甲基化研究进展论文提纲范文

蜜蜂在出生时候都一样，但是吃食蜂王浆的最后变成了蜂王，没有吃食则成了工蜂；同卵双胞胎基因组相同，但依然会显示出肉眼可见的差异；睡眠不足会导致人类基因组中DNA甲基化的水平产生变化， 这种表观遗传的印记还可能传递给我们的后代。这些现象都是如何解释呢？ 我们都知道通过中心法则，有的基因可以表达有的基因表达则不表达，而表观遗传可能决定着这些基因的表达方式表达时间等。 表观遗传学可以定义为研究基因表达的可遗传变化，这种变化独立于原始DNA序列的变化，会受环境等因素的影响而发生改变。基因表达的表观遗传调控是由DNA甲基化、组蛋白修饰等机制介导。 DNA甲基化是哺乳动物中研究最深入的表观遗传修饰之一。1983年，Feinberg 与Vogelstein发现肠癌组织中特定基因的甲基化水平降低，同年，Gama-Sosa等人证实肿瘤样品中5-甲基胞嘧啶的减少，自此科学界开始广泛研究甲基化与癌症的关系，并取得了很多突破性的进展。 在正常细胞中，DNA甲基化拥有调节基因表达和沉默的重要作用。动物基因组中，甲基化主要发生在CG位点上，是一种共价修饰方式，DNA复制后，硫-腺苷-L-蛋氨酸（S-adenosylmethionine）通过酶反应把-CH3基团添加到基因组胞嘧啶上。哺乳动物中，基因组中约60%-90%的CpG核酸位点DNA甲基化，在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基，通常情况，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛,位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点，人类大约有 30 亿个碱基对，基因组中大约有 2800 万个 CpG 位点。 通过以上对DNA甲基化的表述不难看出DNA修饰在转录调节中起着关键作用，因此这一机制的缺陷可能导致包括癌症在内的各种疾病也就不足为奇了。在癌症发生时，抑癌基因启动子区域表现为高甲基化，基因启动子甲基化以后基因表达就会减弱甚至关闭。恶性肿瘤中大多数基因的开关由DNA甲基化调控，几乎所有肿瘤发生时都会伴随DNA甲基化的异常发生，通常情况下高甲基化与低甲基化并存。如肿瘤细胞中抑癌基因启动子通常为高甲基化，抑制抑癌基因表达使其丧失抑癌功能，从而促进癌症的发生。而低甲基化则通常是整个基因组低甲基化或原癌基因启动子的低甲基化，前者染色体结构稳定性降低，导致癌变发生，后者则激活原癌基因，诱导细胞癌变。在肿瘤细胞中，基因组整体甲基化水平降低至 20~50%，与正常细胞相比，约有 10~60% 的 CpG 位点甲基化状态发生了改变。   2020年全球新诊断癌症1930万例，其中癌症死亡人数为1000万人。这意味着什么呢？意味着全世界1/5的男性和1/6的女性会在一生中的某一时刻患上癌症，其中1/8的男性和1/11的女性将死于癌症。 全世界范围内，前五名的癌症是乳腺癌，肺癌，结直肠癌，前列腺癌，胃癌，而最引人注目的一点莫过于乳腺癌!在所有癌症发病占比中，乳腺癌首次超越肺癌站上了冠军的位置。 早在2018年的统计报告中，癌症所致死亡在中国还屈居第二，而来到2020年，中国人的死亡原因排名中癌症已经跃居第一。 随着人类对抗癌症的严峻形势，肿瘤早筛的市场应运而生，甲基化几乎发生在所有的肿瘤当中，所以针对于不同肿瘤靶点的甲基化试剂盒受到了广泛关注，其中肠癌因其具有明确的早筛临床意义，以及相对成熟的技术路径，相对其他癌种的早筛产品走的更快，也为降低肠癌的死亡率做出了很重要的贡献。 2014年，Exact Sciences结合多学科原理，建立了多靶点粪便DNA检测方法，推出了Cologuard，用于肠癌筛查并获得了FDA审批。包括7个DNA点突变位点（KRAS），以及2个DNA甲基化位点（NDRG4和BMP3）2017年以来，我国也有近十个甲基化试剂盒面向市面，涵盖肠癌、胃癌等癌种，肠癌的早筛试剂盒因其检测样本获取简单，样本无需复杂处理，操作便利，准确快速，无侵入创伤性，成为早期结直肠癌很有前景的筛查方法之一。