提供氧气供其生长。还有就是定位出菇法可以减少水分的蒸发、平菇质量受损等现象，这种方法的应用有效地提升了食用菌的质量。 4 食用菌温室栽培的技术要求 营养要求 平菇等食用菌生长发育需要吸收的营养包括：有机酸、酶类、无机盐、氮元素、碳元素和其他微量元素(磷、钾、钙等)。 温度要求 平菇等食用菌生长发育需要在适宜的温度范围内。在内蒙古鄂尔多斯达拉特旗王爱召镇地区昼夜温差大，可以促进平菇的子实体快速分化，但需注意温度要保持在平菇的承受阈限内。 水分和湿度要求 水是生命之源，对于菇类也是如此。平菇的生长对于水分和湿度的要求比较高，在栽培中，应该将大棚内的水分和湿度控制在合适的范围内。达拉特旗王爱召镇地区位于黄河中游的南部，水资源丰富，易于灌溉，对平菇的培育生长极为有利。 空气要求 平菇好氧。要保证空气中的氧气含量，氧气浓度应较高。应选择在通风条件良好的地方利于空气的流通转换，并定时地进行通风。如果空气中二氧化碳的含量过高，会抑制子实体的呼吸活动，从而影响其生长发育。 光照要求 适度的光照对于平菇的生长发育极为重要。强光会影响到平菇的生长发育，温室大棚里边应该将光线调到较暗的状态。因为强光会刺激到子实体的分裂生长。 管理要求 要致力于追求规范化、精细化的管理。在食用菌的生长发育阶段应对湿度、水分、光照强度等指标做好监控记录工作，将其严格控制在食用菌生长的最佳范围内，以此来确保食用菌的健康生长。 播种要求 将已经按比例调配好的培养料按照严格的标准铺好，且相互之间的宽度间隔应合理规划，最后应该覆盖上保鲜膜进行栽种。 采摘要求 食用菌成熟后的采摘工作也是一项技术活，应该严格按照采摘标准来进行。且应该对食用菌是否成熟进行正确的评判，当食用菌菇盖的颜色由深变浅，孢子处在尚未放射的状态时就是成熟了，此时是进行采摘的最佳时机。 5 食用菌温室栽培的益处 食用菌有较高的营养价值和药用价值，食用后会给人们的身体带来极大的好处。食用菌温室栽培可以满足较高的产量需求和质量要求，通过调节温室大棚内的光照、温度、湿度、水分等条件让其达到食用菌适宜生长的最佳范围，以此来促进食用菌的生长发育。这是一种通过人为调控影响食用菌生长因素的方式来促进其生长的办法。这种方法既促进了食用菌产量的增加，质量的提高，又给人们增加了收入，提升了人们的生活水平，促进了国民经济的发展。此外，温室栽培食用菌的方式也打破季节的限制，打破了人们对新鲜蔬菜需求的限制，让人们能够在一年四季都能吃到新鲜美味的食用菌，避免了自然因素的影响。 6 结论 食用菌的温室栽培技术有效地改善了自然因素对食用菌栽培的限制，利用温室大棚对食用菌生长发育的环境进行了改造，既满足了人们的食用要求，让人们吃上了高质量、高营养的食用菌;还满足了市场需求，使批量化生产成为可能，增加了人民的收入，带动了当地经济的飞速发展。由此可见，温室食用菌(平菇)的温室栽培技术是值得大家学习的、值得推广的。 食用菌栽培技术论文篇二：《果园间套种食用菌栽培技术》 摘要 总结 了果园间套种食用菌的栽培技术，主要包括木耳、金福菇、姬菇等，以供参考。 关键词 果园套种;木耳;金福菇;姬菇;栽培技术 果园内空气湿度大，光照强度低，富含氧气，正符合食用菌生长，食用菌生长所释放出大量的二氧化碳又能使果树加强光合作用，促进果树的生长，食用菌菌渣成为有机肥施进果园，有效改善果园土壤结构，在干旱季节食用菌管理过程中多余的水又可以使果树再利用，果园里建棚栽培食用菌，可以抑制果园杂草滋生，减少水土流失，提高土地利用率，促进生产发展，增加经济收入。近几年来，贵港市农业科学研究所一直从事果园食用菌间套种栽培技术方面的研究，探索出一种创新的农业 种植 模式，果菌结合，做到了树上长果，树下结菇，取得了较好的经济效益和社会效益。现将具体栽培技术总结如下。 1 食用菌栽培场地的选择与建棚 选择树龄较大、遮荫较好的果园建棚，一般用铁管拱成1个长30～40 m，宽～ m、高～ m的拱形棚，距离地面1 m高的周边(除门外)用60目的防虫网围住，棚顶用薄膜盖好(与防虫网相交接)，然后盖上遮光率为90%的遮阳网[1-2]。 2 木耳栽培技术 木耳是一种木腐生型食用菌，其生长发育需要的主要营养为纤维素、半纤维素、木质素，还需要适量的蛋白质、维生素和无机盐。