链激酶用于鸡病临床论文

  菲牛蛭中脂肪酸分析苗艳丽等［5］对广西产菲牛蛭脂肪酸提取液进行气相色谱/质谱(GC/MS)分析,共分离出19 个峰。与标准谱库对照分析,鉴定了16个组分, 脂肪酸的相对含量采用总离子流各色谱峰面积归一化法定量,结果见表1。实验共鉴定了菲牛蛭中脂肪酸的16个组分,占脂肪酸总量的97. 39 % ,其中饱和脂肪酸占，不饱和脂肪酸占。饱和脂肪酸主要有硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸等;不饱和脂肪酸主要包括油酸、11 - 二十碳烯酸等。其中含量最多的是十六烷酸，达到，其次是9 - 十八碳烯酸,含量为；11 - 二十碳烯酸含量为。菲牛蛭中所含的单不饱和脂肪酸,如9 - 十八碳烯酸和11 - 二十碳烯酸的含量高于中药蚂蟥中的含量［6］。        表1  菲牛蛭中脂肪酸的组成及含量        序号脂肪酸 分子式(甲脂)相对含量( % )13 - 甲基十三酸C15H30O21. 022十四酸(肉豆蔻酸) , 8, 12 - 三甲十三酸C17H34O27. 434十四酸(异构体)C15H34O20. 655十五酸C16H32O21. 48614 - 甲基十五酸C17H34O2 - 十六烯酸C17H32O23. 968十六酸(棕榈酸) C17H34O2 - 甲基- 十六酸 - 甲基- 十六酸十七酸 ，7，11，15 - 四甲基十六酸 - 十八烯酸C19H36O212. 53148 - 十八烯酸C19H36O25. 8115十八酸(硬脂酸) - 二十烯酸          菲牛蛭中氨基酸的分析苗艳丽等［5］采用HPLC法，测定广西产菲牛蛭提取液中的氨基酸。并采用内标法进行含量测定,结果见表2。测定结果表明菲牛蛭中含有18种氨基酸，甘氨酸的含量最高为5 μg/g，其次是亮氨酸含量为2 μg/g。其中含有人体必需的7种氨基酸,这7种必需氨基酸含量为5 μg/g，占氨基酸总量的；高于其他水蛭（日本医蛭为，蚂蟥为21. 40%）［7］中必需氨基酸的含量。        表2  菲牛蛭中氨基酸的组成及含量μg·g-1        氨基酸含量氨基酸含量△天门冬氨酸2 胱氨酸谷氨酸* 缬氨酸 丝氨酸606. 21* 蛋氨酸组氨酸398. 94色氨酸△甘氨酸 5 392. 70* 苯丙氨酸* 苏氨酸520. 21* 异亮氨酸 △丙氨酸1 478. 56赖氨酸899. 29△精氨酸 1 637. 35△* 亮氨酸2 * 酪氨酸165. 17脯氨酸        *为人体必需氨基酸；△：为含量较高的氨基酸       3  菲牛蛭的生物活性成分及其药理学作用          菲牛蛭素(Bufrudin)［8］菲牛蛭素是从菲牛蛭分出的一种多肽,由60多个氨基酸组成,分子量7 000 D，序列分析表明,其中50%～60%的氨基酸残基与水蛭素相同。其立体结构和构型有待进一步研究。它的作用机理与水蛭素(Hirudin)、森林山蛭素(Haemadin) 相同，都是抑制凝血酶［9］。        黄爱民等［10］从广西产菲牛蛭消化液中分离出两种特异凝血酶抑制剂-菲牛蛭素A（Bufrudin A ,BDA）、菲牛蛭素B（Bufrudin B ,BDB）。BDA分子量约为，等电点为；BDB分子量为 KD，等电点为。紫外扫描发现，BDA在230 nm处有最大吸收，而BDB的最大吸收则在200～210 nm之间。每1 000 ml水蛭消化液可以分离出菲牛蛭素A 630 μg, 菲牛蛭素B 615 μg，收率菲牛蛭素A约为％； 菲牛蛭素B约为。          