非洲猪瘟病毒荧光pcr检测论文

团体标准T/CVMA 5—2018非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus中国兽医协会发布前言本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。本标准主要起草人： 倪建强、王传彬、王琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕一鸣。1、范围本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。2、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3、试剂3.1 DNA提取试剂DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。3.2 2 × PCR缓冲液2 × PCR缓冲液的配制见附录A。3.3 引物探针3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'3.3.2 可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'下游引物ASF-OIE-rPCRR：5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'荧光探针ASF-OIE-Probe：5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'3.3.3 使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。3.4 阴性及阳性对照阴性及阳性对照的制备方法见附录C。3.5 其他试剂消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。消毒液配制见附录A， 0.01mol/L PBS配制见附录A。4、仪器和耗材分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL离心管（无核酸酶）。5、操作步骤5.1 样品采集及运输样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。5.2 样品处理检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）制成匀浆，经12 000 r/min离心2Min取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5 mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。5.3 样品保存采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。5.4 病毒DNA提取5.4.1 DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照试剂说明书操作。5.4.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，13 000 r/min离心10 min。DNA提取液1见附录A。5.4.4 尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃～25℃条件下，2 000 r/min离心10s。DNA提取液2见附录A。5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。5.4.6 加入90μL无DNA酶的灭菌去离子水，13 000 r/min离心10 min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。无DNA酶的灭菌去离子水见附录A。5.5 实时荧光PCR操作5.5.1 在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行5.5.2～5.5.4。5.5.2 每个检测反应体系需使用20μL实时荧光PCR反应液。根据5.4.2中设定的n值，按附录D配制反应液，充分混匀后分装，每个PCR反应管20μL。转移PCR反应管至 样品制备区 。5.5.3 在上述5.5.2的反应管中分别加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管总体积达到25 μL，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。5.5.4 将5.5.3加样后的反应管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧光素（FAM）作为报告基团，小沟结合物（MGB）为淬灭基团，反应参数设置如下： 预变性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环； 在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。6、结果判定6.1 结果分析条件设定实时荧光PCR检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。6.2 结果描述及判定当阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立，实例参考附录E。 当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性 ； 被检样品无Ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于Ct值＞38.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。7、实验室生物安全要求7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生物安全管理要求见GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。7.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。一附录 A (规范性附录) 试剂的配制A.1 DNA提取液1PEG8000晶体20.74g，NaCL17.53g，加去离子水定容到100 mL。A.2 DNA提取液21mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去离子水定容到100 mL。即KCL14.912g，Tris碱12.114g，1.2068 mL浓HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去离子水定容到100 mL。A.3 2×PCR缓冲液灭菌去离子水 70 mL三羟甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g氯化钾 1.865 g曲拉通X-100 0.5 mLdATP (100mmol/L) 2.5 mLdTTP (100mmol/L) 2.5 mLdGTP (100mmol/L) 2.5 mLdCTP (100mmol/L) 2.5 mL六水氯化镁 0.61 g盐酸 调pH至9.0灭菌去离子水 加至100 mLA.4 消毒液8‰氢氧化钠或3‰福尔马林或3%邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒试剂均可。A.5 磷酸盐缓冲液（PBS）的配方A.5.1 A液0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 mL。A.5.2 B液0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。经过滤除菌后，无菌条件下分装。A.6 无DNA酶的灭菌去离子水无DNA酶的灭菌去离子水是用1 %DEPC处理后的去离子水，电阻应该大于18.2mΩ。二附录B （资料性附录）非洲猪瘟病毒VP72基因参考序列1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT三附录C （规范性附录）非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照C.1阳性对照阳性对照制备方法：人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段，序列参见附录B，将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72，使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L，保存于-20℃备用。C.2 阴性对照阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。四附录D （规范性附录）实时荧光PCR反应液配方实时荧光PCR反应液配方见表D.1。表D.1 实时荧光PCR反应液配方组 分1个检测体系的加入量2×PCR 缓冲液a12.5μLdNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL上游引物（10 μmol/L）1.0 μL下游引物（10 μmol/L）1.0μL探针（10 μmol/L）1.0 μLTaq 酶b（5U/μL）0.5μL去离子水3μL总体积20μL2×PCR 缓冲液a: 参见附录A.1配方。Taq 酶b：具有5’→3’外切活性。五附录 E （资料性附录）非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考图D.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图(资料来源：中国兽医协会）

