致病性大肠杆菌检测论文

修改:相关网站:我给你提供一些大肠杆菌的资料,比较乱,自己去整理.三凉食品这个术语没有听说过,如果可以解释一下,或许我会知道.大肠杆菌O157: H7实验诊断研究进展 大肠杆菌O157: H7感染临床表现出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。 溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题我国情况也不容乐观一、细菌培养与鉴定 1．分离培养早期培养对确定病原有重要意义。 培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。培养基：山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂 添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）添加了头孢克肟和鼠李糖（)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基四溴荧光亚甲基兰琼脂H7抗血清—山梨醇发酵培养基 增菌液：含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤新生霉素MEC肉汤月桂基胰蛋白胨肉汤加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性头孢克肟 亚碲酸钾 新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L2．免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。方法:1.增菌;2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.轻轻混合10分钟;4.将试管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重复3-5过程;7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。 Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（）84份中有23份（）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份()仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。 3．生化反应 目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）与O157有鉴别意义的生化反应见表1。MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。 二．血清学检测1．玻片凝集试验2. 胶体金免疫技术3. ELISA 4．免疫荧光技术5．胶乳凝集 6. 间接血凝分析(IEHA)7. 全自动抗原抗体检测系统8. 免疫印记法1．玻片凝集试验玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。2. 胶体金免疫技术胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。3. ELISA 大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。4．免疫荧光技术 DEFT 与Ab-DEFT： 直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。 固相荧光毛细管免疫分析此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。 样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。直接免疫荧光抗体染色 Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<2h。5．胶乳凝集 该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。 6．间接血凝分析(IEHA)该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。7. 全自动抗原抗体检测系统VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。 8.免疫印记法目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。特点是具有比较高的特异性和敏感性 。免疫检测 将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；2) 用毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；4) 用毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次； 5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ；6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。二．分子生物学检测 分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。 1．DNA探针探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。 O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素()等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。2. PCR技术 聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。PCR技术扩增体系的基本成分引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度 。TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。 4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度 mmol/L。 PCR技术循环参数PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。循环参数1．变性温度和时间 模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。循环参数2．引物退火 引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。 循环参数3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。 循环参数扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp94℃变性时间（秒） 30 30 60 6055℃复性时间（秒） 30 30 60 6072℃延伸时间（秒） 30 38 120 180一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。PCR扩增产物的检测方法PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。PCR技术类型 免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术 巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术 复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术 锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术 多重PCR技术 巢式或套式PCR技术PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用(1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物：正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’ 其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用（3）原位PCR:kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。23SrRNA基因特征：原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。应用：检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。 大肠杆菌O157: H7的检验程序 样品 增菌6小时 磁珠浓缩 可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂G染色 生化反应 血清学 毒力基因 大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据 有下列情况之一具有实验室确诊意义： 1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ；2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因；3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高；4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体．小结自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到;由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。 第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验(一)检验方法(二)培养基 (三)检验时应注意事二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。一、大肠茵群检验(一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时

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浅析鸡大肠杆菌病病因分析和预防治疗

在近十几年的肉鸡生产中，养殖户为了控制大肠杆菌及某些细菌感染，在使用饲料添加剂及治疗中盲目应用一些抗菌药物，从而导致耐药菌株越来越多，并日趋严重。事实上，因为大肠杆菌可通过菌毛将其抗药性质粒传递给其他大肠杆菌，所以，大肠杆菌的抗药性形成较快，环境中大肠杆菌耐药性菌株越来越多。

近几年来，地区实验室曾多次无菌采取疑似大肠杆菌病的本地病鸡、死鸡的心血、肝、脾、肾等病料，进行病原菌的分离、生化鉴定和药敏试验。生化鉴定结果显示，引起试验鸡只发病的病原为大肠杆菌，药物敏感性试验结果表明，本地区大肠杆菌对硫酸安普霉素、阿米卡星高度敏感，对新霉素、庆大霉素中度敏感，对环丙沙星、氟苯尼考耐药。曾经对致病性大肠杆菌敏感的药物出现了不敏感和不同程度的耐药，提示在以后的肉鸡生产中应慎用抗生素，在使用药物治疗大肠杆菌病时，要充分利用药敏试验，为鸡大肠杆菌病的防治提供科学的理论依据，并需注意交替用药，按疗程投药才能收到较好的治疗效果。