菲牛蛭及活性成分的抗凝血作用黄爱民等［11］用广西菲牛蛭中提取的两种菲牛蛭素（菲牛蛭素A和B）在体外及动物体内进行抗凝血实验，结果表明：菲牛蛭素A和B均能明显延长活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）及凝血酶时间（TT），但两者的3个指标有明显差异性，其中菲牛蛭素A对凝血酶时间（TT）的作用最显著，菲牛蛭素B则凝血酶原时间（PT）的作用更强。对于凝血因子，菲牛蛭素A对Ⅱ，Ⅷ，Ⅻ因子产生抑制作用，对Ⅴ，Ⅸ，Ⅹ，Ⅺ因子无影响；菲牛蛭素B则对Ⅱ，Ⅷ，Ⅹ，Ⅻ因子产生抑制作用,对Ⅴ，Ⅸ，Ⅺ因子无影响。广西菲牛蛭中的抗凝物质BDA、BDB均有很强的抗凝活性。        此外，李文等［12］用7种水蛭进行全血与血浆复钙时间试验，证实日本医蛭与菲牛蛭都表现了强大的抗凝血作用(样品在10 min测试时间内不凝)。湖北牛蛭的抗凝效果也十分突出。          菲牛蛭及活性成分的抗血栓作用吴志军等［13］采用大鼠静脉血栓模型，研究了菲牛蛭制品的抗血栓与溶血栓作用。结果表明，阳性药脑血康和4种不同物种的水蛭冻干粉样品具有明显的抗血栓作用，各物种抗血栓作用强度依次为菲牛蛭冻干粉>日本医蛭冻干粉>欧洲医蛭冻干粉>宽体金线蛭冻干粉；同等剂量的菲牛蛭全身冻干粉样品和阳性药脑血康具有相当的抗血栓与溶血栓作用，而菲牛蛭头部段冻干粉则比前两者溶血栓效果更佳。        黎渊弘等［14］用广西菲牛蛭提取物对家兔体外血栓、动脉血栓及大鼠静脉血栓进行抗血栓研究,结果表明，大( ATU),中( ATU)，小( ATU)剂量组与对照组相比，菲牛蛭提取物对家兔体外血栓形成有显著性差异（P< ）,血栓抑制率为～100%。与对照组比较，给药组药后10，15 min对大鼠半体内血栓形成影响有显著性差异(P<),血栓的湿重明显减小或完全消失。大鼠静注菲牛蛭提取物60 ATU/kg后,大鼠静脉血栓形成率为0，血栓干湿重为0,与对照组比较有非常显著性差异(P<)。家兔静注菲牛蛭提取物60 ATU/kg前和给药后15，30，45 min，家兔动脉血栓干湿重有显著性差异(P<)，药物作用时间为1 h。          纤维蛋白溶解酶    笔者采用纤维蛋白平板法［15］定性测定广西产菲牛蛭唾液提取液纤维蛋白溶解酶。结果表明：在标准平板和加热平板上加入广西产菲牛蛭唾液提取液20 μl后，溶圈直径为 cm，表明能溶解纤维蛋白。而尿激酶20 μl在标准平板上有较强的纤溶作用（溶圈直径为 cm），在加热平板上无纤溶作用（溶圈直径为0）。说明菲牛蛭唾液提取液的纤溶机制与尿激酶不同，是以直接纤溶为主。菲牛蛭唾液提取液经过10%～100%硫酸铵处理，部分蛋白被沉淀，由于硫酸铵的量不同，溶圈大小也不同。10%硫酸铵处理样品上清液的溶圈直径最大，80%硫酸铵处理样品上清液的溶圈直径最小。          抗血小板聚集活性成分  李文等［12］从7种水蛭对抗ADP或胶原诱导的血小板聚集的结果表明：日本医蛭、菲牛蛭和湖北牛蛭都表现了抗血小板聚集的作用。其中以日本医蛭的效果最佳。在 mg/ml浓度下已表现抑制ADP诱导聚集的作用；其次为菲牛蛭，在 mg/ml时对血小板最大聚集率（PAm，%） 和1 min时血小板聚集率（Par，%） 都表现了显著抑制；湖北牛蛭的抑制ADP诱导血小板聚集作用则需要较高浓度。笔者也发现，25 μl广西产菲牛蛭唾液提取液对ADP诱导的聚集表现90%的抑制。          抑菌活性成分  广西菲牛蛭唾液粗提液未发现抑菌活性，但是经过离心处理，对金色葡萄球菌有抑制作用，抑菌圈直径为 cm。