基因治疗皮肤病的最新进展论文

Hello,大家好呀，本期我们介绍一篇南方医科大学皮肤病医院于2021年6月17日发表于Nature Communications的文章，题目为 《Single-cell RNA-seq reveals fibroblast heterogeneity and increased mesenchymal fibroblasts in human fibrotic skin diseases》IF： 。本研究通过使用单细胞RNA-seq，探索纤维化皮肤病范例瘢痕疙瘩中的成纤维细胞异质性。结果表明，瘢痕疙瘩中成纤维细胞可分为4个亚群：分泌-乳头状、分泌-网状、间充质和促炎性。有趣的是，与正常瘢痕相比，瘢痕疙瘩中间充质成纤维细胞亚群的百分比显著增加。这些发现将帮助我们更好地理解皮肤纤维化发病机制，并为纤维化疾病治疗提供潜在靶点。 单细胞RNA-seq揭示人纤维化皮肤病中成纤维细胞异质性和间充质成纤维细胞增加 研究背景 纤维化时以成纤维细胞增殖和细胞外基质(ECM)过度蓄积为特征，全球的发病率和死亡率较高。纤维化可累及任何器官，导致进行性组织瘢痕和器官功能障碍。纤维化性皮肤病涉及真皮中ECM成分的积聚，包括硬皮病、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩和移植物抗宿主病。纤维化皮肤病的全球影响显著，影响全球数百万人。迄今为止，纤维化皮肤病的病因发病机制尚未彻底阐明，目前尚缺乏根治方法。 许多导致纤维化的细胞类型，如血管内皮细胞、免疫细胞和成纤维细胞已被确定。成纤维细胞是皮肤纤维化过程中的中心细胞类型，可导致ECM积聚和炎症。纤维化疾病中的成纤维细胞表现出明显的增殖潜能、迁移和侵袭能力增加以及ECM沉积增加，从而导致纤维化发病。这些作用主要由成纤维生长因子驱动，如TGFβ、FGF、PDGF、VEGF和POSTN。 长期以来，我们都认为成纤维细胞是梭形细胞群中的一种，然而，新出现的证据表明成纤维细胞实际上是形态和功能异质性的细胞群。单细胞RNA测序(scRNA-seq)的发展使我们有机会探索稳态和病理下皮肤的成纤维细胞异质性。scRNA-seq提示成纤维细胞在正常人真皮中可分为多个亚群。 scRNA-seq也被用于研究一些纤维化疾病中成纤维细胞的异质性，如肺纤维化、系统性硬化症和Dupuytren病。然而，据我们所知，关于scRNA-seq应用于探索纤维化皮肤病中成纤维细胞异质性的研究仍然缺失。在本研究中对纤维化皮肤病的范例瘢痕疙瘩中进行了scRNA-seq分析，探索纤维化疾病中成纤维细胞的异质性。 研究方法Sample: 共3例患者中采集瘢痕疙瘩组织; 建库方式：Chromium Single Cell 3′ Library & Gel Bead Kit v2 (PN-120237), Chromium Single Cell 3′ Chip kit v2 (PN-120236), Chromium i7 Multiplex Kit (PN-120262)； 比对：human genome (hg38) 细胞过滤：filtered by removing cells with high and low (>6000 and <200) UMI-counts； 基因富集分析：clusterProfiler ； 转录调控因子分析：ARACNe； 细胞间的交互分析：CellPhoneDB ； 伪时序分析：destiny R package 结果 结果（一）： 如图1所示，单细胞RNA-seq揭示正常瘢痕和纤维化皮肤病真皮组织的细胞异质性；作者鉴定出了5个成纤维细胞簇(C2、C4、C8、C14、C15)和3个内皮细胞簇(C1、C6、C7)，并对不同类型组织的细胞比例进行统计。在瘢痕疙瘩组织中观察到内皮细胞和平滑肌细胞比例增加，这与瘢痕疙瘩表现出血管生成增加的报告一致。与正常瘢痕组织相比，瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞的比例降低，可能是内皮细胞和平滑肌细胞过度扩增所致。