我搜索数据发现，目前在注册阶段的甲基化试剂盒有几十个。2021年，北京市率先将甲基化检测纳入医保范畴，足见甲基化试剂盒的研发前景广阔。DNA甲基化标记物被认为是一种预测因素。它们不仅可用于早期疾病的筛查，还可用于确定个体对化疗的反应。此外，在治疗或治疗性手术后监测DNA甲基化谱可能可以给治疗有效性的评估和检测疾病复发提供证据。 基于此，甲基化试剂盒的研发已经成为各大IVD企业争相开发的模块，而在甲基化研发阶段，获得稳定的阳性和阴性对照至关重要，早期使用体外构建质粒或亚硫酸盐转化的 DNA作为企业参考品已经逐渐退出甲基化试剂盒研发的舞台，若使用来自临床的样本作为对照又受限于该标准品的不稳定和难获取的特性。所以寻找稳定的甲基化/非甲基化细胞株以及构建去甲基化/甲基化细胞株成为企业较为倾向的对照品，来源于细胞株的对照品可以实现稳定的供应，且成本较低。 说到基因编辑细胞， CRISPR技术 在基因编辑细胞的工作中大放异彩，不仅有Cas9对基因的特定编辑， Cas9的核酸酶 发生双突变后可以产生“钝化”和“死亡”Cas9，即“dCas9”，这种核酸酶失去切割DNA的功能，但在gRNA的指导下仍能以相同的精确度靶向和结合DNA。切割失活的Cas9连上转录抑制和激活元件，可以达到基因组特定位点的修饰， dCas9蛋白可以与效应器阻遏（如蛋白和激活剂结构域）形成融合蛋白，这样，dCas9可以将这些效应器带到启动子区域、调控区域或编码区域，对任何基因进行精确定点调控而不造成DNA损伤, 如结合TET1（DNA甲基化羟化酶）可以特异性催化DNA的去甲基化，从而调节基因的表达. 海星生物利用CRISPR技术可以对特定基因的甲基化进行编辑，此外也可以构建去甲基化的广泛使用细胞株，海星生物也致力于建立细胞平台，整合甲基化细胞株，助力甲基化试剂盒研发。  参考文献：Kulis M, Esteller M. DNA methylation and cancer. Adv Genet. 2010;70:27-56. doi: . PMID: 20920744.

1923 年开始在汽油中加入铅用作抗爆剂以后, 更加速了全球性铅的污染。因此可以说如今世界上已难找到土壤铅含量不受人类活动影响的一片“净土”。Kabata - Pendias 和Rendias[5 ]报道在靠近公路的某一块土壤铅含量高达7000μg/ g。潘如圭等[6 ]研究了汽车尾气中铅对公路两侧蔬菜的污染情况。试验结果表明: 在公路两侧200 m 范围内生长的蔬菜均受到汽车尾气中铅的污染。管建国[7 ]等研究了在金属冶炼厂周围和公路两侧200 m 范围内蔬菜的受污染情况, 发现所调查的普通叶菜的铅含量均超过国家食品卫生标准。彭珊珊等[8 ]对我国一些常用茶中Pb 进行了测定, 结果表明茶叶中的铅超过一般标准, 应引起重视。土壤中的铅大部分形成PbS , 少部分形成PbCO3 、PbSO4 和PbCrO4 等无机化合物, 或与有机物螯合。铅的无机化合物大多难以溶解, 而且因受到下列因素影响, 铅在土壤中的迁移能力也很弱: (1) 土壤有机质对铅的络合作用。土壤有机质的—SH , —NH2 基因能与铅离子形成稳定的络合物。(2) 土壤粘土矿物对铅的吸附作用。粘土矿物的阳离子交换位点可对铅离子进行交换性吸附。另外, 铅离子进入水合氧化物的配位壳, 直接通过共价键或配位键结合于固体表面。由于铅在土壤中迁移能力弱, 而且溶解度低, 因而人为因素造成的铅污染大多停留在土壤表层, 随土壤深度的增加其含量急剧降低, 20 cm 以下趋于自然水平。进入土壤中的铅有可能被植物吸收, 或溶解到地表水中, 通过食物链和饮用水进入动物和人体, 进而影响人类健康。近年来的研究发现, 铅对人类健康的影响具有不可逆性和远期效应[9 ] 。Page[2 ]等研究表明, 人体血铅与土壤铅含量存在一定关系:0112 (Pb - B , μg/ 100mg) = ln (Pb - S ,μg/ g) - 4185这一关系式仅说明了某一地区的特殊情况, 并无广泛适用价值, 但它足以表明土壤铅含量与人体健康有直接关系。