菌丝的最适宜温度为20～28 ℃，子实体生长的最适温度为15～25 ℃，按照贵港地区的气候，出菇季节安排在4―5月出菇，装袋提前50～60 d。 培养基配制 使用的培养基配方为玉米芯20%、桑枝30%、棉籽壳、麦皮5%、石灰2%、石膏1%、防霉剂。 原料处理 按配方所需的已粉碎的玉米芯、桑枝淋湿铺在已淋湿的棉籽壳上，放置1 d让多余的水流走，洒上所需的石灰、石膏，用拌料机将料充分搅拌均匀建堆。 装袋、灭菌与接种 料建堆3～4 d后可进行装袋。先调湿度，把料堆表面的干料淋湿，使料的含水量达料水比为∶(～)，加上配方所需的防霉剂、麦皮，用拌料机把料搅拌均匀即可进行装袋，用聚乙烯塑料袋装袋，装袋时要使培养料松紧适宜，上下均匀一致，周围丰满无空隙，装料过实过紧容易使塑料袋破损，料过松菌丝生长纤细无力。一般1袋装湿料重～ kg，装好袋后用绳子扎紧袋口装进铁框，每框9袋。装袋完毕，立即装炉灭菌，灭菌采用常压灭菌，温度到达100 ℃时保压9 h。灭菌结束后，炉温下降至60～70 ℃时进行御炉，把菌包移入已清洁消毒好的接种培养室的培养架上摆好，待菌包温度降至30 ℃以下时进行接种，1个菌包用种为8～10 g，接种完毕，把培养室打扫干净[3-4]。 发菌管理 培养室的湿度为50%～70%即可，春季气温较低，气温低于20 ℃时要注意加温，使培养室的温度为20～25 ℃，温度高于30 ℃时注意通风换气，以利于菌丝生长。 出菇管理 菌包接种后45～60 d，菌包菌丝吃透料，部分菌包出现耳芽时就可以把菌包移入出菇棚出菇。菇包入棚前首先把菇棚周围的杂草清除干净，把树叶清扫干净烧掉，菇棚及周边杀虫杀螨1次，棚内再撒一些石灰粉后即可把菌包移入出菇棚摆包出菇。摆包时，1个棚留1条纵向的人行道以便喷水和采菇，菌包用绳子把袋口扎紧后摆放成行，行距一般为20～24 cm，菌包摆成行后用小刀在每一个菌包上割3～4个长10 cm、深～ cm的竖裂口，裂口一般距菌包顶部4 cm、距菌包底部5 cm。摆包完毕，向地面洒水以增加空气湿度。割包5～7 d后木耳陆续现蕾，此时期注意加强水分的管理工作，随着耳片的增多增大，逐渐加大喷水量和通风量，喷水量要根据天气变化而变化，晴天多喷，雨天少喷，注意菇体的干湿交替，有利于木耳的正常生长。 采收及转潮管理 当耳片充分展开、边缘起皱就可以采收了，采收的原则是摘大留小，不伤小耳，一般采2～3次把一潮的木耳全部采完。采完一潮后，清除菌包上的残留耳根，将耳床清理干净，杀虫杀螨1次，停水2～3 d，以利于菌丝的恢复，4～5 d第2潮木耳现蕾，又像第1潮一样管理。一般木耳可采3～4潮，生物学转化率可达88%～94%。 3 金福菇的栽培技术 金福菇菇体硕大，菌肉肥厚嫩白，营养丰富，味微甜而鲜，耐贮性好，适宜鲜销。菌丝生长温度15～38 ℃，最适温度为27～30 ℃，子实体形成温度范围为18～30 ℃，最适温度为20～28 ℃，金福菇对低温较敏感，昼夜温差大时对出菇不利。一般在4月上旬湿料、装袋、接种，7月上旬覆土，覆土后10～15 d现蕾出菇。 培养基配制 使用的培养基配方为玉米芯、棉籽壳55%、麦皮5%、石灰2%、石膏1%、防霉剂。 原料处理 方法与木耳的原料处理方法一样。 装袋、灭菌、接种 除了灭菌时间保压6 h不同外，其他的与木耳的装袋、接种方法一样。 发菌管理 在菌包的发菌过程中，气温较高时注意通风换气，及时清除感染杂菌的菌包。 出菇管理 菌包菌丝培养60～65 d后，菌丝吃透料就可以把菌包脱袋覆土，覆土的泥土最好选择塘泥土，它透气性好，富含有机质。覆土前先对塘泥进行调湿与消毒，把土粒敲成～ cm大小的颗粒，调成含水量为 20%～30%，边喷5%福尔马林溶液，建堆，用薄膜密封24 h后揭膜让福尔马林的气味挥发掉，2 d后即可以覆土。覆土前把菌包薄膜全部脱掉侧卧摆成畦，菌棒之间留1～2 cm的空隙，然后盖上3～4 cm厚的已消毒的泥土，把畦面弄平，覆土结束。覆土后可大量淋水，使土壤含水量达饱和状态。6～8 d后白色的菌丝爬出土面，12～14 d后菌丝扭结，保持空间含水量达80%～90%，加强通风换气，促进原基的形成。