在比较瘢痕疙瘩和正常瘢痕中的基因变化时，作者发现成纤维细胞的差异最大（图1g），表明成纤维细胞在纤维化进展过程中发生显著变化。结果（二）： 真皮纤维化皮肤病中间充质成纤维细胞增加；在对所有瘢痕疙瘩和正常瘢痕成纤维细胞进行重新聚类，并分成13个细胞亚型sC1至sC13（图2a）。图2b，c显示了瘢痕疙瘩和正常瘢痕中成纤维细胞亚群的细胞比例。从结果可以看出，与正常瘢痕样本相比，瘢痕疙瘩样本中sC4的比例持续增加（图2b，c）。 在细胞亚群中，sC2、sC3和sC9是促炎性成纤维细胞，sC6和sC7是分泌-乳头状成纤维细胞，sC1和sC4是间充质成纤维细胞，sC5是分泌-网状成纤维细胞。特定胶原的表达与特定成纤维细胞功能相关。因此，作者还分析了4种成纤维细胞亚群的胶原表达水平。分析显示，胶原相关基因COL11A1在sC1和sC4成纤维细胞中特异性表达，表明在该细胞亚群中具有更多的间充质成分。 然后，作者比较了瘢痕疙瘩和正常瘢痕之间四个成纤维细胞亚群的比例。结果显示，与正常瘢痕相比，瘢痕疙瘩中分泌-乳头状、分泌-网状和促炎亚群的比例降低，而间充质亚群增加（图2f）。瘢痕疙瘩中间充质亚群的增加提示该亚群可能对瘢痕疙瘩发生非常重要。 接下来，研究者比较瘢痕疙瘩间充质成纤维细胞和正常瘢痕间充质成纤维细胞之间的差异，发现确定了骨骼系统发育、骨化和成骨细胞分化相关基因，如COL11A1、COMP和POSTN，在瘢痕疙瘩间充质成纤维细胞中表达显著增加。提示与正常瘢痕相比，瘢痕疙瘩中间充质成纤维细胞的比例不仅增加，而且间充质成纤维细胞的同一性也发生了变化。结果（三）：真皮纤维化皮肤病中间充质成纤维细胞的特征；在研究瘢痕疙瘩中间充质成纤维细胞中研究人员发现，骨骼系统发育、骨化和成骨细胞分化相关基因如POSTN和COL11A1在间充质亚群中富集（图3a）。热图表明间充质亚群和其他亚群之间的基因表达存在显著差异（图3b）。间充质亚群中增加的基因包括一些分泌蛋白，如POSTN、COMP、COL11A1、COL12A1和COL5A2（图3c和补充数据2）。我们还发现，间充质亚群中的一些膜蛋白，如SDC1、ADAM12和CD266（由TNFRSF12A编码）增加，而CD9减少（图3c）。GO和GSEA分析表明，间充质亚群中上调的基因与胶原组织过程、伤口愈合、骨骼系统发育、成骨细胞分化等相关。 在转录调控分析中，作者发现一些成骨、软骨形成、韧带和肌腱分化相关的TF，如SCX、CREB3L1和RUNX2，在间充质成纤维细胞亚群中富集，与其间充质特征一致。结果（四）： 间充质成纤维细胞亚群中的潜在配体-受体相互作用分析；为了确定瘢痕疙瘩和正常瘢痕中成纤维细胞亚群和其他细胞之间的细胞-细胞通讯景观，使用cellphondb 进行了分析，其中包含了配体-受体相互作用。在正常瘢痕中，分泌网状成纤维细胞和其他细胞之间的相互作用最丰富（图4a），但在瘢痕疙瘩中，间充质成纤维细胞和其他细胞之间的相互作用最丰富（图4b），表明间充质成纤维细胞在瘢痕疙瘩发展中的重要作用。作者还发现在瘢痕疙瘩中NOTCH信号传导显著增加，如JAG1-NOTCH1（图4c，右图）。瘢痕疙瘩中与FGF2配体-受体相互作用相关的纤维化抑制显著降低，这与之前的报告一致。结果（五）： sC4成纤维细胞的分化程度可能低于sC1成纤维细胞。为了进一步探索瘢痕疙瘩中间充质成纤维细胞亚群的关系，作者对sC1和sC4成纤维细胞进行了伪时序分析。提示sC4成纤维细胞的分化可能低于sC1成纤维细胞。有趣的是，与正常瘢痕相比，瘢痕疙瘩中sC4成纤维细胞的比例显著增加。最后，作者在硬皮病公共数据中验证以上结论，证明间充质成纤维细胞增加可能是纤维化皮肤病的普遍机制。 参考文献： Deng, CC., Hu, YF., Zhu, DH.  et al. Single-cell RNA-seq reveals fibroblast heterogeneity and increased mesenchymal fibroblasts in human fibrotic skin diseases. Nat Commun 12, 3709 (2021).