2 铅污染土壤的修复技术由于铅对人体具有很强的毒性, 近年来对铅污染土壤的修复引起了人们的普遍关注。铅污染土壤的修复技术可以分为两大类: 物理化学修复技术和生物修复技术。物理化学修复技术又可分为隔离包埋技术、固化稳定技术、Pyrometallurgical Separation 、化学稳定技术和电动修复技术等。生物修复技术又可分为微生物修复技术和植物修复技术等。211 隔离包埋技术(isolation and containment)该法采用物理方法将铅污染土壤与其周围环境隔离开来, 减少铅对周围环境的污染或增加铅的土壤环境容量。具体措施为: 以钢铁、水泥、皂土或灰浆等材料, 在污染土壤四周修建隔离墙, 并防止污染地区的地下水流到周围地区。其中以水泥最为便宜, 应用也最为普遍。为减少地表水的下渗, 还可以在污染土壤上覆盖一层合成膜, 或在污染土壤下面铺一层水泥和石块混合层。212 固化稳定技术(solidification and stabilization)固化稳定技术包括两个方面: 采用化学方法降低铅在土壤中的可溶性和可提取性, 同时采用物理方法将污染土壤包埋在一个坚固基质中。Wheeler 报道[10 ]将水泥、炉渣和石灰混合物加入污染土壤中, 搅拌均匀凝固之后, 形成一个大石块, 将污染土壤包埋在其中。也有人采用电导产热原理给土壤加热升温, 当土壤冷却后, 土壤凝固成玻璃样块状结构, 称之为玻璃化。该方法包括三个具体步骤: (1) 在土壤两端插上电极电流通过土壤形成环路, 土壤温度上升并熔化。(2) 在自然冷却过程中, 土壤凝固形成玻璃样土块。(3) 在土块上覆盖一层干净土壤。这一技术已经实际应用于铅污染土壤的修复。·13 · 广东微量元素科学 2001 年 GUANGDONG WEILIANG YUANSU KEXUE 第8 卷第9 期 © 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights Pyrometallurgical Separation在一定温度下, 金属就会熔解或升华为气态。Pyrometallurgical separation 技术利用这一原理,将铅等重金属从污染土壤中“蒸发”出来以达到净化土壤的目的。“蒸发”出来的金属可以再回收或固定, 同时富含金属的剩余炉渣也可用于进一步提炼[11 ] 。铅污染土壤在高温熔化之前要进行预处理, 以促进铅的熔解。这一技术主要应用于具有较高回收效率的严重污染土壤(5 %～20 %) 。214 化学稳定技术(chemical stabilization)化学稳定技术就是应用化学反应将污染土壤中的重金属氧化或还原, 从而达到降低土壤中重金属的活性[11 ] 。对于铅污染土壤, 可用还原剂(二氧化硫、亚硫酸盐或硫酸亚铁) 将铅离子还原, 以减少土壤中铅的可提取量。这一技术也可作为其他修复技术(如固化稳定技术) 的前处理步骤。但必须注意的是, 还原剂的施用可能会造成二次污染。初步研究表明, 施用石灰调节土壤PH7 可降低铅在土壤中的溶解度, 减少植物对铅的吸收[13 ] 。研究表明, 施用羟基磷灰石[14 ] 、水合氧化锰[15 ] 、磷灰岩[16 ,17 ]也可促进铅的沉淀, 减少土壤中的可溶态和可提取态铅。Vidac 和Pohland[18 ]已将这一技术运用于地下水的修复。215 电动修复技术(electrokinetice technology)在污染土壤两端插上电极, 接通电源后, 土壤中的带电粒子向电性相反的电极移动, 最终积聚或沉淀在电极上, 以达到清除污染土壤中重金属的目的。在欧洲, 这一技术不仅应用于铅污染土壤[19 ] , 同时也应用于铜、锌、铬、镍和镉等污染土壤的修复。216 微生物修复技术(microremediation)微生物修复主要是借助微生物的生化反应来清除或稳定环境中的有害物质。根据原理不同可分为生物还原沉淀、生物甲基化和生物吸附三种。生物还原沉淀是应用硫酸还原菌(SRB) 将硫酸根还原为HS - 再与铅生成不溶性的Pb2S。生物甲基化是利用微生物将土壤中的重金属甲基化,甲基化的金属更容易蒸发, 可做为Pyrometallurgical Separation 的预处理。