中国预防医学杂志熊敏简介

尚兵朱立*任天山李家熙*

（卫生部工业卫生实验所，北京100088）

（*国家地质实验测试中心，北京100037）

摘要用固体径迹探测器对14个城市1524间房屋进行了氡浓度测量，氡浓度均值为（）Bq·m-3。其中有92间房屋中氡浓度超过100Bq·m-3,12间房间中氡浓度超过200Bq·m-3，分别占测量总数的和。对可能引起室内氡浓度增高的因素，如土壤中天然放射性核素的背景、建筑材料、土壤地基、通风、地热水应用以及地质裂隙带等因素进行了分析，对降低和控制室内氡浓度的方法进行了探讨。

关键词室内氡浓度影响因素控制对策

1前言

氡普遍存在于人类的生活空间。室内氡对健康的影响已受到社会普遍关注。1989年国际原子能机构向各成员国政府建议开展“人类环境氡调查”的研究工作。到1997年美国已测量了1100万间房屋中的氡浓度、英国测量了35万间房屋中的氡浓度，这是迄今为止所进行的最大规模的室内环境氡的研究。美国的目标是到2000年争取对2000万间房屋（约占应测房屋的25%）进行氡的检测；对75万户房屋进行降低氡浓度的改造，对50万户新建房屋采取防氡措施。英国卫生署和环境署联合发表的《国民健康》倡议中把减少室内氡作为主要目标之一。我国卫生部1996年颁布了《住房内氡浓度控制标准》，并制定了配套的《地下建筑氡浓度控制标准》、《地热水应用中的放射性防护标准》和《建筑材料放射性限值标准》等国家标准。

随着经济的发展和住房制度的改革，我国居民的住房条件和房屋结构发生了巨大的变化，人们对居住环境的空气质量，特别是室内氡对健康影响的关心日益增加，促使放射防护工作者对我国室内氡的普遍水平、来源和潜在危害进行研究和评价。近几年我们用LIH固体径迹探测器对我国部分城市和一些热点地区室内氡进行了测量，对可能引起室内氡浓度增高的因素，如土壤226Ra的含量、土壤地基、通风、建筑材料、地热水应用以及地质裂隙带等因素进行了分析，对降低和控制室内氡浓度的方法进行了探讨。

2材料与方法

氡探测器

采用LIH型α径迹探测器（Alpha Track Detector,ATD）测量室内氡的浓度。探测装置由扩散杯、CR-39径迹片和滤膜三部分组成，通过使用不同渗透率的滤膜控制扩散杯的空气交换率，阻止氡子体和220Rn进入。探测器在核工业总公司第六研究所标准氡室进行刻度。对222Rn的刻度系数（CF）为·cm-2（kBq·m-3·h）-1，不确定度为±5%。径迹片的平均本底径迹密度为·cm-2。

测量方法

径迹片使用前保存在镀铝膜塑料袋中，到现场后取出，固定在扩散杯的底部，待滤膜安放好后，将探测器放在选定的测量位置，记录放置时间（t1）。暴露一定时间后，收回探测器，取出径迹片，记录回收时间（t2）。径迹片送实验室蚀刻、测读。每片径迹片用定倍率400的光学显微镜人工读数。每个视域面积为，每片测读60个视域，全部扫描面积为。根据CF值和径迹片上径迹的净计数计算被测场所的222Rn平均浓度。

计算方法

222Rn浓度的计算公式如下：

地球化学环境：农业·健康

式中：c（222Rn）表示暴露t期间被测场所的平均222Rn浓度（Bq·Im-3）：N222Rn和NB分别表示222Rn暴露片和本底片的径迹密度（Tr·cm-2）；CF为探测器对222Rn刻度系数［Tr·cm-2（kBq·m-3·h）-1］;t为暴露时间，t=t2-t1（h）。

3结果与讨论

我国部分城市室内氡浓度

我国14座城市居民住宅内氡浓度的测量结果见表1。为了便于比较，探测器主要布放在平房或楼房的一层（不包括地下室），暴露时间为3～6个月。1524间房屋中氡浓度的算术平均值为（±）Bq·m-3；几何平均值为·m-3。室内氡浓度高于平均值的城市有8个，分别是上饶、平凉、广州、珠海、黄山、青岛、拉萨和北京。其中上饶最高（·m-3），海口最低（·m-3）。有92间房间中氡浓度超过100Bq·m-3，占测量总数的，有12间房间中氡浓度超过200Bq·m-3，占测量总数的。室内氡浓度的最高值为596Bq·m-3，出现在上饶的平房内。