基因是DNA分子上的一个功能片段，是遗传信息的基本单位，是决定一切生物物种最基本的因子;下面是我整理了基因检测技术论文，有兴趣的亲可以来阅读一下!

病毒基因的检测

【关键词】 病毒基因 检测

一 乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)测定

乙型肝炎是由乙肝病毒引起的以肝脏损害为主要临床特征的急、慢性传染病，严重者可 发展成慢性肝炎、肝硬化和肝癌。在我国，乙肝是危害人类健康的一种主要传染病。

【 参考值】

阴性 (Taqman荧光定量PCR技术)

【临床意义】

是乙型肝炎病毒感染的直接证据，是HBV有活性复制能力及具传染性的确切标志。

2.可定量检测HBV-DNA含量，为临床病情判断、疗效观察提供信息。

的出现先于其他血清学指标(如HBsAg)，可早期诊断HBV感染。

4.正常人HBV-DNA为阴性。当HBV-DNA为101～104拷贝/ml时，表明病毒复制水平低，传染性较弱;而当 HBV-DNA>104拷贝/ml时，表明病毒复制水平高，传染性强。

含量测定可为临床药物选择提供依据。

【注意事项】

1.标本可用血清或血浆，避免肝素抗凝，避免反复冻融。

2.标本室温放置不超过4小时。

3.溶血、高胆红素标本影响检测结果。

二 其他病毒DNA测定

(一)人乳头瘤病毒DNA(HPV-DNA)检查

人乳头瘤病毒是一种小的双链DNA病毒，根据核酸相关性分型已发现70余型。该病毒可以感染人的皮肤和黏摸上皮细胞，诱发细胞增生，产生乳头瘤样病变。

【参考值】

阴性 (多重核酸荧光定量PCR技术)

【临床意义】

难以用传统的病毒培养及血清学技术检测，目前主要采用分子生物技术检测HPV-DNA，灵敏度高。

2.可对尿道、阴道、宫颈脱落细胞进行人乳头瘤病毒的检测及分型，判断体内HPV感染状况。

6和11型与尖锐湿疣、喉头鳞状上皮乳头状瘤发生有关;HPV 16、18、31、32型等与宫颈癌发生相关。因此，可用于对HPV高危亚型的诊断，对尖锐湿疣、宫颈癌等疾病的诊断与筛查具有重要意义。

检测可用于考核疗效与预后。

【注意事项】

1.用无菌拭子取尿道、阴道、宫颈分泌物于无菌试管或无菌瓶中。

2.标本采集应严格按无菌操作，避免污染。并及时送检。

(二)人类巨细胞病毒DNA(HCMV-DNA)检查

HCMV是疱疹病毒科成员，人类普遍易感，多为隐性或潜伏感染。在免疫功能低下、缺陷或抑制情况下，可发生成人HCMV感染，常呈弥漫性病变，严重者甚至死亡。

【参考值】

阴性 (荧光探针杂交PCR技术)