15～17 d形成菇蕾，菇蕾阶段在小气候中生长，一般不喷水，干燥时喷雾化水于空间使空气相对湿度达80%～90%，当菇体长到3 cm高时每天喷水1～2次，喷水时要掌握菇多菇大的地方多喷，菇小菇少的地方少喷或不喷[5-6]。 采收及转潮管理 从菇蕾形成到成熟采收一般需要5～7 d，当菌盖肥厚紧实、菌膜尚未破伞时采收，品质最好;采收过迟，成熟过度，品质下降;过小采收，会影响产量。采收时成丛拔起，把菇体分开，用小刀削去菇体上的泥土。一潮菇采收结束之后，清除料面的残留菌柄、菇脚和死亡的菇蕾，用泥土把外露菌包的畦面填平，停水2～3 d养菌，然后像第1潮一样管理，2周内会形成第2批原基。一般可采2～3潮，生物学转化率达50%～70%。 4 姬菇的栽培技术 姬菇的菌盖为贝壳状或扇状，侧生，嫩滑可口，是百姓餐桌上的佳品，耐储运，投资少，见效快，收益高，市场前景很好。菌丝的生长温度为6～28 ℃，最适温度为20～26 ℃，高于32 ℃菌丝生长不良;出菇温度为4～26 ℃，最适温度为6～20 ℃，夏季炎热的季节不出菇，低于4 ℃时不易形成原基[1]。根据贵港地区的气候与市场销售情况，一般安排9月中下旬至11月上旬做出菇袋，10月中下旬至翌年的3月收菇结束。 培养基配方 使用的培养基配方为棉籽壳、玉米芯、玉米粉5%、石灰3%、防霉剂。 原料处理 方法与木耳的原料处理方法相同。 装袋、灭菌、接种及发菌管理 料建堆2～3 d后可进行装袋。先调湿度，把料堆表面的干料淋湿，使料的含水量达料比水为∶(～)，加上配方所需的防霉剂、玉米粉，用拌料机把料搅拌均匀即可进行装袋，用36 cm×13/23 cm的聚乙烯塑料袋装袋，装袋时要使培养料松紧适宜，上下均匀一致，周围丰满无空隙。一般1袋装湿料重～ kg，装好袋后用绳子扎紧袋口装进铁框，每框9袋。装袋完毕，立即装炉灭菌，灭菌采用常压灭菌，温度到达100 ℃时保压6 h。灭菌结束后，炉温下降至60～70 ℃时进行御炉，把菌包移入已消毒的清洁的果园里的出菇棚里，待菌包温度降至30 ℃以下时进行接种，1个菌包用种为8～10 g，套上套环，用胶圈把报纸(已灭菌的)扎紧在套环外封口，然后把菌包单个直立成行摆放培养菌丝，菌包之间留1～2 cm的空隙以便散热。在此期间要注意如果气温过高，可以把菇棚的防虫网掀起以通风降温。 出菇管理 菌包菌丝培养30 d左右，菌丝吃透料，少数菌包现蕾，就可以叠包解报纸出菇，叠包时菇棚中间留1条便于淋水和采菇的人行道，在人行道两侧把菌包垒成4～6个菌包高单排或双排的墙式堆码，把菌包口的报纸解完后立即淋水进入第1潮的出菇管理工作，每天喷水2次，3～4 d现蕾，菇棚的空气湿度保持85%～95%，喷水的次数与多少应根据天气情况、出菇数量和菇体大小而定，宜喷雾状水，子实体珊瑚期不宜直接向菇体喷水[2]。 采收及转潮管理 当一丛菇中大部分子实体菌盖直径达2～3 cm、菌柄长度4～5 cm时，及时采收，用手握住整丛菇的基部，拔下整丛菇体，小心放入框内，避免损伤，然后在距菌盖3～4 cm处剪去菌柄基部，将连接的菇体分为单个，去掉小菇，分级真空包装，每袋 kg。采完一潮后，清理菇脚，停水2～3 d让菌丝休复，5～7 d即可转潮，又像第1潮一样管理。姬菇一般可采5～7潮，生物学转化率可达90%～110%。 5 参考文献 [1] 储利慧，陈生良，俞田华.姬菇栽培技术[J].上海农业科技，2007(6)：92-93. [2] 陈建辉.珍稀食用菌真姬菇栽培技术[J].科技致富向导，2004(9)：34-35. [3] 刘岩岩，张敏，宋莹.北方林下黑木耳栽培技术[J].现代农业科技，2014(2)：130-131. [4] 张怀荣.黑木耳立森261菌株的生物特性及其栽培技术要点[J].食用菌，2014(1)：23-24. [5] 沈渊，姚明军，沈新芬.大棚草莓-金福菇栽培技术初探[J].上海农业科技，2014(1)：144-145. [6] 赖育斌，郭明，巫世芬，等.金福菇高产栽培技术[J].现代园艺，2013(15)：41. 食用菌栽培技术论文篇三：《浅谈食用菌高产栽培技术》 摘要：食用菌不仅富含人类生活所需的各种蛋白质，还能够广泛用于医药等领域。