囊性纤维病论文

CRISPR技术是一种简单而强大的基因组编辑工具。它使研究人员能够很容易地改变DNA序列和修改基因功能。它的许多潜在应用包括纠正遗传缺陷、治疗和防止疾病传播以及改良作物。然而，它的承诺也引起了伦理问题。

在流行用法中，“CRISPR”（发音为“crisper”）是“CRISPR-Cas9”的缩写。CRISPRs是DNA的特殊延伸。蛋白质Cas9（或“CRISPR相关”）是一种类似于一对分子剪刀的酶，能够切割DNA链。

CRISPR技术是根据细菌和古细菌（单细胞微生物领域）的自然防御机制改编而成的。这些生物体利用CRISPR衍生的RNA和各种Cas蛋白（包括Cas9）来抵御病毒和其他异物的攻击。他们这样做主要是通过切割和破坏外国侵略者的DNA。当这些成分被转移到其他更复杂的有机体中时，它允许对基因进行操作或“编辑”。

直到2017年，没有人真正知道这个过程是什么样子的。在2017年11月10日发表在《自然通讯》杂志上的一篇论文中，由金泽大学的Shibata Mikihiro和东京大学的Hiroshi Nishimasu领导的一个研究小组展示了CRISPR第一次运行时的样子。[一个惊人的新GIF显示CRISPR咀嚼DNA]

CRISPRs：“CRISPR”代表“有规律间隔的短回文重复序列簇”。它是DNA的一个特殊区域，具有两个明显的特征：核苷酸重复序列和间隔序列的存在。核苷酸的重复序列——DNA的组成部分——分布在CRISPR区域。间隔序列是散布在这些重复序列中的DNA片段。

对于细菌来说，间隔序列是从先前攻击有机体的病毒中提取的。它们作为一个记忆库，使细菌能够识别病毒并抵御未来的攻击。

这是由食品配料公司Danisco的Rodolphe Barrangou和一组研究人员首次通过实验证明的。在2007年发表在《科学》杂志上的一篇论文中，研究人员以酸奶和其他乳制品培养物中常见的嗜热链球菌为模型。他们观察到，病毒攻击后，新的间隔蛋白被整合到CRISPR区域。此外，这些间隔区的DNA序列与病毒基因组的部分序列相同。他们还通过取出或放入新的病毒DNA序列来操纵间隔区。通过这种方式，他们能够改变细菌对特定病毒攻击的抵抗力。因此，研究人员证实了CRISPR在调节细菌免疫中的作用。

CRISPR RNA（crRNA）：一旦一个间隔基被结合并且病毒再次攻击，CRISPR的一部分被转录并加工成crisprrna或“crRNA”。CRISPR的核苷酸序列作为模板产生互补的单链RNA序列。根据Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier在2014年发表在《科学》杂志上的一篇评论，每个crRNA由一个核苷酸重复序列和一个间隔部分组成。

Cas9：Cas9蛋白是一种切割外来DNA的酶。

该蛋白通常与两个RNA分子结合：crRNA和另一个称为tracrRNA（或“反式激活crRNA”）。两人随后将Cas9引导至目标地点，在那里进行切割。这片DNA是对crRNA的20个核苷酸延伸的补充。

使用两个独立的区域，或其结构上的“域”，Cas9切割DNA双螺旋的两条链，使所谓的“双链断裂”，根据2014年的科学文章。

有一个内置的安全机制，它确保Cas9不会在基因组中的任何地方被切断。已知短DNA序列s-PAMs（“邻近原间隔基序”）作为标记，与目标DNA序列相邻。如果Cas9复合物的目标DNA序列旁边没有PAM，它就不会被切割。根据《自然生物技术》（Nature Biotechnology）2014年发表的一篇评论，这可能是Cas9从未攻击细菌CRISPR区的一个原因。

