泛癌种基因检测论文

克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。

泛癌分析 旨在检查在不同 肿瘤 类型中发现的基因组和细胞变化之间的相似性和差异。 [1] [2] 国际努力对癌症的外 显子 组 和整个 基因组 （包括其非编码区）进行了全癌分析。 癌症基因组图谱 （TCGA） 研究网络在2018年使用 外显子组 ， 转录组 和DNA 甲基化组 数据绘制了肿瘤类型之间的共性，差异和新兴主题的综合图片[请参见 / TCGA泛癌分析]。

2020年， ICGC / TCGA全基因组泛癌分析（PCAWG） 项目发表了23篇论文，分析了38种肿瘤的全癌基因组和转录组数据 [1] 。其旗舰文件中提供了对该项目的全面概述。 [3]

还构建了跨人类癌症 的RNA结合蛋白的Pan-Cancer分析 [4] ，以探讨15种癌症类型的7,000份临床标本中1,542个RBP的表达，体细胞拷贝数改变（SCNA）和突变谱。使用功能性实验，RNA结合蛋白的全癌分析揭示了六个RBP（NSUN6，ZC3H13，BYSL，ELAC1，RBMS3和ZGPAT）在结肠直肠癌和肝癌细胞系中的致癌特性。

几项研究证明，在所有肿瘤类型中，基因组改变（意为短核苷酸变体或大拷贝数变体）与基因表达之间存在因果关系，可预测的联系。基因组状态和转录组定量数据之间的这种泛癌关系通常是有效的，并且可以用作机器学习方法的基础，从而仅从基因表达谱中预测特定基因组改变的存在。 [5]

从TCGA所做的努力获得的所有数据均可从美国国家癌症研究所的TARGET Data Matrix和Web门户ProteinPaint获得。 [6] 。

最近，为 lncRNA ， microRNA ， CeRNA 和 RNA结合蛋白 （ RBP） 的网络创建了 Pan-Cancer资源 [7] 。

来自ICGC / TCGA PCAWG项目的近800 TB数据已通过各种门户网站和存储库提供，包括 安大略省癌症研究所 ， 欧洲分子生物学实验室 的 欧洲生物信息学研究所 和 国家生物技术信息中心 （重要的公共门户网站在 上列出）。

泛癌研究旨在精确定位传导基因以及不同类型 肿瘤 之间的复发性基因组事件或畸变。对于这些研究，有必要对多个平台之间的数据进行标准化，从而在不同研究人员群体之间建立标准，以处理数据并展示结果。 Omics 数据可在短时间内在单个实验中鉴定和定量数千个分子。 基因组学 提供了有关发生的事情的信息，即发生某种事情的可能性，正在发生的事情的 蛋白质组学 和已经发生的事情的 代谢组学 。该 基因 包含可能发生的信息。这些 蛋白质 提供了正在研究的组织中正在发生的事情的信息，这些信息是在发挥功能的蛋白质，而 代谢产物 是蛋白质功能的结果。所有这些的组合给出了有关生物学系统的信息。

参考文献：

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癌症基因检测为治疗无效癌患找一线生机

个人化基因检测从400多种癌症基因精准找药

癌症精准治疗有了新进展! 癌症患者若产生基因突变导致常规用药无效，可以透过个人化癌症基因检测，依肿瘤基因突变找寻适合的癌症药物。国内已有基因检测机构，可以从肿瘤检体完整萃取出高纯度肿瘤DNA后，透过次世代定序技术(Next Generation Sequencing，NGS)依据400多个癌症基因的生长网络，精密搜寻各种基因的突变型态，从亚洲人及国际大型癌症药物资料库中系统比对分析，挑选出台湾患者适用的癌症药物。

反复化疗及手术无效大肠癌末期患者苦不堪言

一位38岁的嘉义果农沈先生，某日忽感腹胀恶心，以为是肠胃型感冒，到诊所就医治疗三个月未见好转，在妻子陪同下改到天主教圣马尔定医院看诊，经详细检查发现肿瘤已塞满大肠，并疑似转移到肝脏，最后确诊罹患大肠癌末期。在历经两次大手术切除大肠及肝脏肿瘤后，陆续接受12次的化疗跟标靶疗程，虽然每月定期回诊追踪，却仍在术后两年发现复发胰脏肿瘤，只好再度接受手术切除。折腾的治疗过程让沈先生感到失望而且苦不堪言，期待切除肿瘤后能改用更有效的药物，避免持续复发影响生活品质。