表2列出了国内外采用类似累积测量技术进行室内氡浓度调查的结果。与其他国家比较，我国14个城市室内氡浓度均值（·m-3）比瑞典的国家均值（108Bq·m-3）低；比英国、日本和澳大利亚的均值高，与美国最近报道的42Bq·m-3的国家均值非常接近。但与我国20世纪80年代末部分省市氡浓度的调查结果（24Bq·m-3）及北京（37Bq·m-3）[10]、深圳（34Bq·m-3）的相关调查相比要高。引起这一差异的原因可能与调查选择的房间不同有关，本次着重测量平房和建筑物低层房间的氡浓度，而上述所列调查为得到地区代表值选择了不同类型和不同楼层的房间。另外生活方式的改变如空调普及后室内自然通风率的降低以及使用较高天然放射性核素含量的掺渣建材、石材装修等也可能导致室内氡浓度增高。

氡易析出区（Radon-Prone Areas）

目前对于居室内的氡浓度各国所采用的行动水平并不一致，除考虑调查的氡水平年均值外，也考虑到地区的分布、国家政策及经济能力等因素。我国《住房内氡浓度控制标准》将房屋分为现有和未来新建两种，氡浓度的控制水平分为200和100Bq·m-3EECRn。假设室内平衡因子为，相应氡浓度分别为400和200Bq·m-3。从本调查看，14个城市室内氡浓度的均值为·m-3，中位值为·m-3，约为现有房屋控制水平的十分之一。

为了有效地控制和治理室内氡，有人提出了氡易析出区的观点。美国根据土壤铀含量和地质岩性绘制了氡潜势图，铀含量＞50×10-6为氡的高潜势区，照此划分美国全国约有1/3的地区被确定为具有高氡潜在地质背景区。也有人建议参考地质资料结合实测结果，将有较大百分数的房屋氡浓度超标地区作为氡易析出区。如英国将室内氡浓度超过国家制定行动水平（200Bq·m-3）的房屋的百分数大于1%的地区作为氡易析出区。对于氡易析出地区要求增加检测密度，如美国环境保护署EPA建议氡易析出地区每栋房屋应该进行氡气测量，氡浓度超标的房屋建议房东采取降氡措施。

从本次调查结果来看，仅有上饶地区的1间房屋氡浓度超过我国规定的控制水平（400Bq·m-3），占上饶地区测量总数的。但值得注意的是有2个城市（上饶和珠海）分别有＞10%和＞1%的房屋中氡浓度超过了100Bq·m-3和200Bq·m-3，已接近和达到英国氡易析出区的水平。由于本次调查样本量小，而且选择的是平房和建筑物低层等氡浓度可能高的空间，也没有包括地下室、煤渣砖建筑物、窑洞等高氡房屋的测量结果，因此所给数值的误差较大。对于百分数较高或超标地区还需要深入研究，鼓励当地居民测量居住房屋中的氡浓度，增加测量的样本数，从而得到较为可靠的地区代表值。

表1中国部分城市室内222Rn浓度（Bq·m-3）

注：表中Xm示算术均值；SD示标准差；Min示最小值；Max示最大值；N为氡浓度超标房间数；P为氡浓度超标房间的百分数。

表2一些国家和地区室内222Rn浓度（Bq·m-3）

注：表中Xg示几何均值，其他符号同表1。

室内氡浓度增高的可能因素

对调查发现的高氡房屋进行了较仔细的分类测量，对引起氡浓度增高的原因进行了探讨，以下是引起室内氡浓度增高的可能因素的分析。

土壤中226Ra含量与室内氡浓度的关系

226Ra是222Rn的直接母体，广泛分布在自然界的岩石和土壤中，与岩石的岩性有关，其中花岗岩中226Ra的含量最高，尤其是壳源型重熔花岗岩，其次是页岩、石灰岩和砂岩。土壤中226Ra含量相当大程度上受控于其母源物质。参照全国土壤调查结果，对成土母质以花岗岩为主的青岛、珠海和以砂页岩为主的海口等地区室内222Rn浓度进行了3个月以上的累积测量。结果见表3。从初步得到的结果看，室内空气中222Rn浓度与土壤226Ra的含量密切相关（r=），两者相关关系如下：