目前我国的食用菌培植技术目前正处于飞速发展阶段，如何科学合理的进行食用菌的栽培成为了发展白色农业的重要课题。 关键词：食用菌;栽培技术 食用菌是人类食用的大型真菌，2000年统计中国的食用菌达938种，人工栽培的50余种，中国广泛栽培的食用菌有蘑菇、香菇、草菇、木耳、银耳、平菇、滑菇等7类，它们分别生长在不同的地区、不同的生态环境中。食用菌产业是一项集经济效益、生态效益和社会效益于一体的农村经济发展项目，食用菌又是一类有机、营养、保健的绿色食品。发展食用菌产业符合人们消费增长和农业可持续发展的需要，是农民快速致富的有效途径。因此，食用菌产业作为一种适应社会市场经济的产业日益发展壮大起来，人们对于食用菌的栽培技术研究也是越来越多，既要达到绿色自然、无公害的目标，又要做到保质保量的要求。 一、培养料的配置 食用菌培养料的配制要注意以下问题，首先将原料的干料按照比例要求进行充分的搅拌混合，需要添加的一些微量元素先要用水化开之后再拌入料中，接着进行反复的搅拌，将存在的团料尽量打散，确保料的干湿程度均匀;其次，影响菌丝生长的另一个重要因素就是培养料的含水量，一般培养料的含水量在55%左右就非常适合食用菌的生长，如果培养料的含水量偏低将会导致出菇产量大幅降低，如果培养料的含水量偏高，则会让处于下层的菌丝缺氧而不能正常吃料，导致原料浪费。因此必须要按照培养料原料的木屑情况灵活的调整含水量，在这个过程中，主要是注意木屑的粗细以及质地的软硬、空气湿度等具体情况对含水量进行配比;最后，培养料配置工作结束后，要尽快进行装袋，一般装袋时间不超过培养料配置 完成的7小时左右，装袋完成后要注意及时灭菌。灭菌时先把装袋完成的培养料放入锅中，用猛火快速加热到100℃，之后利用冷气阀降温到0℃，再重新将温度加热到100℃左右。进行灭菌作业时一定要确保猛火加热、温火保温，定时查看灭菌锅内的温度情况，防止漏气的现象，否则无法达到有效的灭菌效果。经过这些阶段，培养料的配置工作已经算是初步完成，培养料的配置对于提高食用菌的产量，降低生产成本具有重要意义。 二、选择优质的菌种及接种 要挑选优质的菌种来培养，根据要栽培的食用菌的生长特点以及适宜的生长环境来选择选择适宜本地生长的优质、高产、高抗的优良菌株。在挑选菌 种时一定要严格查看菌种，确保其没有杂质污染和虫害，适用于栽培养育。必须按照科学、严谨的接种程序来为所要栽培的食用菌接种，并在接种后及时将装菌种的袋子放入无污染、空气适宜的培养室内进行发菌培养。 三、培育环境的要求 在经过几个月的生长后，菌袋就要搬入出菇棚进行培育，但是受到培育环境等因素的影响，菌袋的出菇时间也不尽相同，只有保持培育环境适合菌袋成长才能让菌袋在一定的时间范围内正常出菇。而将菌袋搬入出菇棚的时间要尽量避免午间气温较高时进行，因为过高的温度容易影响出菇时间;入棚的时间一般选在晴天的早晚进行，要防止人棚过程中菌袋受到雨淋。菌袋人棚后的摆放要按照一定的规范进行操作，菌袋要并列排放整齐，且其间需要留5厘米左右的间隔以保持菌能够正常呼吸，只有创造出一个有利于菌袋出菇的环境才能保证出菇更加优质、高产。 (1)空气湿度。作为影响子实体生长的重要因素，如果培育环境的空气湿度太低，子实体表面的水分蒸发就会加快，其基质中的含水量就会大幅度降低，进而影响食用菌的产量;相反空气湿度如果偏高，子实体表面的水份蒸发作用不明显，菌体内的营养运输受到阻碍，造成子实体无法进行呼吸作用而停止生长。如果栽培环境中的空气湿度长期处于偏高的状态，子实体会因为倒吸空气中的水份而出现腐烂的情况，严重时甚至会造成大范围的细菌传染。 (2)保持通风。食用菌的生长发育需要足够的氧气，和我们人需要呼吸一样，食用菌也会进行呼吸作用，它们吸人空气中的氧气释放出二氧化碳。虽然适量程度的二氧化碳对某些特别种类的食用菌菌丝生长有利，但是很多食用菌如果长期处在二氧化碳过多的环境下，它们很有可能停止生长，而高浓度的二氧化碳环境甚至会让菌丝体死亡。因此，出菇棚必须要保持通风，将二氧化碳的浓度控制在合适的范围之内，确保空气流通。 (3)光照环境。多数食用菌在出菇时需要散射光进行刺激，只有极少数品种要较强的散射光。通常情况下，光照越强时子实体的颜色就越深，光照越弱时子实体的颜色就越浅。