不同生物体的基因组在其DNA序列中编码一系列信息和指令。基因组编辑包括改变这些序列，从而改变信息。这可以通过在DNA中插入一个切口或一个断裂，并诱细胞的自然DNA修复机制来引入人们想要的改变来实现。CRISPR-Cas9提供了一种方法。

在2012年，两篇关键的研究论文发表在《科学》和《国家科学院学报》上，这两篇论文帮助细菌CRISPR-Cas9转化为一个简单的、可编程的基因组编辑工具。

这项研究由不同的小组进行，结论：Cas9可以直接切割DNA的任何区域。这可以通过简单地改变crRNA的核苷酸序列来实现，crRNA与互补的DNA靶点结合。在2012年的《科学》文章中，Martin Jinek和他的同事们进一步简化了这个系统，将crRNA和tracrRNA融合在一起形成一个单一的“导向RNA”。因此，基因组编辑只需要两个组成部分：导向RNA和Cas9蛋白。

，哈佛医学院遗传学教授乔治·丘奇说：“你设计了一段20个核苷酸碱基对，它们与你想要编辑的基因相匹配。”。构建了与这20对碱基互补的RNA分子。丘奇强调了确保核苷酸序列只在目标基因中发现，而在基因组中没有其他发现的重要性。”然后，RNA加上蛋白质[Cas9]会像剪刀一样在那个位置切割DNA，理想情况下是在别的地方，“他解释道，”一旦DNA被切割，细胞的自然修复机制就会启动，并将突变或其他变化引入基因组。这有两种可能发生的方式。根据斯坦福大学的亨廷顿外展项目，一种修复方法是将两个切口粘在一起。这种被称为“非同源末端连接”的方法容易引入错误。核苷酸意外插入或删除，导致突变，从而破坏基因。在第二种方法中，通过用核苷酸序列填充间隙来固定断裂。为了做到这一点，细胞使用短链DNA作为模板。科学家可以提供他们选择的DNA模板，从而写入他们想要的任何基因，或纠正突变。

CRISPR-Cas9近年来变得流行起来。Church指出，这项技术易于使用，其效率大约是之前最好的基因组编辑工具（称为TALENS）的四倍，美国麻省理工学院和哈佛大学博德研究所的丘奇和张峰实验室的研究人员首次发表了在实验环境中使用CRISPR-Cas9编辑人体细胞的报告。利用人类疾病的体外（实验室）和动物模型进行的研究表明，该技术可以有效地纠正遗传缺陷。根据《自然生物技术》杂志2016年发表的一篇评论文章，此类疾病的例子包括囊性纤维化、白内障和范科尼贫血。这些研究为人类的治疗应用铺平了道路。

“我认为公众对CRISPR的认识非常集中于临床上使用基因编辑治疗疾病的想法，”纽约基因组中心的内维尔·桑贾纳和纽约大学生物、神经科学和生理学助理教授说这无疑是一个令人兴奋的可能性，但这只是一小部分。

CRISPR技术也被应用于食品和农业工业，以设计益生菌培养物和疫苗食用工业培养物（例如酸奶）以防病毒。它还被用于提高作物的产量、耐旱性和营养特性。

另一个潜在的应用是创造基因驱动。这些是遗传系统，它增加了一个特殊的性状从父母传给后代的机会。最终，根据Wyss研究所的研究，这种特性会在几代人中传播到整个群体。根据2016年《自然生物技术》的文章，基因驱动可以通过增强疾病载体（雌性冈比亚按蚊）的不育性来帮助控制疟疾等疾病的传播。此外，根据Kenh Oye及其同事在2014年发表在《科学》杂志上的一篇文章，基因驱动也可用于根除入侵物种，逆转对杀虫剂和除草剂的抗性，Church告诉Live Science：“CRISPR-Cas9并非没有缺点，