生物吸附是利用细菌细胞和藻类来吸附地下水或其他污染水体中的有害物质。Leusch 等[20 ]报道一种海藻( S . f luitans )对铅的最大吸附量可达到369 mg/ g。Rahmani 等[21 ]研究了浮萍(Lemna minor) 对污染水体中铅的清除能力。结果表明浮萍在亚致死水平下也能有效清除水体中的铅。217 植物提取修复技术(phytoextration)植物提取修复技术主要是利用超积累植物, 将土壤中各种过量元素或化合物大量转移到植株体内特别是地上部分, 从而修复污染土壤[22 ] 。超积累植物相当于一个太阳能驱动泵将土壤中的过量元素不断泵到植株体内[23 ] 。植物修复技术可分为两种, Salt 等[24 ]把利用超积累植物来吸收土壤重金属的方法称之为持续植物提取(continuous phytoextraction) ; 而把利用螯合剂来促进植物吸收土壤重金属的方法称之为诱导植物提取(inducced phytoextraction) 。21711 持续植物提取(continuous phytoextraction)运用持续植物提取技术来修复铅污染土壤的关键是植物超积累铅的能力。一般认为, 只有铅积累量达到1000μg/ g (干重) 才能称为铅超积累植物[25 ] 。已见报道的铅超积累植物有Brassica .nigua [26 ] , Brassica . pekinensis [27 ] , Brassica . juncea [27 ]和T. rotungifolium [28 ] 。其中T. rotungi2folium 的铅积累量最大, 可达到8200μg/ g (干重) [28 ] 。目前对于植物吸收、运输和积累铅以及耐铅胁迫的机制研究甚少。Liu 等[29 ]研究发现印度芥菜( Brassica juncea) 可在根部积累大量的铅但只有极少部分运输到地上部。原因一方面可能是由于根部细胞内存在高浓度磷酸盐或碳酸盐,在细胞内近中性pH 条件下, 铅主要以磷酸盐或碳酸盐形式沉淀在根细胞壁或细胞内; 另一方面·14 · 广东微量元素科学 2001 年 GUANGDONG WEILIANG YUANSU KEXUE 第8 卷第9 期 © 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.铅从根部向中柱迁移的过程还会受到内皮层凯氏带的阻拦。Wozny 等[30 ]认为铅进入中柱后随蒸腾流被动运输到地上部分。运输过程中铅可能会与中柱内的阳离子交换位点结合, 从而被固定在茎部中柱内。研究表明, 铅可与多种小分子有机物螯合[31～33 ] 。推测铅也有可能与各种小分子有机酸、植物螯合肽结合, 减少与阳离子交换位点结合的机会, 从而增加进入了叶部的数量。作者在对浙江西部的某一铅锌矿土壤进行调查时, 发现一种可高浓度积累铅和锌的植物, 据初步调查结果, 其地上部分锌和铅的最高积累量分别达到了5000μg/ g 和1182μg/ g。对于这种植物超积累锌和铅的生理生化机制, 正在进一步的研究中。21712 诱导植物提取(inducced phytoextraction)对于在土壤中极难移动的铅元素, 施用螯合剂可促进植物对其的吸收。施用螯合剂诱导植物超富集作用被称为螯合诱导修复技术。Romheld 和Marschner[34 ]认为螯合物与金属结合后, 金属螯合物可以从内皮层裂口处进入根内, 然后被迅速地转移到茎叶。在用14C - EDTA - Pb 作标记的试验中, Blaylock 等[35 ]发现, 在含这种标记物的介质中生长的植物地上部能快速积累铅, 表明铅与螯合物结合有利于植物对铅的吸收。Salt 等[36 ]认为金属与螯合物结合后阻止了金属的沉淀和吸附, 从而提高了金属的可提取性。螯合诱导修复技术既可选用一般植物也可选用超积累植物。