1、病因分析

免疫抑制

主要是由鸡新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、支原体等病原体的感染继发造成。往往会先破坏呼吸道和消化道的黏膜屏障系统的完整性，致使被感染鸡只不同程度地出现免疫抑制等，从而为大肠杆菌的入侵打开了门户。

免疫应激

某些应激反应可引发大肠杆菌病的发生。如接种疫苗时鸡群产生的应激反应以及免疫程序设计不当都会引起鸡群抵抗力下降或呼吸道症状，从而造成大肠杆菌感染和继发感染。

有害环境

有害的环境因素也是引起大肠杆菌感染主要原因之一。 饲养 管理差，环境污染严重，应激因素长期存在，都能促进该病的发生和流行。如气候突变、寒冷、闷热、通风换气不良、氨味过浓等应激因素，使鸡群抗病力减弱，大肠杆菌乘机侵入，引起机体发病。卫生条件差，粪便、污水、病死鸡等不能无害化处理，从而造成了鸡场环境污染严重，细菌、病毒大量存在。对消毒工作不重视或不严格，饲养密度过大，潮湿的环境又为大肠杆菌及其他致病性微生物的滋生创造了条件。

饮饲及营养状况

日常生产中，饲养方式、饮水等会直接影响到鸡群营养状况的好坏，日粮营养水平的高低以及不同营养成分之间的平衡状况等都是引发大肠杆菌感染的重要因素。如饲料营养缺乏(维生素等含量不足)、饲料霉变等，会导致鸡抵抗力下降，对大肠杆菌易感性增加，引起大肠杆菌病的发生。

2、预防与治疗

对本病的防控应坚持预防为主的原则，治疗要坚持尽早发现、尽快投药治疗的原则。

预防 措施

加强饲养管理。对饲料进行合理搭配，保持饲料、饮水清洁，及时清除粪便等。饲养密度过大的鸡群，要适度调整，保持良好通风换气，保持适宜的温度和湿度，避免骤冷骤热，以减少各种应激等诱发因素。

加强消毒。定期对场地、器具等进行彻底消毒，注重带鸡消毒。污染严重或常发病鸡场，要根据情况适当缩短消毒间隔时间，一般5～7d要进行一次彻底消毒。

疫苗接种预防。接种大肠杆菌疫苗可在一定程度上控制该病的发生，但因大肠杆菌血清型较多，其效果并不十分理想。对有条件的已发生污染的鸡场建议用本场分离的大肠杆菌菌株制作灭活菌苗进行免疫接种，效果可靠。

加强种蛋管理，建立健康的种鸡群。大肠杆菌可因种蛋带菌而垂直传播，因此，必须做好种鸡群大肠杆菌病的净化工作。

对病鸡不能留作种用，一律淘汰。另外，种蛋本身不带菌，但由于捡拾不及时或者产蛋箱卫生状况不良，使种蛋与粪便接触而受到污染。因此，孵化场还须作好对种蛋的消毒，以减少种蛋污染。在种蛋入孵前必须做好药物消毒工作。如果有条件，种蛋产出后2h内应用药物熏蒸消毒或用的过氧乙酸进行带鸡喷雾消毒，确保种蛋有最高的孵化率和健雏率。

实行全进全出制。全进全出的饲养 方法 是预防该病的有效方法，可有效避免不同日龄、不同批次鸡群间的交叉感染。同时，鸡群尽可能采用封闭式管理，这样可减少或杜绝鸡群与大肠杆菌的污染物接触，防止本病发生。

加强饲料饮水的兽医卫生监测。饲料的采购、贮存和加工等环节要加强卫生管理，防止发霉、变质，减少大肠杆菌的污染。对水井、水塔和水箱等储水设施以及输水管道要经常清理、定时消毒。

