结核杆菌的检测方法论文

结核病是我国的常见传染病之一、近年发病率又有回升,仍是危害我国人民健康的一个重要疾病。由于结核杆菌生长缓慢、培养困难的特点和目前检测结核杆菌的方法存在种种不足,寻找一种快速、准确、敏感、方便和实用的结核杆菌检测方法仍是一项重妥课题。 我们合成了一对长20bp的引物,使用华美生物工程公司的叹,aq酶,在69’C的条件下退火并延伸,以二步法扩增一段长123bp的结核杆菌特异的重复DNA序列,用于检铡洁核杆菌。这段123bp的DNA片段中有一个sall酶切位点,有助于鉴定PCR产物的特异性.我们的实验结果证明该PCR方法能从人型结核杆菌,牛型结核杆菌中扩增出特异的123bpDNA片段,并为Sall酶切成二段.从堪萨斯分枝杆菌,胞内分枝杆菌等非结核病致病菌中不能扩增出123匕pDNA片段,显示该方法对结核病致病菌有较好的特异性,该方法能用于检测各种临床标木中极微量的结核菌

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结核杆菌与麻风杆菌是分枝杆菌属中的主要病原菌。 结核杆菌菌体细长略带弯曲，有分枝生长趋势。菌体含脂量高，与其抗酸特性、抵抗力特性、致病性与免疫性等都有密切关系。该菌营养要求高，生长缓慢，形成“菜花状”菌落。 一、结核杆菌检验程序 结核病人病灶中查到结核杆菌，是病原学诊断的重要依据，根据感染部位不同，可采集病人的痰、尿、粪便、脑脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序进行检验。 二、结核杆菌培养特性 1. 液体培养基（苏通氏培养基、小川培养基、血清酸性培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理（即酸碱处理，可液化标本，也可杀死杂菌，还可浓缩集菌）后接种液体培养基，35℃培养1-2周，由于表面生物，可在培养基表面表成污灰、干燥、有皱褶的菌膜。 2. 固体培养基（改良罗氏培养基、丙酮酸钠培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理后，接种固体培养基，37℃培养2-4周，在培养基表面可形成乳白或米黄色、不透明、粗糙颗粒状或节状堆聚的菌落，呈现“菜花状”。 3. 结核杆菌快速培养检测方法：无菌手续将前处理后的材料涂片，置液体培养基中，35℃恒温箱CO2培养箱内培养，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色镜检，可快速获得结果。 三、齐~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法【原理】 结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核杆菌及其他分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。【材料】 1. 结核病人痰液：采取清晨第一口粘痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。 2. 抗酸染色液 3. 载物玻片、玻片夹、酒精灯、腊笔等。【方法】 1. 无菌手续采取痰液涂片，自然干燥，火焰固定。 2. 用腊笔将涂面局部隔开，滴加石炭酸复红染液，酒精灯上加热至出现蒸气。切勿沸腾，亦不可使染液干涸。如有干涸的趋势，应及时补加染液。持续染色5-8分钟，待冷后流水漂去多余的染液。 3. 用3%盐酸酒精清脱色，脱至涂面无色为止，约1-3分钟，自来水冲洗。 4. 滴加吕氏美兰染液复杂30秒~1分钟，水洗。自然干燥或吸干后油镜检查。【结果】 1. 结核杆菌呈现细长，略有弯曲的红色菌体，有的可表现出分枝特征，有的菌体表现有多数浓染颗粒。结核杆菌大多分散排列，亦可以见到有纵行条索状排列。 2. 涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要每毫升痰液内含菌量至少应有500个以上，甚至需达到5万以上。故材料多进行浓缩集菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染色标本片观察中，不一定每个视野都能看到结核杆菌。 3. 结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、球状颗粒，亦称Much颗粒。 4. 标本已经高压灭菌处理，不影响染色结果，也保证操作者的安全。 四、荧光染色法 此系用金胺荧光素染扩酸性细菌的方法，简便易行，但不具特异性。金胺染色法有多种、现列于后表，可选择使用，应用荧光显微镜检查结果。 五、结核杆菌毒力试验——动物试验法 【材料】 1. 动物：体重200~250克豚鼠2只 2. 结核杆菌培养物或结核病人检验材料（痰、尿、粪、腹水等材料经浓缩集菌） 3. 注射器及消毒用材料等。【方法】 1. 选取结核菌素试验为阴性的豚鼠两只。 2. 吸取结核杆菌悬液或病人检材，注入豚鼠腹股沟皮下 3. 注射后每周定期检查一次，观察豚鼠腹股沟淋巴结是否肿大，局部变硬，化脓及体重减轻、体温升高等症状。 4. 给豚鼠作结核菌素试验，是否出现阳性结果。 5. 6周后，将豚鼠进行解剖，观察淋巴结是否肿大，有无干酪性病变，肝、脾、肺等是否肿大，表面有无灰白色结节病灶，取可疑病灶进行涂片染色镜检和分离培养。若为阳性结果，可报告“动物接种后××天查到有结核菌感染”。如无症状及病变者，可报告为阴性。 六、结核杆菌浓缩集菌法（以处理痰标本为例）【材料】 结核病人24小时痰液，细口瓶，酚红液、汽油，NaOH，无菌生理盐水等。【方法】(一)漂浮法： 1. 取24小时痰液15毫升，装入细口瓶内，加入2倍量摇匀，高压灭菌或煮沸20—30分钟杀菌。 2. 待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振荡20—30分钟，用生理盐水加至液面与瓶口齐，静置半小时。 3. 取瓶口表面油状物涂于载物玻片上，微微加热，干后再加，如此重复5—6次，至厚度适宜，烘干待冷，抗酸染色，油镜头检查。 (二)沉淀法： 1. 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高压无菌或煮沸20—30分钟后，加入酚红指示剂毫升，剧烈振荡混匀，亦可置37℃水浴消化30分钟。 2. 矫正PH为，3000转/分离心30分钟，弃去上清液。 3. 取沉淀物涂片染色镜检。若进行分离培养和动物接种，可免去高压灭菌或煮沸的程序。 附录：抗酸染液的配制 1. 石炭酸复红液：称取碱性复红4克，溶于95%酒精100毫升中成饱和液。再取饱和液10毫升与5%石炭酸溶液90毫升混匀即成。 2. 3%盐酸酒精：取浓盐酸3毫升，95%酒 97毫升混合。 3. 吕弗勒氏碱性美兰液：称取美兰2克，溶于95%酒精100毫升中，配成饱和液，取饱和液30毫升，再加入蒸馏水100毫升及10%氢氧化钾水溶液毫升即成。

一般是抽全血提取外周血单个核细胞（PBMC）提取DNA，（结核分枝杆菌是胞内寄生菌，可存在于白细胞中），然后设计合适的PCR引物直接进行扩增即可。