栽培人员需要根据食用菌种类的差异对出菇棚的光照进行调节，如可以采用遮阳网、草帘等物品来调节室内光照。 四、使用无污染的肥料对食用菌进行施肥 (1)喷洒酵母膏以及蛋白胨等溶液。用的酵母膏和的蛋白胨喷洒在食用菌的表面，能够使食用菌的身体变厚变肥，促进转潮，在温度为14℃～l6℃时效果最佳。 (2)人粪或人尿的喷洒。在喷洒人粪人尿时应当注意对人粪及人尿的加热，最适合的人粪和人尿应该是煮熟20分钟后的，对其进行对水，比例为1：10或者是1：20进行喷洒，或者也可以用新鲜的牛畜尿液，煮熟与没有泡沫即可，进行对水，比例在l0倍～17倍之间。 (3)米醋的喷洒 在食用菌生长的中后期，可以用300倍的米醋对其进行喷洒，在采摘前的1～3天，每天必须喷洒一次，通常情况下可以使食用菌产量提高6%，而且色泽会呈现出洁面。 (4)豆浆水的喷洒 黄豆一千克，将其磨成豆浆后加入75千克～UI00千克的水，喷洒到食用菌表面，喷洒完成后再用清水喷洒一遍。 五、科学合理的管理方式 在管理栽培养育的食用菌时，要严格按照科学的管理方式进行管理。通过以往的栽培 经验 ，并结合实际的培育现状，研究出最适合、最科学的食用菌栽培管理方式。以无公害、绿色健康为前提，运用无农药危害的病虫害的防治措施，栽培工具和培育工作人员进出时要做好清洁和消毒工作。根据食用菌的实际生长状况及时对周围环境 做出处理，调节培育室内的通风、通气、采光条件，掌控好温度和湿度情7兕，在培育长成后采取时，也需要做好消毒工作，要以正确的方式、适时地采收。 六、结语 食用菌已经成为人们日常生活中不可缺少的食用产品，食用菌产业也是社会市场上不可忽视的市场经济发展项目无公害、高产的食用菌栽培技术是目前社会市场发展的需要，是促进社会市场经济发展的一部分，也是人们高品质的日常生活的需求，必将得到大力的推广和应用。 猜你喜欢： 1. 食品保藏技术论文 2. 农学论文范文 3. 人工栽培桑黄的技术 4. 双孢菇种植的技术 5. 平菇栽培技术论文 6. 平菇的栽培技术论文
0引言脆性X综合征（fragile X syndrome, FXS）是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1（fragile X mental retardation, FMR1）中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其CpG岛异常甲基化导致. FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生［1-2］. 本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与FMR1 基因5′ d (CGG)n3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达，并对其DNA结合活性进行研究.1材料和方法材料大肠杆菌DH5α, BL21（ DE3）和表达载体pRSET A均为本实验室保存. 质粒提取试剂盒购自Sigma公司； 限制性内切酶BamH I和KpnI购自宝生物工程公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司； Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司. 方法 表达载体的构建根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物：CGGBP1F CGC GGA TCC GAG CGA TTG TAG TAA CAG CA，CGGBP1R GGG GTA CCT CAA CAA TCT TGT GAG TTG AG. 其上游及下游引物分别加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列(引物序列下划线部分). PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列. 