药物预防。在饮水或饲料中按预防剂量投喂抗生素可对该病的发生起到预防作用。

有效控制其他疾病。在基层服务中发现，很多其他疾病导致大肠杆菌病的继发或混合感染，如鸡沙门氏菌病、霉形体病、传染性鼻炎、传染性支气管、喉气管炎、新城疫等。对于这些疾病，目前都有较好的疫苗或药物进行预防。因此应制定适合本场的防疫程序并认真实施，尽可能防止其他疾病的发生，这样也就间接的起到预防和减少大肠杆菌病的发生。

治疗

(1)首先，病鸡隔离，及时治疗。对急性经过的不及救治的病死鸡做好焚烧掩埋及消毒工作。(2)加强饲养管理，消除诱因，加强卫生消毒。(3)合理使用抗菌药。通过药敏试验，选择高敏药物，克服盲目用药，根据药敏实验结果，合理选择和交替使用抗菌素。(4)使用中药。一般情况下，单纯因大肠杆菌感染而发病者较少，大部分都是继发或混合感染，辩症施治，合理搭配中药可以取得良好的疗效。方剂：黄连50g、黄芩60g、紫花地丁40g、赤芍30g、栀子30g、地榆60g、大黄40g、木香30g、白头翁50g、知母30g、秦皮50g、甘草30g，烘干粉碎后，按500g拌饲料100kg自由采食，连喂3d，可较好的控制病情。(5)综合措施。根据用药史及病情，全面分析药理并通过药敏实验筛选，采用中西药结合的方式综合治疗，并在饲料中2倍量投服维生素C保健粉，同时饮用电解多维，可取得较好的治疗效果。

大肠杆菌是条件性致病菌，防制该病的关键在于加强饲养管理，做好各个环节的卫生消毒，减少各种诱发因素，严格执行卫生防疫措施，创造一个良好的饲养环境。有效控制容易并发和继发该病的病原是防止本病发生的有效措施。由于各地大肠杆菌的血清型，特别是优势血清型存在差异，有效而通用的菌苗尚未出现，因此筛选地区性免疫原性优良的大肠杆菌菌株制作菌苗，乃是防制鸡大肠杆菌病及有效进行免疫预防的基础。建议有条件的鸡场，最好采用自家灭活苗，这样效果可靠，更适用于血清型复杂的地区。

参考文献：

[1]郭万柱，吴彤，陈瑶先.动物微生物学[M].四川成都：四川科学技术出版社，1997.

[2]丁红雷，王豪举，杨红军.鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定[J].动物医学进展，2005，(8)：111-113.

[3]刘玉涛，周伦江.闽北地区鸡致病性大肠杆菌的分离与血甭型鉴定[J].福建农业学报，2000;15(3)：15-17.

浅谈鸭曲霉菌性肺炎的临床症状、剖解和治疗

鸭曲霉菌病，又称鸭曲霉菌性肺炎，主要是由烟曲霉等真菌引起的鸭呼吸道传染病。其特征是在呼吸器官组织中发生炎症，尤其是在肺和气囊出现灰黄色的结节，胸腹部气囊也可能有霉菌斑。此病主要发生于雏鸭，多呈急性经过，发病率高，可造成大批死亡，成年鸭多为散发。2013年5月罗山县某鸭场饲养的肉鸭发生了一起以肺和气囊出现灰黄的结节为主要特征的传染病，根据发病情况、临床症状、尸体剖检及实验室检查，初步确定为鸭曲霉菌病，并结合病情，给予药物治疗，基本控制了病情。

1、发病情况

该鸭场饲养的5 000只樱桃谷肉鸭，在16～18日龄起开始发病，最初每天发病10～20只，后每日发病达30～50只，每日有15～20只鸭死亡，全程共发病约1 800只，死亡516只，发病率36%，病死率。在发病初期，养殖户认为是大肠杆菌病，并使用抗生素治疗，但不见效果。