黄芪 1 斤连翘 2 斤大青叶2斤板蓝根 1斤金银花0.5 斤黄芩 1斤鱼腥草 1斤玄参 1 斤甘草0.3斤石榴皮1斤黄柏1斤熬药，连渣滓喂猪 （也可以打粉拌料喂食（未实验，理论上效果会更好））可以喂30-50头猪 一顿，一天两顿 ，连喂三天（一头猪一顿总药量100克-150克）本猪场发现疑似飞猪，解剖下来确诊，未报，用此方熬药喂一窝有发病的猪，九头猪已经发病的两头未控制住，已经死亡，同窝其他猪全部控制住，年前因为快递中断，临近一窝猪发现病情未用此方治疗，现全部陆续死亡。此药方的药物都可以到淘宝上批发，比实体店划算，效果也不错，价格300元左右即可买到（店家不同价格左右相差50-80左右），我买的是260看到转发出去， 希望大家减少亏损猪到了200斤左右的时候，一定要再喂一次（理论，未实践），这个时候很多疫苗的免疫期过去了，容易抵抗力下降，应该容易感染大家试试吧，现在全国到处飞猪，周围都是这个，很少有人上报，多转发点群，老百姓养猪不容易！

荧光定量 PCR 方法，该方法是将光谱技术引入到PCR 反应中，通过荧光信号的强弱变化定量测定特异性扩增产物的量，解决了常规 PCR 方法敏感性低和电泳检测中溴化乙锭对环境的污染问题。

等温扩增法，该方法是一种新兴的分子生物学检测方法，等温扩增方法不需要 PCR 中的变性、退火步骤，即可完成对靶序列的循环扩增，大幅缩短了时间，整个扩增反应时间一般少于 60 min，而常规PCR 方法的反应时间一般需要 2 h 以上。等温扩增试剂盒适合现场检测，灵敏度高，能够大幅提高猪瘟防控的可行性。

要减少场外人员和车辆进入猪场，要对人员和车辆入场前彻底消毒，要对猪群实施全进全出饲养管理，要对新引进生猪实施隔离，要按规定申报检疫。

非洲猪瘟防控注意事项

养殖场应该坚持全进全出，自繁自育的养殖模式，构建完善的封锁隔离措施，避免猪和野猪直接接触。养殖场在生猪调运过程中，尽量不要跨省引进种猪，必须引种时，一定要进行严格的产地检疫、疫情检测，严格执行落地报告制度和隔离观察制度。