设计PCR扩增体系25 μL，灭菌去离子水10 μL，10×反应缓冲液 μL，25 mmol/L MgCl2 μL，DMSO μL，4× dNTP混合物（每种 mmol/L）2 μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10 pmol，模板 μL（50 ng/μL）， Taq DNA（5 μ/μL）聚合酶 μL. 扩增条件：95℃预变性5 min，再94℃ 30 s， 53℃ 1 min，72℃ 1 min循环40次，最后72℃终末延伸产物10 min. PCR产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因. 用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSET A，酶切产物电泳后回收，在T4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSET A的BamHI和KpnI克隆位点. 将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板并挑取单菌落.融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒转入BL21（ DE3）. 挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中， 37℃振荡培养12 h， 按10 mL/L比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入IPTG至终浓度1 mmol/L，32℃诱导振荡培养4 h，离心收集菌体，SDSPAGE分析重组蛋白的表达.蛋白表达形式的分析取5 mL菌液离心，用500 μL的裂解液（10 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L磷酸二氢钠 pH ）重悬，加溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，冰浴30 min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行SDSPAGE分析.融合蛋白的纯化将1 mL 500 mL/L Ni2+NTA悬液和4 mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60 min，直接过柱. 过柱结束后，用4 mL漂洗液（20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH ），洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白. 经过2次漂洗后再用 mL洗脱液(250 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl及50 mmol/L 磷酸二氢钠 pH ) 3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集. 取收集液，进行SDSPAGE分析.与（CGG）29重复序列双链DNA结合实验取10 μL磁珠用1 mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂. 1×生物素亲和素结合缓冲液（10 mmol/L TrisHCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1 g/L Tween 20）15 μL重悬磁珠，各5 μL分3组实验. 其中一组加入25 μL（100 ng/μL）生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA，另外两组分别加入25 μL（100 ng/μL）非生物素化的（CGG）29重复序列双链DNA和25 μL三蒸水做对照；三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30 μL，25℃轻摇1 h. 