2、临床症状

患鸭病初精神不振，眼半闭，羽毛松乱无光，食欲减退或废绝。随病情发展，病鸭气喘、呼吸困难、加快，胸膜部明显煽动，渴欲增加，嗜睡，常呆立或伏卧在地，气喘，口腔和鼻腔流出浆液性分泌物，粪便稀薄，呈白色或绿色，急剧消瘦，出现死亡。

3、剖检变化

主要病变在肺和气囊，肺充血、切面流出红色泡沫液，肺实质中有大量大头针帽或小米粒大小的灰黄色结节，有的在胸部气囊也可见，病程稍长的鸭肺部结节融合成更大的黄白干酪样结节，结节切面呈明显的层状结构，气囊增厚、混浊，肝脏轻度肿大，肠粘膜充血，有的可见腹膜炎。

4、实验室诊断

取肺病灶的霉菌结节或霉菌斑少许，涂于载玻片上，加10%氢氧化钾溶液1～2滴，混匀透明后，加盖玻片，在高倍镜下观察，可见有分枝和横隔的曲霉菌菌丝及孢子。

5、治疗

立即更换新鲜的饲料，更换垫料，并把垫料下的土铲去一层，同时，配合中草药治疗。

方组：升桔梗260 g、蒲公英500 g、苏叶500 g、枇杷叶15 g、知母20 g、金银花30 g。上药共煎汤得1 000 ml(1 000羽雏鸭1 d用量)，拌料内服，3次/d，另外在饮水中加高锰酸钾。同时，对病重雏鸭进行特殊护理，用滴管滴服上述药液，2次/d， ml/次。鸭群按以上方法治疗5 d后症状逐渐消失，7 d后停止用药，但是仍有个别病重鸭死亡。

6、体会

曲霉菌在自然界广泛分布，一般最常见而且致病性最强的为烟曲霉菌，其孢子在自然界分布较广泛，常污染垫草及饲料，除此之外，其他曲霉菌也可引起感染，如黄曲霉、黑曲霉及构巢曲霉等。曲霉菌对外界具有显著的抵抗力，干热120℃经1 h、煮沸5 min，方可杀死。消毒剂，如，福尔马林、水杨酸、碘酊等需经1～3 h，方可灭活。霉菌孢子可随空气传播，健康鸭通过吸入含有霉菌孢子的空气或采食染菌饲料，经呼吸道或消化道感染。在种蛋孵化过程中，霉菌还可穿透蛋壳而使初生鸭感染。因此，防控曲霉菌病的综合措施：(1)加强饲养管理。此病目前还没特效治疗办法，重在预防，特别要注意鸭舍的通风和防潮湿。(2)搞好环境卫生，及时清理鸭粪，更换垫料，不垫发霉的垫料。(3)加强饲料贮存和保管工作，不喂已霉变的饲料。(4)鸭舍、饲槽、饮水器等器具要定期消毒。(5)喂料时要少喂勤添，避免料槽中饲料积压。(6)如果鸭群已被污染发病，病鸭要及时隔离，清除垫料和更换饲料，鸭舍要彻底消毒。

试谈犬皮肤病的诊断

1发病情况

犬的皮肤病病因复杂，种类繁多，防治难度较大，其中一些还可传染给人。凡能惹起犬皮肤瘙痒、脱毛、结痂和皮肤异常变化的疾病统称为皮肤病。如何进步治愈率，缩短治疗周期，降低复发率，是宽广宠物医护人员十分关注的问题。犬皮肤病一年四季均可发作，但以夏、秋季多发，冰冷的冬季少发。经过对109例皮肤病犬的 总结 ，发现犬皮肤病主要为螨病(62例，占)和真菌性皮肤病(32例，占)，且大多数还是螨虫和真菌的混合感染性皮肤病。