地球化学环境：农业·健康

表3土壤226Ra含量和室内222Rn浓度

房基土壤的贡献

表4是在建筑物周围测量到的土壤氡析出率和该建筑物内的222Rn浓度。根据文献［19］提供的参数，用实际测量的土壤氡析出率估算了底层房间中的222Rn浓度和地基土壤222Rn进入室内的比率。结果表明，室内222Rn浓度与土壤氡析出率密切相关（r=）。建筑物地基及周围土壤是底层房间中222Rn的最主要的提供者，其进入率约为50%。

表4室内222Rn浓度的实测值与估算值

表5是甘肃陇东地区窑洞中222Rn浓度的测量结果。结果表明，窑洞内平均氡浓度为170Bq·m-3，为该地区其他类型房屋的倍，其中有12间窑洞超过200Bq·m-3，有2间窑洞超过400Bq·m-3，分别占测量总数的和。该地区土壤中铀和镭的含量（·kg-1和·kg-1）在正常本底范围内，由于建筑物直接取材于孔隙度大、析出率较高的黄土，建成后基本不装修，地面和墙体为裸露的土壤，加上窑洞结构不利于通风，所以窑洞中的氡浓度比普通房屋高很多。

表5窑洞中的222Rn浓度

地质裂隙带的影响

在铀本底和地热水氡水平相近地区，显然建筑在地质裂隙带上方房屋中的氡浓度明显高于非裂隙带（表6），两者之比从几倍到几十倍。较高的放射性核素背景是土壤氡的源头，而地质裂隙又为地下深层氡向地面转移提供了通道。本次测量的最高值为892Bq·m-3，已超过我国规定的室内氡浓度限值（400Bq·m-3）2倍以上。室内氡浓度与地质构造有明显关系。

表6建筑在地质裂隙带上方房屋中的222Rn浓度

煤渣砖的使用

目前在我国使用的建材中对室内氡的贡献较大的是放射性核素含量较高的煤渣砖或掺有粉煤灰的水泥砌块等材料。这类建筑材料始于20世纪70年代末期，主要分布在浙江、江西、安徽、湖南、湖北等省。表7是在上饶、黄山和成都3个地区煤渣砖建筑物中的测量结果。上饶地区煤渣砖房屋中的氡浓度的均值为·m-3，是普通房屋（·m-3）的倍。黄山地区煤渣砖房屋中的氡浓度的均值为·m-3，是普通房屋（·m-3）的倍。两个地区分别有8%和1%煤渣砖建筑物超过了400Bq·m-3氡浓度控制限值。由于用煤渣砖建筑的房屋有一定的普遍性，因此需要加强对用高放射性核素含量的煤渣砖或类似产品建造的房屋进行监测和治理。

表7煤渣砖房屋中的氡浓度

装饰石材

我国是石材大国，随着室内装修业的兴起，美观、耐用的天然石材成为室内地面装修的主要选材之一。表8为采用不同γ辐射剂量率级别的石材装修后室内氡浓度的测量结果。不同类型的石材丫辐射剂量率是不同的，用表面7辐射剂量率高的石材装修后，房间里的氡浓度有升高的趋势。使用C类石材装修的房间中氡浓度的均值（·m-3）为该地区调查均值（·m-3）的倍。另外室内氡浓度还取决于石材的风化程度，风化程度高的石材氡更容易析出。由于调查样本数量少，这一组数值仅仅是初步的估算。值得注意是我国石材装修具有相当广阔的潜在市场，如果不合理使用很可能造成居住环境氡水平的增高。因此装修中选择放射性含量合格的建材非常重要。如北京地铁内部也采用大量石材装修，由于选用材料的放射性含量较低，加上良好的通风系统，即使修建在地下，里面的氡水平（·m-3）仍然很低。

表8石材装饰房屋中的氡浓度（Bq·m-3）

①按《天然石材产品放射防护分类控制标准》JC 分类。

地面材料及状况

同一建筑物采用不同地面材料，房间中的氡浓度也有较大差异。表9为不同地面材料房间中的氡浓度。北京市区的一些老式房屋，地面多为木地板或地砖，由于年代久长，地板的损坏程度严重，地基土壤产生的氡很容易通过地板上的缝隙进入室内，造成房间中氡的累积；而采用混凝土处理后房间（对照组）中的氡浓度有所降低。