“我认为CRISPR最大的局限是它没有百分之百的效率。”。此外，基因组编辑效率可能会有所不同。根据Doudna和Charpentier在2014年发表的一篇科学文章，在一项在水稻上进行的研究中，接受Cas9 RNA复合物的细胞中，近50%发生了基因编辑。然而，其他的分析表明，根据目标，编辑效率可以达到80%或更高。

也有“目标外效应”的现象，即DNA在目标以外的位置被切割。这可能导致意外突变的引入。此外，丘奇还指出，即使系统按目标进行了削减，也有可能得不到精确的编辑。他称之为“基因组破坏”。

CRISPR技术的许多潜在应用提出了关于篡改基因组的伦理价值和后果的问题。

在2014年的科学文章中，Oye和同事们指出了使用基因驱动器的潜在生态影响。一个引进的性状可以通过杂交从目标群体传播到其他有机体。基因驱动也会降低目标群体的遗传多样性。

对人类胚胎和生殖细胞（如 *** 和卵子）进行基因修饰被称为生殖系编辑。由于这些细胞的变化可以遗传给下一代，使用CRISPR技术进行生殖系编辑已经引起了许多伦理问题。

的可变功效、偏离目标的效果和不精确的编辑都会带来安全风险。此外，还有许多科学界尚不清楚的问题。在2015年发表在《科学》杂志上的一篇文章中，大卫巴尔的摩和一组科学家、伦理学家和法律专家指出，生殖系编辑增加了对后代产生意外后果的可能性，“因为我们对人类遗传学、基因与环境相互作用的知识有限，以及疾病的途径（包括一种疾病与同一病人的其他情况或疾病之间的相互作用）。

其他伦理问题更为微妙。我们是否应该在未经后代同意的情况下，做出可能从根本上影响后代的改变？如果使用生殖系编辑从一种治疗工具转变为一种增强工具，以适应各种人类特征，会怎么样？

为了解决这些问题，国家科学、工程和医学院编写了一份全面的报告，其中包括基因组编辑的指导方针和建议。

尽管国家科学院敦促谨慎从事生殖系编辑，他们强调“谨慎并不意味着禁止”，他们建议只在导致严重疾病的基因上进行生殖系编辑，并且只有在没有其他合理的治疗方法的情况下才进行。在其他标准中，他们强调需要有关于健康风险和益处的数据，以及在临床试验期间需要持续监督。他们也推荐

最近有许多基于CRISPR的研究项目生物化学家和CRISPR专家萨姆·斯特恩伯格（Sam Sternberg）说：“由于CRISPR，基础研究发现的速度已经爆炸了。”他是加利福尼亚州伯克利市Caribou Biosciences Inc.的技术开发小组负责人，该公司正在开发基于CRISPR的医药、农业解决方案，以及生物研究。

这里是一些最新的发现：

“Live Science contributor Alina Bradford的附加报告”