螨病中常见的螨虫有蠕形螨、疥螨和耳痒螨，真菌性皮肤病主要为小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌感染;此外，犬皮肤病中尚有过敏性皮肤病(5例，占)、营养缺乏性皮肤病(4例，占)等。犬皮肤病是临床常见病，病因复杂，种类繁多，防治难度较大，一些还是人兽共患。2012年以来，笔者曾先后接诊犬皮肤病75例。犬皮肤病一年四季均可发作，但以夏季、秋季多发，冰冷的冬季少发。47例皮肤病中，螨病28例，占，真菌性皮肤病19例，占。大多数是二者混合感染。螨病中，常见蠕形螨、疥螨和耳痒螨，真菌性皮肤病主要为小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌感染。

2病症

病原为耳痒螨，主要寄生于犬耳道内，有时也爬到身体其他部位惹起局部损伤，有高度传染性。临床表现为耳道发炎、充血、耳道内有多量红褐色或灰白色分泌物，并有腥臭味，耳壳内侧潮红糜烂，犬不时抓耳挠腮，或用头磨蹭空中或笼壁，体表散布拇指盖大血痂并构成脱毛区。犬皮肤病普通临床表现为剧痒、脱毛、结痂、皮肤肥厚以及患部呈现红斑、丘疹等，病症相似。要做好鉴别诊断。

蠕形螨病

由犬蠕形螨寄生于犬皮肤的毛囊和皮脂腺内惹起。正常情况下，犬体表也有少量蠕形螨存在。当机体应激或抵御力降落时，大量繁衍，引发疾病。患犬病初表现颜面两侧皮肤潮红、充血。

继之脱毛并构成许多皱褶，然后扩散到额部、背部、胸腹下以致全身。病部有1～5个小的和周围界限明白的红斑状病变，痒感不剧烈。严重时，身体大面积脱毛，浮肿，呈现红斑、皮脂溢出和脓性皮炎，瘙痒。

疥螨病

本病病原体为犬疥螨，传染性较强。主要经过接触感染，过度拥堵、暗淡、潮湿等较差的卫生条件会加剧疾病的发作和展开，人接触病犬也可感染。检查发现，虫体主要寄生于耳尖外侧、尾根、脚爪、口周围及眼圈等皮薄毛稀的部位，病变也多发作于此，严重者可扩散至全身。表现剧痒，不时抓挠啃咬，患部脱毛、结痂，耳壳边缘、尾根、脚爪处皮肤增厚，密布糠麸样厚痂。

根据病史和奇痒、脱毛、结痂等临床病症可树立初步诊断。确诊用皮肤病诊断液，方法同蠕形螨病。犬疥螨呈宽卵圆形，雌虫平均大小约为380μ×270μ，半透明，白色，体表覆以相互对等的细毛;雄虫平均大小约为220μ×170μ，其外形同雌虫相似。

耳痒螨病

根据病史和临床病症可树立初步诊断。确诊也可用皮肤病诊断液，方法如下：用掏耳勺刮取耳道分泌物，置于载玻片上，滴加诊断液2～3滴，混匀后加盖玻片，压薄后镜检。若被感染，则虫体和虫卵明晰可见。痒螨呈椭圆形，足体凸出。雄虫第4对足不兴隆，不能伸出体边缘，比第3对足短3倍：雌虫第3、4对足无吸盘。

皮肤癣菌病

又称癣，是由皮肤癣菌侵袭毛发、爪和皮肤等角质组织惹起的真菌性皮肤病，病原体主要有犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌等。潮湿、暖和的气候，拥堵、不洁的环境以及缺乏阳光映照等是惹起本病的主要诱因。患犬大面积严重脱毛、瘙痒，体表散布红色丘疹，脱毛区掩盖油性厚痂，刮去痂皮暴露潮红或溃烂的表皮，严重者构成溃疡。随着病程延长，患部呈现色素冷静，毛根易脱，毛干易断。