在土壤铅浓度为2500μg/ g 的污染土壤上种植玉米和豌豆, 加入EDTA 后, 植物地上部铅的浓度从500μg/ g 提高到10000μg/ g ; 而且EDTA 还能极大的提高铅从根系向地上部的运输能力,每千克土中加入110 g EDTA , 24 h 后, 玉米木质部中铅的浓度是对照的100 倍, 从根系到地上部的运输转化量是对照的120 倍[37 ] 。不同螯合剂促进植物对铅吸收的效应与螯合剂促进铅从土壤解吸的效应相一致: EDTA > HEDTA >DTPA > EGTA > EDDHA。螯合诱导技术对超积累植物吸收金属的强化效应也很明显。印度芥菜是一种可富集多种金属的植物。Blaylock 等[35 ]研究了柠檬酸、苹果酸、乙酸、EDTA、EGTA、CDTA 对印度芥菜( Brassica juncea) 吸收Cd 和Pb 的效应,发现土壤酸化与施加螯合物相结合可显著增加铅的吸收效率。Vassil 等[38 ]报道用铅和EDTA 共同处理印度芥菜, 其地上部分含量高达55 mmol/ kg (干重) , 相当于培养液铅浓度的75 倍。对印度芥菜茎部提取液的直接测定证明, 茎部的大部分铅是与EDTA 结合的形式运输的。由于螯合剂的价格一般较贵, Blaylock 等[35 ]指出螯合剂( EDTA 和乙酸) 将使每吨铅污染土壤修复成本增加715 美元。此外螯合剂在增加土壤中重金属生物有效性的同时, 也增加了重金属离子的移动性。因而对于螯合诱导修复技术的环境风险应加以系统评价。由于已发现的铅超积累植物种类极少, 而且植物生长慢、生物量小, 因而螯合诱导修复技术比持续提取技术更引人注目。但不论哪种植物修复技术都具有其它物理化学方法所没有的优点:(1) 成本低。据估计, 如果某种植物的茎部铅积累量达到1 % , 且每年产量40 t/ hm2 , 那么通过10 年种植将土壤铅含量从114 %下降为014 %所需费用是245000 美元, 而用物理化学修复技术则需要1600000 美元。(2) 植物利用太阳能, 不破坏生态平衡, 同时还能美化环境, 易为公众所接受。(3) 将富铅植物残体用于植物炼矿, 可产生经济效益。相比之下, 虽然植物修复技术所需时间较长, 而且植物的生长要受到环境的影响, 但这些缺点都不成为重要问题。可以预言, 植物修复将成为一种应用广泛、环境良好和经济有效的修复铅污染土壤的方法。参考文献：[3 ] 陈怀满等. 土壤- 植物系统中的重金属污染[M] . 北京: 科学出版社, 1996.[4 ] Nriagu J O , Acyna J M. Quantitative assessment of worldwide contamination of air , water and soil by trace metal[J ] . Nature , 1988 , 333 : 134～139.[5 ] Kabata - Rendias A , Rendias H. Trace elements in the soil and plant [M] . Florida CRC Press , 1994.[6 ] 潘如圭, 宋佩扬. 汽车尾气中铅对蔬菜污染的研究[J ] . 江苏环境科技, 1998 , 11 (3) : 9～11 , 28.[7 ] 管建国, 潘如圭. 蔬菜铅污染状况及其防治对策[J ] . 南京农专学报, 1998 , 14 (3) : 22～27.[8 ] 彭珊珊, 石燕. 茶叶中的铅[J ] . 广东微量元素科学, 1998 , 5 (6) : 32～33.[9 ] 沙拉麦提, 沙达提. 儿童的铅接触及危害[J ] . 新疆环境保护, 1996 , 18 (1) : 36～38.[10 ] Wheeler P. Leach repellent [J ] Ground Engng , 1995 , 28 : 20～22.[11 ] USEPA. Engineering Buttetin : Technology Alternatives for the Remediation of Soils Contaminated with Arsenic ,Cadmium , Mercury and Lead [M] . U S Envionmental Protection Agency. Office of Emergency and RemedialResponse , Cincinnati . OH. 1996.