可能是因为粗样中成分多而杂，进行抑菌检测时干扰大，而导致阴性结果。经过离心，干扰蛋白被沉淀分离，显示阳性结果。       4  菲牛蛭粗品和菲牛蛭素精品的制备［11］          提取粗品先配制提取液，然后让菲牛蛭吸吮，待菲牛蛭充分吸饱后，再将其挤压，收集唾液（水蛭素粗品），每隔3周可提取1次，每条可以反复提取5～6次，最后还可将整体冻干后粉碎作最后的提取。          广西菲牛蛭素精品的分离纯化          广西菲牛蛭素的粗提取广西菲牛蛭唾液提取液1 000 ml，用三氯醋酸进行酸沉；4℃，8 000 r/min 离心30 min，弃沉淀，取上清液65～70℃保温30 min，适当搅拌；调pH值至中性，4℃，8 000 r/min离心10 min，弃沉淀，保留上清液。           广西菲牛蛭素的提取纯化          DEAE-纤维素柱层析选用的层析柱长为30 cm，直径 cm。将上清液加到已用 mol·L-1磷酸盐缓冲液（pH ）平衡的DEAE-纤维素柱上，以0～1 mol·L-1 NaCl 1 000 ml进行线性梯度洗脱，流速为1 ml·min-1，以每管10 ml收集各蛋白峰，按Markwardt凝血酶滴定法测定各管蛋白峰的活性，收集具有抗凝活性的A1峰及B1峰。          Sephadex G-50 凝胶过滤柱层析选用的层析柱柱长为100 cm，直径 cm。取浓缩后的DEAE-纤维素柱的A1峰和B1峰，分离上样于已用 mol·L-1磷酸盐缓冲液（）平衡的Sephadex G-50柱上，用相同缓冲液洗脱，流速为 ml·min-1，每管10 ml收集蛋白峰，同法测定各蛋白峰的抗凝活性，分别收集具有抗凝活性的A2，B2峰。          反相HPLC进一步纯化采用Waters 2487 Dual λAbsorbance Detector ,Waters 600 controller ,WatersTM600 Pump. 在UV210 nm下，选用制备型ULTRASPHERE ODS C18柱（10 mm×25 cm），将DEAE-纤维素柱洗脱的活性峰成分A2，B2透析浓缩后分别进样。用水溶液充分平衡后，以30 min 0～60%的乙腈(含 TFA)线性梯度洗脱，流速为3 ml·min-1)洗脱，分别收集抗凝活性峰A3，B3，冻干后即得具有抗凝活性的物质BDA，BDB。       5  菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列测定        谭恩光等［4］以我国广东菲牛蛭为材料，研究地理因素对菲牛蛭水蛭素基因结构变异的影响。研究表明：广东菲牛蛭水蛭素基因（Hmg）全长642 bp，与马尼拉的菲牛蛭水蛭素基因Hm1 和Hm2同源性分别为9O％和％ 。从整个多肽链看来，广东菲牛蛭水蛭素基因序列，也具有如下特征：①Hmg的N端第6，13，15，21，27和36位为半胱氨酸，推测这6个半胱氨酸将形成3对二硫键，对分子构型起稳定作用；②Hmg亦含1个富酸性羧基末端片段。此片段中有7个酸性氨基酸，为分别位于50、54、55、59的谷氨酸和位于52，58，60的天冬氨酸。酸性羧基末端片段与凝血酶的识别部位结合，即带负电的羧基末端氨基酸残基和凝血酶分子结构中带正电氨基酸形成的凹槽 离子键相互作用是复合物形成关键一步，也是发挥功能的重要一步；③ 肽链中部还有一个由Prc-Lys44——Pro组成的特殊序列，此3个残基与凝血酶活性部位裂缝相互作用，抑制了此酶的功能［16～18］。