过敏性皮肤病

如湿疹、荨麻疹等。湿疹是表皮和乳头层由致敏物质所惹起毛细血管扩张和渗透性增高的一种过敏性炎症反响，临床上以患病皮肤发作红斑、丘疹、水疱、脓疱、糜烂、结痂及鳞屑等皮损，并伴有热、痛、痒病症为特性。荨麻疹是皮肤乳头层和棘状层血管渗出液增加的一种过敏性疾病，临床以患病皮肤突然发作许多圆形或扁平的疹块和疾速消散，并伴有皮肤瘙痒为特性。惹起犬过敏的要素有昆虫的叮咬、暗淡潮湿的环境、烈日暴晒、刺激性药物、营养失调、代谢紊乱以及机体内在的一些过敏因子等。

营养缺乏性皮肤病

本病有一定群发性，多由饲养管理不当、消化吸收障碍招致某些维生素、微量元素缺乏而惹起。如犬食物单一，或长期饲喂高蛋白、高脂肪食物，或饲喂蜕变食物等可构成维生素C、维生素B以及硒、钙等缺乏。患病犬被毛干枯，毛易断易脱，皮肤表面有豆粒大或拇指盖大小的出血斑，皮屑增加，痒感不明显。

其他

包括由葡萄球菌等惹起的细菌感染，由犬瘟热病毒感染呈现的硬脚垫病，角质层下脓疱性皮肤病，维生素A过多症，毛细血管扩张症，溢脂性皮炎，中毒性皮炎，自体免疫性皮肤病等。

3治疗

根据皮肤病盛行特性，采取“彻底检查，洗浴去痂、重复用药、辨证施治、消弭病因、消毒环境”等综合性防治准绳，中止平面式用药(体内、体表、环境)，根据病情不同，采用“轻则治其标，重则治其本”的方法，治疗务须彻底，以防复发。

伊维菌素注射液

该药为广谱驱外寄生虫药，临床上主要用来治疗疥螨、蠕形螨、耳痒螨惹起的传染性皮肤病，对虱子、跳蚤和蜱也有防治作用。犬按～ ml/kg体重量·次，皮下注射，1次/周。

癣螨净擦剂

该药为纯中药配方，无毒反作用，具有杀螨、抗菌、止痒以及除虱、灭蚤等作用。临床上主要用来治疗疥螨病、耳痒螨病、蠕形螨病、真菌性皮肤病、过敏性皮炎、湿疹等惹起的皮肤病。该药外用，于患部涂擦，1～2次/d。耳痒螨病、中耳炎时，应向耳道内滴入药液3～5滴，再清算干净，1次/3d。

癣螨净浴液

该药也系纯中药配方，无毒反作用。临床上主要用来治疗晚期全身性、顽固性皮肤病，如疥螨病、蠕形螨与真菌混合感染性皮肤病、真菌性皮炎、脓皮病、过敏性皮炎、湿疹、脱毛症及自咬症等。该药外用，用前先用温水稀释100～200倍，将患犬药浴8～10 min。另外该药还可用于环境、宠物用具的消毒。

癣螨净注射液

药具有杀螨抑菌功用强、作用耐久等特性。临床上主要用于治疗各种螨虫、真菌惹起的传染性皮肤病。特别对蠕形螨、真菌混合感染的顽固性皮肤病、脓皮病有特效。剂量：005～ ml/ kg体重量·次，皮下注射，1次/7d。

益康唑霜

该药为广谱抗真菌药，对皮肤真菌有杀菌作用，临床上主要用来治疗犬的皮肤、毛发、爪的真菌病。该药外用，于患病涂擦，2次/d。

灰黄霉素

其能有效抑止小孢子菌、毛癣菌等真菌，临床用来治疗由真菌惹起的皮肤病。剂量：20 mg/ kg体重量·次口服，连用30 d。

受体阻断药

本类药物主要有盐酸苯海拉明、盐酸异丙嗪、扑尔敏、扑敏灵等，能选择性地对立H1受体所致的血管扩张作用，临床上主要用来治疗各种皮肤、粘膜的过敏反响，如湿疹、荨麻疹等。另外，维生素C、糖皮质激素类(如地塞米松)、钙制剂、麻黄碱等也有抗过敏作用，是防治皮肤病常用的辅助药物。苯海拉明，剂量：～1 mg/kg体重，肌肉注射。内服：30～60 mg/次。