表9使用不同地面材料房间中的氡浓度

通风

通风是影响室内氡浓度的重要因素，空调使用使得人们在炎热夏季也要紧闭门窗以保持适宜的温度。表10是在使用和未使用空调的建筑物中测量的氡浓度。数据表明：使用空调房间的氡浓度明显高于不用空调的房间，比值为～倍。随着经济的发展和人们生活水平的提高，在我国空调的普及率还会有较大幅度的增长。因此应提高公众自我保健的意识，合理使用空调，适当开窗换气，以防止氧浓度在房间里的累积。

近年来我国城市化进程很快，高层建筑的新建量居世界之首。这些新颖、美观的建筑物使城市的面貌得到了改观，但也带来了一些问题。如一些新型窗墙连体全封闭式的建筑物，窗户无法打开，只能靠中央空调换气，为了节约能源，建筑物的密闭程度很高，氡浓度随之升高。表11是对一座全封闭式建筑物中氡浓度的测量结果。结果表明房间里的氡浓度与通风量有明显关系，走廊风量较大，氡浓度的测值较低（·m-3）。房间中的风量较小，测值偏高（·m-3）。该建筑物中氡浓度的均值为·m-3，比该地区的普通建筑物中的氡浓度均值高出50%。

美国的一项研究表明，靠自然通风的旧住宅，室内外空气交换一次大约需要一个小时，相应通风率为1ach，夏季可达2ach。而较新住宅的密封性通常更好，其自然空气交换率降低到。通风率的降低，不仅使室内氡浓度提高，而且还会使其他污染物得到累积，全封闭式建筑对健康的影响应引起注意。

表10使用空调和不使用空调房间中的氡浓度（Bq·m-3）

表11全封闭式建筑物中的氡浓度（Bq·m-3）

地热水的应用

我国地热水资源非常丰富，近年来的开发利用也十分活跃。表12是在海南岛温泉旅馆、西藏地热发电站和湖北地热水理疗医院测到的结果。由于一些地热水中氡含量较高，用水过程中氡从水中扩散出来，使房间里的氡浓度明显增高。从表12结果可以看出，使用地热水后，房间的氡浓度与使用前相比提高了～倍。地热水的开发利用带来了明显的效益，其利用过程所带来的放射卫生防护问题也值得研究。

表12使用地热水房间里的氡浓度（Bq·m-3）

：使用地热水前测量的结果。]]

降低室内氡浓度可有效地改善室内空气质量，已被许多国家列为卫生保健的主要目标。从欧美的经验可以看出，建筑物选址和建造时建筑物地基防氡处理可以有效控制氡的进入。很多国家开展了建筑物降氡技术的研究，其目的是从源头上把关，修建低氡建筑物。我国房屋基数居世界之首，如果控制得当可使公众的集体受照剂量大幅度下降。因此应加快地质填图的研究，尽快绘制出全国范围的地质潜势图，使建筑商在选址时有所依据，’尽量避开高铀、镭含量的地段或氡易析出区。应开展建筑物防氡技术的研究，制定有关设计和施工标准，在不能避开高氡潜势地段的情况下，应采用密封地基或设置减压系统等防氡技术排除来自地基的氡。应加强建材市场和房屋交易市场的管理，出售的建材和住房应有放射性含量检测数据，使购买者避免因氡浓度超标而蒙受损失。对于正在使用的房屋，如氡浓度超标可采用封堵地面裂缝、喷涂防氡涂料等措施将房间中的氡浓度降下来，加强通风和使用空气净化器也可达到同样的目的。

参考文献

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【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生 病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供参考。1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应的代表性差异分析法, 见表1 。111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis , DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的差异部分作分离,克隆,序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis , cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. ( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNARDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序列片段。此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也是一个可选择的方法。114 抑制消减杂交cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppressionsubtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度靶mRNA 的灵敏度。Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的克隆。2 非特异多重引导滚环式扩增法乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步分析。自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关核酸。Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有·318 · 中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基因片段。基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准确的发现鉴别未知病毒。参 考 文 献〔1〕 Drosten C , Gunther S , Preiser W, et al1 Identification of novel corona2virus in patients with severe acute respiratory syndrome1 N Engl J Med ,2003 , 348 : 1967 - 19761〔2〕 ven den Hoogen BG, de Jong JC , Groen J , et al , A newly discoveredhuman pneumovirus isolated from young children with respiratory tractdisease1 Nat Med , 2001 , 7 : 719 - 7241〔3〕 Fouchier RA , Hartwig NG, Bestebroer TM, et al1 A previously unde2scribed coronavirus associated with respiratory disease in human1 ProcNatl Acad Sci U S A , 2004 , 101 : 6212 - 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