【临床意义】

1.用于临床HCMV感染的快速诊断。

2.用于临床免疫抑制 治疗过程中体内HCMV感染的快速诊断与疗效监测。获得性免疫缺陷综合征等患者HCMV感染的诊断与疗效监测。

技术检测HCMV的敏感性高，且HCMV-DNA的出现早于临床症状或血清学标记物的出现，可早期诊断 HCMV感染。

4.妊娠早期感染HCMV可引起胎儿先天畸形，产前检测HCMV-DNA有利于优生优育。

5.连续监测巨细胞病毒的含量变化可了解病毒的复制状况，从而为疾病的早期诊断与药物疗效提供直接的病原学依据。

【注意事项】

采用EDTA抗凝全血或脑脊液标本，采集后及时送检。

(三)单纯疱疹病毒DNA(simplex herpes virus， HSV-DNA)

单纯疱疹病毒是一种有囊膜的双股DNA病毒，分为I型和II型。近年来，HSV是性传播疾病、病毒性脑炎等疾病的重要病原体。

【参考值】

阴性 (荧光探针PCR技术)

【临床意义】

1.用于检测人血清样本或体液样本中的单纯疱疹病毒并可同时分型，辅助诊断HSV感染性疾病。

I型感染主要引起口唇疱疹、疱疹性结膜炎、脑炎和皮肤性疱疹，HSV II型主要引起生殖器疱疹， HSV-DNA检测可辅助诊断上述疾病，并可用于考核疗效与预后。 【注意事项】

1.血清用无菌注射针头抽取静脉血2ml于无菌肝功管中。

2.分泌物用无菌棉拭子采集标本，女性取宫颈或阴道分泌物，男性取精液或前列腺液，将取样后的棉拭子放入无菌试管或无菌瓶中。

3.脑脊液抽取脑脊液于无菌玻璃瓶中。

(四)EB病毒DNA(EB virus，EBV-DNA)

EBV属于丫疱疹病毒科，主要经涎液传播，PCR技术可灵敏地检测出标本中的EBV-DNA，满足临床诊断、 治疗需要。

【 参考值】

阴性 (荧光探针杂交PCR技术)

【临床意义】

1.可快速检测血液、脑脊液、组织、尿液中的EB病毒，为EB病毒感染提供直接证据。

病毒临床上与鼻咽癌传染性单核细胞增多症、霍奇金病等的发病密切相关。

【注意事项】

1.检测标本可采用EDTA抗凝全血、脑脊液、咽拭子、尿液、病变组织等。

2.标本采集时严格按无菌操作，并及时送检。

三 RNA病毒测定

丙型肝炎病毒RNA(HCV-RNA)检测

丙型肝炎病毒是一种单链正股RNA病毒，引起丙型病毒性肝炎。丙型病毒性肝炎多因输血或血制品而引起，在输血者中还存在无症状的HCV携带者。

【参考值】

阴性(RT-PCR，荧光定量PCR技术)

【临床意义】

1.有助于HCV感染的早期诊断。

阳性提示HCV复制活跃，传染性强。

转阴提示HCV复制受抑，预后较好。

4.连续观察HCV-RNA，结合抗-HCV的动态变化，可作为丙肝的预后判断和干扰素等药物疗效的评价指标。

【注意事项】

1.标本可用血清或血浆，用无菌注射针头抽取静脉血2～3ml于无菌肝功管或EDTA抗凝管中送检。避免肝素抗凝，避免反复冻融。

2.标本室温放置不超过4小时。

3.溶血、高胆红素标本影响检测结果。

参 考 文 献

[1]杨振,祁自柏,李河民.病毒基因检测技术的 发展趋势. 《 中国生物制品学杂志》,2006年01期.

[2]徐丽.利用基因工程进行PHB相关基因的克隆和烟草转化[D].山东师范大学,2000年.

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