医病共同讨论癌症基因检测找一线生机

跟多数病患一样，沈先生自己上网搜寻资讯，也不断跟亲朋好友打听「什么方式可以选到比较有效的用药?」，但仍无法自行判断，于是在家人鼓励下，主动与圣马尔定血液肿瘤科林静怡医师及个管师讨论，得知透过癌症基因检测有机会找到更多药物选择，虽然此种方式目前仍有自费治疗、临床实证不足、部分药物难以取得，以及部分患者肿瘤成因特殊，导致检测无结果等诸项限制，但为找到精准药物的强烈动机，让他与家人讨论一天后就决定接受检测。

癌症基因检测治疗无效癌患新选择

林静怡医师表示，沈先生因有KRAS基因突变，限缩了可用的标靶药物种类，为扩大药物选择，安排440个癌症基因的突变检测，查出是PI3K-mTOR肿瘤讯息传递路径发生基因突变，顺利找到双标靶药物，最后跟医院专业团队配合治疗后，有效控制住病情。

癌症基因检测技术揭露了更真实的癌细胞样貌，提供治疗瓶颈新方向，满足患者找药需求。圣马尔定医院血液肿瘤科暨癌症防治中心主任萧士铨医师也提醒，癌症患者千万别轻易放弃治疗，同时家属的鼓励关怀，更是癌症患者接受积极治疗的一大动力，建议患者应把握黄金治疗期，及早接受检测，找寻新的一线生机。

基因是DNA分子上的一个功能片段，是遗传信息的基本单位，是决定一切生物物种最基本的因子;下面是我整理了基因检测技术论文，有兴趣的亲可以来阅读一下!

病毒基因的检测

【关键词】 病毒基因 检测

一 乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)测定

乙型肝炎是由乙肝病毒引起的以肝脏损害为主要临床特征的急、慢性传染病，严重者可 发展成慢性肝炎、肝硬化和肝癌。在我国，乙肝是危害人类健康的一种主要传染病。

【 参考值】

阴性 (Taqman荧光定量PCR技术)

【临床意义】

是乙型肝炎病毒感染的直接证据，是HBV有活性复制能力及具传染性的确切标志。

2.可定量检测HBV-DNA含量，为临床病情判断、疗效观察提供信息。

的出现先于其他血清学指标(如HBsAg)，可早期诊断HBV感染。

4.正常人HBV-DNA为阴性。当HBV-DNA为101～104拷贝/ml时，表明病毒复制水平低，传染性较弱;而当 HBV-DNA>104拷贝/ml时，表明病毒复制水平高，传染性强。

含量测定可为临床药物选择提供依据。

【注意事项】

1.标本可用血清或血浆，避免肝素抗凝，避免反复冻融。

2.标本室温放置不超过4小时。

3.溶血、高胆红素标本影响检测结果。

二 其他病毒DNA测定

(一)人乳头瘤病毒DNA(HPV-DNA)检查

人乳头瘤病毒是一种小的双链DNA病毒，根据核酸相关性分型已发现70余型。该病毒可以感染人的皮肤和黏摸上皮细胞，诱发细胞增生，产生乳头瘤样病变。

【参考值】

阴性 (多重核酸荧光定量PCR技术)

【临床意义】

难以用传统的病毒培养及血清学技术检测，目前主要采用分子生物技术检测HPV-DNA，灵敏度高。

2.可对尿道、阴道、宫颈脱落细胞进行人乳头瘤病毒的检测及分型，判断体内HPV感染状况。

6和11型与尖锐湿疣、喉头鳞状上皮乳头状瘤发生有关;HPV 16、18、31、32型等与宫颈癌发生相关。因此，可用于对HPV高危亚型的诊断，对尖锐湿疣、宫颈癌等疾病的诊断与筛查具有重要意义。