此外广东菲牛蛭水蛭素羧基端不存在来自医蛭素中的磺酸化修饰的Tyr，代之是He，这表明水蛭不同科之间，蛭素基因的翻译后修饰进化方式不同。       6  菲牛蛭中有害物质含量和急性毒性        吴志军等［13］测定了菲牛蛭中有害物质含量和急性毒性试验。结果表明：3批不同批号菲牛蛭样品中铜、铬、砷、汞、铅 5种有害重金属元素含量总和< 20 mg/kg，砷元素含量< 2 mkg，有机氯类和有机磷类农药残留量均很低。急性毒性：LD >10 g/kg。菲牛蛭中重金属含量和有机氯以及有机磷农药残留量均符合国家有关要求，菲牛蛭可考虑作为一种新的药用资源加以研究。        我国有水蛭近百种，但《中国药典》(1995年版)只收载3种，而市场上出售的水蛭药材实际只有宽体金线蛭一种。笔者认为，对其它品种的水蛭尤其是吸血水蛭例如菲牛蛭等，有必要进行多学科的综合研究，以扩大入药水蛭的品种，造福于人类。 二、世界上最强的天然抗凝药 水蛭素一、天然水蛭素的历史 ●欧洲人使用水蛭素始于100多年前，当时西方人认为人体失调和发热的症状是由于血液过多引起的，因而使用日本医蛭(Hirud nipponia)放血。 ●1884年，英国威尔士国家医学院的海克拉夫特(Huaycraft)博士首先发现医蛭咽部具有抗热的水溶性抗凝血物质。 ●1904年，英国科学家雅各比（Jacoby）成功地把这种抗凝血有效成分分离出来，并命名为“水蛭素（Hirudin）”。 ●1955年,德国的马克沃德特(Markwardt)从医蛭头部分离出水蛭素纯品，从此科学家们开始进行水蛭素基础生化和药理学的研究。 ●20世纪60年代完成了水蛭素的氨基酸序列分析；70年代确定了肽链的组成和一级结构；80年代完成了二级和三级结构的分析，并对药理学特性进行了广泛研究。1986年以后国外利用基因工程技术生产了重组水蛭素；1997年重组水蛭素在德国上市。 ●我国从20世纪80年代末就对重组水蛭素的研究投入了大量的人力和物力，但到目前为止，国内尚未有重组水蛭素上市。其主要原因就是可能引起出血这个难以克服的副作用，因此，重组水蛭素的开发应用受到了限制。二、天然水蛭素的化学结构和性质     水蛭素多肽蛋白片是从吸血水蛭（如菲牛蛭Poecilobdella manillensis、日本医蛭Hirudo nipponia等）唾液腺及其所分泌的唾液中提取的一种主要有效生物活性物质。 它是由65个或66个氨基酸残基组成的单链多肽,分子量为7000,不含精氨酸,甲硫氨酸和色氨酸。水蛭素为灰色或白色小片状或粉末,易溶于水,不溶于乙醇和丙酮,水溶液显酸性。在干燥状态下稳定,在水溶液中室温可保存6个月,加热至80℃,15分钟不被破坏。     水蛭是我国传统中药，一千八百年前《神农本草经》中就有记载，中医认为它有破血、逐瘀、通经的疗效，主要用于治疗瘤症、痞块、血瘀、闭经和跌打损伤，西方也常用水蛭素吸血以治疗某些疾病。从水蛭及其唾液腺中已提取出多种活性成分，水蛭素是其中活性最显著并且研究的最多的一种成分，它是由65 一66个氨基酸组成的小分子蛋白质（多肽）。水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止世界上所发现的已知物质中最强的天然凝血酶物质。动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血／抗血栓形成以及防止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象，此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素由有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发病过程中抗凝血酶往往减少，这将限制肝素的疗效， 采用水蛭素会有较好的效果。     