附加资源

浅谈营养强化剂——牛磺酸[摘要] 牛磺酸（Taurine）又称α-氨基乙磺酸，是一种条件性必需氨基酸,存在于大部分动物组织中，且具有广泛的生物学效应。而牛磺酸跨膜转运是其发挥生物学效应的基础。近年来许多研究证实，牛磺酸具有广泛的生理功能，如参与渗透调节、抗氧化、解毒和刺激糖酵解等，对维持机体的正常生长发育、中枢神经系统、心血管系统、视觉系统、血液、免疫和生殖系统的功能有着重要的作用。人体合成牛磺酸的半胱氨酸亚硫酸羧酶（CSAD）活性较低，主要依靠摄取食物中的牛磺酸来满足机体需要。故牛磺酸常作为一种食品添加剂用于各类食品中，以满足机体的需求。但添加的剂量要符合一定要求，特别是母婴食品。对于食品中牛磺酸的检测国家也作出了明确的规定。关键词：牛磺酸；生理功能；食品添加剂1、牛磺酸的生理功能 牛磺酸的理化性质 纯品为无色或白色斜状晶体，无臭，味微酸，水溶液pH值～。熔点300℃。溶于水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮。天然品存在于牛胆等中。 牛磺酸可以促进婴幼儿脑组织和智力发育 牛磺酸在脑内的含量丰富、分布广泛，能明显促进神经系统的生长发育和细胞增殖、分化，且呈剂量依赖性，在脑神经细胞发育过程中起重要作用。[1]研究表明：早产儿脑中的牛磺酸含量明显低于足月儿，这是因为早产儿体内的半肤氨酸亚磺酸脱氢酶（CSAD）尚未发育成熟，合成牛磺酸不足以满足机体的需要，需由母乳补充。母乳中的牛磺酸含量较高，尤其初乳中含量更高。如果补充不足，将会使幼儿生长发育缓慢、智力发育迟缓。牛磺酸与幼儿、胎儿的中枢神经及视网膜等的发育有密切的关系，长期单纯的牛奶喂养，易造成牛磺酸的缺乏。 牛磺酸可以增强免疫 牛磺酸能使新生儿单个核细胞合成IgG、IgM增加,这对新生儿生理性体液免疫低下无疑是有益的。同时发现当成人外周血淋巴细胞与牛磺酸一起培养时,上清液中免疫球蛋白IgG和IgM浓度有上升的趋势。动物实验也表明,牛磺酸可促进鼠形成特异性抗体及抗羊红细胞抗体的产生,且主要是通过巨噬细胞而起作用的。阳忠辉等[2]报道牛磺酸能通过促进特异性皮炎患者IFN-γ的分泌,降低IL-4的水平。中性粒细胞通过产生次氯酸发挥抗细菌、真菌和病毒的作用。但次氯酸产生过多时会破坏中性粒细胞本身,而牛磺酸可以与产生的次氯酸反应,形成较稳定的氯化牛磺酸,从而清除次氯酸的氧化作用,使细胞免受攻击。另外氯化牛磺酸还有助于防止细胞自溶[3]。可见牛磺酸作为动物的条件性必需氨基酸,可以提高机体的特异性和非特异性免疫功能,缺乏牛磺酸可造成一系列免疫功能障碍。 牛磺酸与脂质代谢 动物体内胆汁酸与牛磺酸结合，有利于乳化、脂质代谢和脂溶性维生素的吸收。牛磺酸的这一作用首先发现于患囊性纤维化的儿童。此类患儿经大便丢失过多牛磺酸，使得胆汁酸盐中甘氨酸结合型/牛磺酸结合型比例升高，造成脂肪吸收不良，而补充牛磺酸后即可促进脂肪的吸收。[4] 防止心血管病 牛磺酸在循环系统中可抑制血小板凝集，降低血脂，保持人体正常血压和防止动脉硬化；对心肌细胞有保护作用，可抗心律失常；对降低血液中胆固醇含量有特殊疗效，可治疗心力衰竭。 牛磺酸具有抗氧化作用及预防癌症的作用 牛磺酸具有清除氧自由基的过氧化损伤作用。通过抑制自由基的产生，保护抗超氧化物歧化酶(SOD)的活性，减少脂质过氧化反应，保护细胞膜的完整性，减轻心肌损伤。1998年Toth等[5]发现牛磺酸的衍生物-L-黄乙谷酰胺由于表现出类维生素A的活性及对多聚ADP核糖合成的刺激作用而能抑制丝裂霉素C诱发的骨髓造血细胞的微核形成并具有抗癌作用。