[12 ] Evando C R , Dzombak D A. Remediation of metals - comtaminated soils and groundwater . Technology Evalua2tion Report , TE97 - 01 [ R ] . Pittsburgh P A. 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表观遗传学，包括组蛋白共价修饰(covalent histone modification)、DNA甲基化修饰(DNA methylation)、RNA甲基化修饰(RNA methylation)、基因组印记(genomic imprinting)、基因沉默(gene silencing)、RNA编辑(RNA editing)及非编码RNA(noncoding RNA)等，是 指在核苷酸序列不发生改变的情况下，生物表型或基因表达发生了稳定的可遗传变化 。 RNA甲基化 作为表观遗传学研究的重要内容之一，是指发生在RNA分子上不同位置的甲基化修饰现象， 6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A) 和 5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine，m5C) 是真核生物中最常见的两种RNA转录后修饰。RNA甲基化在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解等方面可能扮演重要角色。 相对于DNA甲基化，RNA甲基化更加复杂、种类繁多、普遍存在于各种高级生物中。已知绝大部分真核生物中，mRNA在5’ Cap处存在甲基化修饰，作用包括维持mRNA稳定性、 mRNA前体剪切、多腺苷酸化、 mRNA运输与翻译起始等。而3’ polyA发生的修饰有助于出核转运、翻译起始以及与polyA结合蛋白⼀起维持mRNA的结构稳定。但是这些修饰只发生mRNA的头部和尾部，关于RNA的内部修饰（internal modification）在许多种类的RNA中都有发⽣。无论是mRNA还是lncRNA，都大量存在m6A修饰。m6A能够加速mRNA前体的加工时间，加快mRNA在细胞中的转运速度和出核速度。主要学习研究较多的m6A。RNA的m6A甲基化⼀共有大三类酶参与： Writers、 Erasers和Readers ，需要相关研究的可以学习相关文献。 检测m6A的方法非常多，如包括MeRIPseq、 miCLIP-seq、 SCARLET、 LC-MS/MS等。2012年之后，两篇发表于Nature和Cell上的论⽂可以说是第⼀次从转录水平上，大范围高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平（Dominissini 2012和Meyer 2012）。这两篇独立发表的论文采用的 核心方法就是 将m6A抗体与带有m6A的mRNA片段相结合 后进行高通量测序 。通过对下机数据的分析，来鉴定mRNA上m6A程度较高的区域，分辨率约为100nt。这种方法我们称之为MeRIP-seq（ me thylated R NA i mmuno p recipitation sequencing）或m6A-seq。 MeRIP-seq建库步骤 ： 1. 提取total RNAs，并用Oligo-dT磁珠对total RNAs带有polyA的mRNA进行富集（通常要求Total RNA 300ug，人鼠可以做微量2ug 但结果可能会出现map率低dup率高 建库步骤与常量也有区别）； 2. 用磁珠进行富集，得到带有polyA的mRNA。之后加入片段化试剂，将完整的mRNA进行片段化。或者使用超声波仪直接进行片段化； 3. 