水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管内凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解 血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透吸过程，在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。研究表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用，它能防止肿瘤细胞的转移，已证明有效的肿瘤如纤维肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤和白血病细胞等。水蛭素配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。     动物性试验和临床研究证明，静脉和皮下注射水蛭素均无明显副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。半致死剂量LD50＞50mg／kg，远大于治疗所用的剂量（lmg／kg）。此外，水蛭素可以 口服，这给用药带来很大方便。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，这就可以解释为何服中药水蛙提取液仍然有疗效的原理。     由于水蛭具有重要开发价值，而水蛭来源有限， 故国内外医药界均着重研究通过基因工程取得重组水蛭素。1986年后，重组水蛭素已在大肠杆菌和胶木菌中分别表达成功。与天然水蛭素相比，重组水蛭素在63位氨基酸上未硫酸酯化，活性略化，其性质基本相同。在治疗的剂量下静脉注射无毒副反应。现国外一些大的生物技术公司已进入多方面的临床研究。有关水蛭素类多肽的专利，每年公布的数量至少在十多项以上，包括水蛭素类似的多肽、活性水解产物、剂型改造、生产工艺、检测方法、临床治疗的疾病等， 研究论文每年在数十篇以上。估计不久重组水蛭素类多肽药物将会正式用于临床。      近年来在我国以水蛭为主要成分的中成药已有多种，如脑血康口服液、抗血栓片、活血通胶囊，其产值达数千万元。含水蛭的新药也在不断研究推出。利用基因工程生产重组水蛭素类多肽药物，以取代水蛭和抗凝化瘀药的添加成分，这在近期内就可实现。作为注射剂用于心血管系统疾病和肿瘤治疗药物， 则还需进一步的临床研究。毋庸置疑，重组水蛭素类多肽药物的研制将会带来巨大的社会效益和经济效益。三、天然水蛭素的功效     天然水蛭素是迄今为止世界上所发现的已知物质中最强的天然抗凝血酶物质,它能高效抗凝血、抗血栓形成，对人类心脑血管疾病尤其是血栓性疾病等有独特的疗效,其防治效果远比目前临床上用于治疗血栓性疾病的常用抗凝药物—肝素要好，其原因是天然水蛭素具有以下优点:   （1）天然水蛭素抑制凝血酶的反应不需要抗凝血酶Ⅱ(AT-Ⅱ)作为辅助因子,使其抗凝作用与量效关系更吻合而且可在缺乏抗凝血酶Ⅱ的病人(如弥漫性血管内凝血)中使用；   （2）肝素不能灭活结合于血栓上的凝血酶,而天然水蛭素则对循环中的和结合于血栓的凝血酶都可疑抑制；   （3）肝素会被激活的血小板释放的血小板因子4(PTF4)或富含组氨酸的糖蛋白等结合,而天然水蛭素则不受这些因素的影响；   （4）肝素用于抗血栓治疗,出血副作用较大,而天然水蛭素用于抗血栓治疗,出血副作用较小,且无过敏反应和免疫原性,无毒反应。   