殖场内部如果发现非洲猪瘟可疑疫情，严格按照《非洲猪瘟疫情应急预案》进行处置，迅速采取应急措施，预防疫情传播和蔓延。

团体标准T/CVMA 5—2018非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus中国兽医协会发布前言本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。本标准主要起草人： 倪建强、王传彬、王琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕一鸣。1、范围本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。2、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3、试剂3.1 DNA提取试剂DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。3.2 2 × PCR缓冲液2 × PCR缓冲液的配制见附录A。3.3 引物探针3.3.1 采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'3.3.2 可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'下游引物ASF-OIE-rPCRR：5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'荧光探针ASF-OIE-Probe：5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'3.3.3 使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。3.4 阴性及阳性对照阴性及阳性对照的制备方法见附录C。3.5 其他试剂消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、无菌无核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。消毒液配制见附录A， 0.01mol/L PBS配制见附录A。4、仪器和耗材分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL离心管（无核酸酶）。5、操作步骤5.1 样品采集及运输样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。5.2 样品处理检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取0.1g～0.2g组织或血粉，经研磨破碎后加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）制成匀浆，经12 000 r/min离心2Min取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于1.5 mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。5.3 样品保存采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。5.4 病毒DNA提取5.4.1 DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照试剂说明书操作。5.4.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌1.5 mL离心管，逐管编号。5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，13 000 r/min离心10 min。DNA提取液1见附录A。5.4.4 尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃～25℃条件下，2 000 r/min离心10s。DNA提取液2见附录A。5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。5.4.6 加入90μL无DNA酶的灭菌去离子水，13 000 r/min离心10 min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。无DNA酶的灭菌去离子水见附录A。5.5 实时荧光PCR操作5.5.1 在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行5.5.2～5.5.4。5.5.2 每个检测反应体系需使用20μL实时荧光PCR反应液。根据5.4.2中设定的n值，按附录D配制反应液，充分混匀后分装，每个PCR反应管20μL。转移PCR反应管至 样品制备区 。5.5.3 在上述5.5.2的反应管中分别加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管总体积达到25 μL，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。5.5.4 将5.5.3加样后的反应管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧光素（FAM）作为报告基团，小沟结合物（MGB）为淬灭基团，反应参数设置如下： 预变性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环； 在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。6、结果判定6.1 结果分析条件设定实时荧光PCR检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。6.2 结果描述及判定当阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立，实例参考附录E。 当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性 ； 被检样品无Ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于Ct值＞38.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。7、实验室生物安全要求7.1 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生物安全管理要求见GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。7.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。一附录 A (规范性附录) 试剂的配制A.1 DNA提取液1PEG8000晶体20.74g，NaCL17.53g，加去离子水定容到100 mL。A.2 DNA提取液21mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去离子水定容到100 mL。即KCL14.912g，Tris碱12.114g，1.2068 mL浓HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去离子水定容到100 mL。A.3 2×PCR缓冲液灭菌去离子水 70 mL三羟甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g氯化钾 1.865 g曲拉通X-100 0.5 mLdATP (100mmol/L) 2.5 mLdTTP (100mmol/L) 2.5 mLdGTP (100mmol/L) 2.5 mLdCTP (100mmol/L) 2.5 mL六水氯化镁 0.61 g盐酸 调pH至9.0灭菌去离子水 加至100 mLA.4 消毒液8‰氢氧化钠或3‰福尔马林或3%邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒试剂均可。A.5 磷酸盐缓冲液（PBS）的配方A.5.1 A液0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 mL。A.5.2 B液0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。经过滤除菌后，无菌条件下分装。A.6 无DNA酶的灭菌去离子水无DNA酶的灭菌去离子水是用1 %DEPC处理后的去离子水，电阻应该大于18.2mΩ。二附录B （资料性附录）非洲猪瘟病毒VP72基因参考序列1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT三附录C （规范性附录）非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照C.1阳性对照阳性对照制备方法：人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段，序列参见附录B，将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72，使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L，保存于-20℃备用。C.2 阴性对照阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。四附录D （规范性附录）实时荧光PCR反应液配方实时荧光PCR反应液配方见表D.1。表D.1 实时荧光PCR反应液配方组 分1个检测体系的加入量2×PCR 缓冲液a12.5μLdNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL上游引物（10 μmol/L）1.0 μL下游引物（10 μmol/L）1.0μL探针（10 μmol/L）1.0 μLTaq 酶b（5U/μL）0.5μL去离子水3μL总体积20μL2×PCR 缓冲液a: 参见附录A.1配方。Taq 酶b：具有5’→3’外切活性。五附录 E （资料性附录）非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考图D.1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。图E.1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图(资料来源：中国兽医协会