经磁力吸附后，弃上清. 重复上述步骤3次；加入纯化后CGGBP1（500 μg/mL）15 μL 和2×核酸蛋白结合缓冲液（20 mmol/L HEPES，100 mmol/L NaCl， mmol/L DTT，100 g/L甘油）20 μL，室温下静置30 min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10 μL，沸水煮10 min，进行SDSPAGE分析.2结果原核表达载体的构建及鉴定扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504 bp的条带（图1）； 重组质粒pRSET A/CGGBP1及质粒pRSET A分别用BamHI和KpnI酶切，pRSET A/CGGBP1分为两个片段，分别为 ku和504 bp（图2），均与预计结果相同.的表达用BamHI和KpnI双酶切pRSET A/CGGBP1表达质粒，筛选阳性重组质粒. 携带有pRSET A/CGGBP1质粒的 BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导后，在Mr 约25 000处出现1条表达条带；而未经IPTG诱导的菌体则无此条带. 诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部分. 经SDSPAGE分析表明，CGGBP1部分存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少（图3）. 蛋白纯化在表达质粒pRSET A多克隆酶切位点的上游， 插入有连续6个组氨酸的序列 —(His )6 tag. 重组质粒经诱导表达后，(His )6 tag可以和外源插入片段共同表达. 利用(His )6 tag 和金属Ni2+的螯合所设计的固定化金属配体亲和柱层析方法，是纯化目的蛋白的一种高效而简单的方法. SDSPAGE显示，CGGBP1得到较高程度的纯化（图4）.与5′d（CGG）293′重复序列双链DNA结合实验生物素化的5′d（CGG）29 3′重复序列双链DNA被固定到链酶亲和素磁珠上，非生物素化的5′d（CGG）293′重复序列双链DNA因无法固定到链酶亲和素磁珠上而被洗脱掉. 同理，加入CGGBP1后，未和5′d (CGG）293′重复序列双链DNA结合的蛋白也被洗脱（图5）.3讨论关于微卫星的产生机制，普遍认为是DNA复制过程中DNA聚合酶的滑动［4］，或DNA复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，导致一个或几个重复单位的插入或缺失. 已发现微卫星可能是一种非常活跃的碱基序列，通常各种简单的重复序列成簇地聚集在一个染色体区域，这个染色体区形成特异染色体结构的能力将会增强. 这些区域在核糖体RNA基因中非常复杂，同时这些重复序列所折叠形成的结构还能与特异的蛋白质相结合，成为“染色质折叠密码”［5-6］，参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程. 脆性X综合征是Igarashi等［7］研究报道的与三核苷酸重复片段扩增突变有关的7种神经变性疾病其中的一种. 该蛋白只和（CGG）n重复序列发生特异性结合，而与其它类型的三核苷酸重复序列不结合［8］. 因此，对该蛋白功能的研究具有重要的理论研究意义. 本实验成功地构建了含CGGBP1的重组质粒，以可溶性蛋白形式获得较高表达. 通过Ni2+NTA柱纯化，获得纯化的目标融合蛋白质，同时证明了该蛋白能和人FMR1基因5′d (CGG)293′重复序列双链DNA特异性结合. 这将为进一步开展真核生物蛋白CGGBP1功能的研究和阐释CGG三核苷酸动态突变的致病机理奠定基础.
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