将片段化后的RNA分成两份。⼀份加入带有m6A抗体的免疫磁珠，对含有m6A甲基化的mRNA片段进⾏富集。另⼀份作为control，直接构建类似常规的转录组测序文库（这一步就是IP步骤，片段化程度、抗体抓取效率都会影响到后期实验结果；这里的control通常称为Input）；4. 对m6A抗体免疫磁珠进行富集，带有m6A的mRNA片段进行回收后，按照转录组的建库流程构建常规的测序文库； 5. 分别将构建好的2个测序文库，即m6A-seq library和RNA-seq library分别进行高通量测序。测序平台保持一致，推荐Hiseq X ten或Novaseq； 6. 对下机数据进行生物信息学分析，对发生m6A甲基化程度较高的区域进行peak calling。由于不能做到单个碱基的分辨率，所以只能对大致的区域进行分析。从下图中我们可以发现，与右侧常规的转录组测序结果相比，在基因上有两处区域存在非常明显的高甲基化峰； 7.接下来会进行一些常规分析，如peak区域基因注释，差异peak分析。 以上就是关于m6A-seq的标准步骤，现在是不是对m6A-seq有了一个非常直观的认识呢？ 再次强调下，这种测序方法只能鉴定高甲基化的区域，并不能做到单碱基的分辨率。 思路1 老数据挖掘 第一步：先从原有的转录组数据中，挖掘到差异表达的甲基化酶； 第二步：对挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等进⾏qPCR验证，并进行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平发生改变； 第三步：在细胞（动物模型可选）中对这些酶进行敲低和过表达，进行常规的qPCR和WB检测相关酶表达情况，并用LC-MS/MS法检测RNA整体m6A水平； 第四步：继续对这些敲低和过表达的细胞进行转录组测序/小RNA测序或表达谱芯片/小RNA芯片，分析哪些基因出现差异表达变化和可变剪切变化； 第五步：找到甲基化酶调控的靶基因，进行敲低和过表达，看甲基化酶缺陷的细胞或动物模型表型能否补救； 第六步：在确定上一步靶基因确实受到甲基化酶调控后，对靶基因上的motif进行点突变后进行验证； 第七步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。 思路2 研究甲基化修饰差异基因 第一步：直接进行m6A-seq和转录组测序，找到时间顺序或差异表达的基因并用qPCR、 WB等⽅法验证，此外找到m6A有差异的基因； 第二步：对甲基化酶进行敲低和过表达，检测RNA整体的m6A水平，之后可进行转录组或小RNA测序等方法检验甲基化酶敲低和过表达对mRNA或miRNA整体的影响，并着重研究第⼀步中感兴趣的m6A有差异的靶基因； 第三步：对靶基因进行敲低或过表达，是否能够对甲基化酶异常表达后的表型进⾏恢复； 第四步：对靶基因上motif进行点突变后进⼀步确认直接受到甲基化酶调控； 第五步：鉴定新型的甲基化酶（可选）。 当然根据不同的研究目的还有许多其他的研究思路，可根据自身实验设计进行延申和拓展。m6A相关SCI论文根据不同实验手段IF2~20不等，实验手段：m6A-seq、转录组测序/表达谱芯片、 LC-MS/MS 或 m6A 比色法、小RNA 测序/小RNA芯片、qPCR、 WB、敲降/过表达、靶基因验证、动物实验、临床实验/药物实验等。 学习资源来源网络，侵删。 参考学习： 1、 高通量RNA甲基化测序数据处理与分析研究进展 2、 RNA修饰检测技术 Roundtree, Ian A et al. “Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation.” Cell vol. 169,7 (2017): 1187-1200. doi: Helm, M, & Y. Motorin. "Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.” Nature Reviews Genetics (2017):275.