同时，水蛭素还可直接扩张血管，降低血液粘度，促进血液循环，加快血流速度，减少血管阻力，降低血小板凝集性；降低血脂，减少血管壁脂质的沉积，此外，还具有抗炎、抗肿瘤和免疫抑制作用。     综上所述，天然水蛭素在血管内起到一个“清道夫”的作用（即清除血液中多余的血脂、血栓等“血垢”）。包治百病的水蛭素 2009年02月03日 星期二 下午 03:34       最初从水蛭唾液中提取到这些神秘物质的是一位英国科学家，时间早在1884年。而直到20世纪50年代，德国科学家马克沃德特（Markwardt）才将这种物质从水蛭唾液中成功分离出来。世界上最强的天然特效凝血酶抑制剂——水蛭素由此诞生。   天然水蛭素是由65个氨基酸组成的多肽化合物，在低于70摄氏度的环境温度下都能保持活性。它溶于水，能够阻止血液中纤维蛋白的凝固，抑制凝血酶与血小板的结合，有极强的溶解血栓作用。有实验表明，克的水蛭素就足以阻止5毫升兔血的凝结。因此它能够缓解动脉壁痉挛，降低血液黏稠度，减轻高血压症状，有效防治心脑血管疾病。另外，它还能够扩张血管，增进血液循环量，加快术后伤口愈合。     还有大量研究表明，作为直接抗凝血酶的药物，在治疗心肌梗死病例中，水蛭素比其他间接抗凝剂可使总的心肌梗死死亡率降低11%。从抗凝方面讲，水蛭素不仅可以替代肝素，甚至比肝素的表现还要好，可以大大减少出血并发症。所以，水蛭素被称为当今世界上最强的抗凝血物质，当之无愧。 水蛭又称蚂蟥，是一种名贵的动物中药材，它的涎液中有一种抗血凝物质，称为水蛭素，此外，还含有肝素、抗血栓素等，可治疗中风、闭经、截瘫、心绞痛、无名肿痛、肿瘤、颈淋巴经核等疾病，水蛭素能使移植手术后静脉血管保持畅通。金线蛭是水蛭中药用价值最高的品种，以金线蛭为主要原料的中成药已成批投入生产，且供不应求，富含水蛭素的主要药品有：欣复康、心脉通、肾元胶囊等。    水蛭素特异的抑制凝血酶的活性，阻断血液凝结成块的主要成分纤维蛋白的形成，阻止凝血酶催化的止血反应及凝血酶、诱导的血小板激活反应，达到抗凝血和抗血栓形成过程的目的.随着人类生存环境和生活水平的改变，脑血管病的发病率逐呈上升趋势，如脑血栓、脑溢血等，本公司利用基因技术研制的水蛭素是一种强烈的凝血酶抑制剂，它会使得凝血酶失去裂解纤维原的能力，从而阻止血液凝固，在临床治疗和预防各种血栓形成方面有着显著的作用。从医用水蛭中提取的天然水蛭素一般产量较少，限制了水蛭素的研究和临床应用，上海永业农科生物工程有限公司利用自己科研人员掌握的技术，将化学合成的水蛭素基因分别在大肠杆菌和酵母细胞中得到表达，可大大提高水蛭素的产量。     上海医科大学的宋后燕教授研制的链激酶的临床应用使急性心肌梗塞的死亡率明显降低，这类溶栓剂的特点是溶栓的效果较好，但无纤维蛋白的特异性，使用中可以造成纤溶酶过量激活，a2-抗纤溶酶大量消耗及纤维蛋白原降解，有全身性出血的危险，并且链激酶重复使用有过敏反应。上海永业农科生物工程有限公司开发的水蛭素是链激酶的换代产品。水蛭素和链激酶最大区别在于链激酶是溶栓药，水蛭素是抗栓药，能有效地抵抗血栓，同时解决了水蛭素在人体中停留时间较短，需经常注射的缺点

链激酶是从β-溶血性链球菌培养液中提纯精制而成的一种高纯度酶，白色或类白色冻干粉，易溶于水及生理盐水，其稀溶液不稳定。具有促进体内纤维蛋白溶解系统的活力，使纤维蛋白溶酶原转变为活性的纤维蛋白溶酶，引进血栓内部崩解和血栓表面溶解。临床和尿激酶一样用于血栓性疾病治疗。