已有报道表明，牛磺酸对二乙基亚硝胺和苯巴比妥诱发的肝癌有化学保护作用，肿瘤的发生率及数量有明显降低[6]；牛磺酸还可以降低侵染性结肠腺癌的发生率，并显著减少其数量[7]。 牛磺酸与生殖 正常的生殖功能需要用牛磺酸来维持。猫饲料中牛磺酸含量低于时，其生殖功能不良，死胎、流产和先天缺陷率增高，幼仔存活率下降。含以上时，才能维持正常的生殖功能。[8]研究表明,饲料中缺乏牛磺酸时,可导致某些雌性动物生殖机能紊乱,如发情异常、死胎、胎吸收、流产等症状;幼仔表现为先天缺陷率增高,初生重、断奶重及成活率下降,有时还出现精神异常症状(等,1973)。在精液稀释液中添加牛磺酸,可提高冷冻精液中精子的成活率,增加精子活力(等,1980)。这些结果均表明牛磺酸无论是对雌性还是雄性动物甚至人的生殖系统都起到有益的作用。 其他作用 牛磺酸防治缺铁性贫血有明显效果，它不仅可以促进肠道对铁的吸收，还可增加红细胞膜的稳定性；牛磺酸还是人体肠道内双歧菌的促生因子，优化肠道内细菌群结构；还具有抗氧化、延缓衰老作用；能够促进急性肝炎恢复正常；对四氯化碳中毒有保护作用，并能抑制由此所引起的血清谷丙专氨酶的升高。对肾毒性有保护作用，牛磺酸对顺铂所致的兔原代肾小管上皮细胞改变有保护作用；另有报道，牛磺酸可镇静、镇痛和消炎，对冻伤、KCN中毒及偏头疼也有防治作用。2、 牛磺酸作为营养强化剂添加在多种食品中 牛磺酸的制备及提纯 盐酸酯化法(1) 2-氯乙胺盐酸盐的制备 在250mL烧瓶中加入100g浓盐酸，搅拌下缓缓加入乙醇胺61g，升温至145-150℃,通过氯化氢气体至有少量HCL逸出为止；然后蒸馏，在150℃下边减压蒸馏边反应15h，至无水馏出为止；最后将反应液冷却至70℃，加入无水乙醇50g，冷却结晶，经分离、洗涤（用无水乙醇）、真空干燥得成品106g，收率.（2） 牛黄酸的制备 将加入500mL烧瓶中，加250mL水溶解，在50℃下开始滴加上述产品58g溶于15mL水的溶液，6h滴完；然后升温至65℃反映3h，升温至90℃反应4h，最后回流1h，测定牛黄酸含量折算收率94%。用电渗析法除去无机盐，然后浓缩结晶得牛黄酸，提取收率，纯度,总收率 硫酸酯化法(1) 2-氨基乙基硫酸氢酯的合成 在500mL烧瓶中加入乙醇胺（，）和甲苯（100mL）,在水浴冷却及搅拌下滴加98%的硫酸（），约需50min滴完；再加入十六烷基三乙基氯化铵（），溶剂用四氯化碳（CTC）,加热回流，分离出理论量的水（约11mL）；经冷却、过滤、洗涤、干燥，得2-氨基乙基硫酸氢酯83g(熔点273-279℃)，收率.(2) 牛黄酸的合成 在500mL烧瓶中加入亚硫酸钠（）和250mL水，在氮气保护下缓缓且均匀地加入硫酸氢酯(，)，加完后继续回流10-12h生成牛黄酸；减压蒸去其中的水分，在漫漫加入浓硫酸100mL搅拌约1h，使产物溶解完全；滤出无机盐晶体，并用20mL浓盐酸洗涤两次。滤液减压浓缩至体积的一半，加入95%的乙醇50Ml,即有部分结晶析出；将滤液放入冰箱冷冻1-2h，过滤得粗品，再用浓盐酸重结晶一次即得产品(熔点298-301℃，收率85%。总收率为83%。 牛磺酸作为营养强化剂在食品中的应用 使用限量 GB 14880-94规定用于乳制品、婴幼儿食品及谷类制品、强化饮料～；乳饮料、饮液～。GB 2760--2002(g/kg)：配制酒～；果冻～；豆奶粉、豆粉～；豆浆、豆乳～；儿童口服液～；果汁(果味)型饮料～；可可粉及其他口味营养型固体饮料110～140mg/100g(相应营养型乳饮料按稀释倍数降低使用量)；果冻～；果汁(果味)型饮料～。