检测可用于考核疗效与预后。

【注意事项】

1.用无菌拭子取尿道、阴道、宫颈分泌物于无菌试管或无菌瓶中。

2.标本采集应严格按无菌操作，避免污染。并及时送检。

(二)人类巨细胞病毒DNA(HCMV-DNA)检查

HCMV是疱疹病毒科成员，人类普遍易感，多为隐性或潜伏感染。在免疫功能低下、缺陷或抑制情况下，可发生成人HCMV感染，常呈弥漫性病变，严重者甚至死亡。

【参考值】

阴性 (荧光探针杂交PCR技术)

【临床意义】

1.用于临床HCMV感染的快速诊断。

2.用于临床免疫抑制 治疗过程中体内HCMV感染的快速诊断与疗效监测。获得性免疫缺陷综合征等患者HCMV感染的诊断与疗效监测。

技术检测HCMV的敏感性高，且HCMV-DNA的出现早于临床症状或血清学标记物的出现，可早期诊断 HCMV感染。

4.妊娠早期感染HCMV可引起胎儿先天畸形，产前检测HCMV-DNA有利于优生优育。

5.连续监测巨细胞病毒的含量变化可了解病毒的复制状况，从而为疾病的早期诊断与药物疗效提供直接的病原学依据。

【注意事项】

采用EDTA抗凝全血或脑脊液标本，采集后及时送检。

(三)单纯疱疹病毒DNA(simplex herpes virus， HSV-DNA)

单纯疱疹病毒是一种有囊膜的双股DNA病毒，分为I型和II型。近年来，HSV是性传播疾病、病毒性脑炎等疾病的重要病原体。

【参考值】

阴性 (荧光探针PCR技术)

【临床意义】

1.用于检测人血清样本或体液样本中的单纯疱疹病毒并可同时分型，辅助诊断HSV感染性疾病。

I型感染主要引起口唇疱疹、疱疹性结膜炎、脑炎和皮肤性疱疹，HSV II型主要引起生殖器疱疹， HSV-DNA检测可辅助诊断上述疾病，并可用于考核疗效与预后。 【注意事项】

1.血清用无菌注射针头抽取静脉血2ml于无菌肝功管中。

2.分泌物用无菌棉拭子采集标本，女性取宫颈或阴道分泌物，男性取精液或前列腺液，将取样后的棉拭子放入无菌试管或无菌瓶中。

3.脑脊液抽取脑脊液于无菌玻璃瓶中。

(四)EB病毒DNA(EB virus，EBV-DNA)

EBV属于丫疱疹病毒科，主要经涎液传播，PCR技术可灵敏地检测出标本中的EBV-DNA，满足临床诊断、 治疗需要。

【 参考值】

阴性 (荧光探针杂交PCR技术)

【临床意义】

1.可快速检测血液、脑脊液、组织、尿液中的EB病毒，为EB病毒感染提供直接证据。

病毒临床上与鼻咽癌传染性单核细胞增多症、霍奇金病等的发病密切相关。

【注意事项】

1.检测标本可采用EDTA抗凝全血、脑脊液、咽拭子、尿液、病变组织等。

2.标本采集时严格按无菌操作，并及时送检。

三 RNA病毒测定

丙型肝炎病毒RNA(HCV-RNA)检测

丙型肝炎病毒是一种单链正股RNA病毒，引起丙型病毒性肝炎。丙型病毒性肝炎多因输血或血制品而引起，在输血者中还存在无症状的HCV携带者。

【参考值】

阴性(RT-PCR，荧光定量PCR技术)

【临床意义】

1.有助于HCV感染的早期诊断。

阳性提示HCV复制活跃，传染性强。

转阴提示HCV复制受抑，预后较好。

4.连续观察HCV-RNA，结合抗-HCV的动态变化，可作为丙肝的预后判断和干扰素等药物疗效的评价指标。

【注意事项】

1.标本可用血清或血浆，用无菌注射针头抽取静脉血2～3ml于无菌肝功管或EDTA抗凝管中送检。避免肝素抗凝，避免反复冻融。

2.标本室温放置不超过4小时。

3.溶血、高胆红素标本影响检测结果。

参 考 文 献

[1]杨振,祁自柏,李河民.病毒基因检测技术的 发展趋势. 《 中国生物制品学杂志》,2006年01期.

[2]徐丽.利用基因工程进行PHB相关基因的克隆和烟草转化[D].山东师范大学,2000年.

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