FEMA(mg/kg)：焙烤制品250；肉制品585；汤类500；小吃食品2100；无醇饮料30；早餐谷物1000；油脂565；干酪630；禽类550；蛋类190；鱼类190；加工蔬菜200；调味品1125；甜沙司、肉羹汤、复水蔬菜375；坚果制品640；代乳品190；代糖品3750；调味香料70000。 允许残留量添加剂中文名称 允许使用该种添加剂的食品中文名称 添加剂功能 最大允许使用量（g/kg） 最大允许残留量（g/kg）牛磺酸 食品 食品用香料 用于配制香精的各香料成分不得超过在GB 2760中的最大允许使用量和最大允许残留量 牛磺酸 运动营养食品 营养强化剂 1－6g 牛磺酸 儿童配方粉 营养强化剂 ～ 国标中的检测方法 食品中牛磺酸的测定第一法 高效液相色谱法原理：试样中牛磺酸经提取后，用衍生剂衍生衍生物经C18柱分离，于其最大吸收波长330nm检测，根据保留时间和峰面积进行定性定量。第二法 薄层色谱法原理：试样中的牛磺酸，经离子交换柱提纯后，以薄层色谱法定性、定量。[9]婴幼儿食品和乳品中牛磺酸的测定第一法 OPA柱后衍生法原理：样品用偏磷酸溶液溶解，经超声波振荡提取、离心、微孔滤膜过滤后，通过钠离子色谱柱分离，与邻苯二甲醛（OPA）衍生反应，用荧光检测器进行检测，外标法定量。第二法 单磺酰氯柱前衍生法原理：样品用水溶解，用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白质。取上清液用丹磺酰氯衍生反应，衍生物经C18反相色谱柱分离，用紫外检测器（波长254 nm）或荧光检测器（激发波长330 nm，发射波长530 nm）检测，外标法定量。[9]3、总结 牛磺酸具有多种生理功能，是人体健康必不可少的一种营养素。我国牛磺酸主要用于医药，作为食品营养添加剂虽然逐步被国人所认识与接受，但国人消费牛磺酸的量还非常少。据调查，目前世界主要一些国家人均年消费牛磺酸量大致为：日本60g、美国50g、英国34g、德国32g、加拿大29g、法国26g、韩国19g、印尼17g、新加坡17g，而我国不足。牛磺酸作为一种保健品还是比较安全的，服用一些含牛磺酸的制品，用于保健，还是很可取的。牛磺酸作为一种优质的营养素，应该更好地被国人利用。主要参考文献：[1]金锋，优质营养素——牛磺酸[J].中国食物与营养Food and Nutrition in China，2006年第3期，2006:53-54 [2]阳忠辉,张玉环,焦振山,等.牛磺酸对特应性皮炎患者Th1/Th2细胞因子的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2005,4(2):51-57.[3]赵红波,姜利.牛磺酸与猫的营养[J].饲料广角,2003(11):35-36.[4]俞鸣，田庆伟.牛磺酸保健作用的研究进展[J].中国食品添加剂，1999，[5]Toth S, Csaba G Mutat Res,1988,209（1-2）：85-89 [6]Okamoto K, Sugie S, Ohnishi Res, 1996,87(1):30-36[7]Roddy B S,Rao C V,Rivenson A et Rcs,1993,53(15)：3493-3498[8]杨志勇，冯颖，吕秋凤，杨建成，胡建民.牛磺酸与生殖[J].饲料工业,2008年第29卷第11期：20-22[9] 中华人民共和国国家标准 GB/T —2003 食品中牛磺酸的测定[10] 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中牛磺酸的测定GB —2010

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