疫情猛如虎，德国专家团队提供生物安全准则一、疫情和行业问题现况：触目惊心！1、8月份以来，中国首次发生非洲猪瘟，并在黑龙江、河南、江苏、浙江连续四次，呈由北向南扩散趋势。针对非洲猪瘟无有效疫苗。(来源于经济观察网：2018年8月份以来非洲猪瘟在中国扩散！）2、8月9日郑州惠济区0型口蹄疫，扑杀173头生猪。（来源于养猪科学网：2018年8月9日0型口蹄疫再次出现！）3、2018年8月17日青岛辖区内1人因感染猪链球菌死亡。猪链球菌为二类动物疫病，与大肠杆菌、葡萄球菌等一样，广泛存在于人畜身上，是条件性致病菌，可防可治可控。（来源于青岛市农委微博：链球菌风险！）4、央视曾于2015年曝光江浙沪儿童体内普遍含有兽用抗生素！添加抗生素的动物饲料喂养的动物体重要比未添加抗生素的明显高产4%~5%，所以畜牧养殖场普遍使用抗生素以提高经济效益。通过食用肉、蛋、奶、鱼进入人体内，造成抗生素残留。如何实现“无抗养殖”？（德国和欧洲大部分国家实现无抗养殖的关键是：正确使用猪只清洗剂和圈舍消毒剂，做好生物安全措施，确保猪只健康）二、生物安全措施：这一系列的事件导致企业承受巨大的经济损失，行业内谈疫色变，行业人士和从业人员不得不更加谨慎和严肃的考虑一个问题：如何未雨绸缪，防患于未然，以便在突发疫情时可以高枕无忧？中德畜牧业合作项目（）德国首席猪业专家卡朋特博士和专家团队整理了多年的国际和在华的从业经验，为示范单位和国内行业企业制定了以下生物安全措施，作为基准提供参考，当然，每家企业均有自己的独特之处，在实际生产中要有针对性的对此基准予以调整。（一）综述1. 所有生产流程都必须正确、精确落实；2. 确保杀菌消毒产品的质量和有效使用（肥皂类、消毒液、高压清洗消毒设备等）；3. 必须严格按照说明书使用产品和设备，比如消毒剂的配比浓度和使用方法；4. 确保消毒杀菌过程中工作人员的安全和健康。5. 其中涉及到中国养猪行业中常用的含有以下成分的消毒剂：(1) 戊二醛类消毒剂属高致癌物，对人畜健康危害很大！常用的1:200的配比浓度（即0.5%）的有效性不能完全达标，而且，醛类在10℃以下会基本失效；(2) 火碱，即氢氧化钠溶液，腐蚀性非常高！稀释状态下依然具有强腐蚀性，会灼伤眼睛，损坏工作靴，伤及皮肤！(3) 溴、溴铵、碘和酮碘化合物类消毒剂达不到有效的杀菌消毒的作用；(4) 溴铵、二癸基烃铵不能杀灭病毒，而且与有机污染物混合后杀菌性能极度下降；(5) 过氧乙酸和过氧化氢必须评估其活性氧含量。如果运输线路长，存储期长，运输道路状况差，温差波动等原因会导致产品的使用效果大打折扣！(6) 酸类不能抵抗所有致病菌，尤其是不能杀灭蠕虫和苍蝇的孢子和卵。酸类试剂的保质期短，必须采取正确和严格的存储措施，而且不能长距离运输或运输太久；(7) 聚维酮碘（碘）同样会因为混有有机污染物而失效；(8) 推荐经德国兽医协会官方认定检测的德国Menno专利外特消毒剂，查询途径：（二）针对访客1. 不属于公司的车辆不得靠近猪场；2. 在猪场外的办公区接待访客，如有需要，则使用公司自有车辆前往猪场；3. 不在猪场场区内宴请访客；4. 访客的所有物品必须消毒，包括女士手提包中的所有物品；5. 访客必须在猪场外的办公区穿戴一次性防疫服和鞋套（需要穿2个鞋套）用肥皂类和消毒液消毒双手，并要求访客通过消毒通道；（三）生产管理人员：加强学习生物安全标准，互相监督相关措施的落实效果（四）员工管理1. 将人员流量降到最低；2. 制定的相关监督规则和规范必须有可落实性和检查性；3. 清除猪场内的私人车辆（例如摩托车），在场外设置停放地点；4. 外出的人员需要遵守特殊规则：所有生产场封场管理，外出人员凭兽医开具出门条外出。凡外出后进入生产区人员在生活区实行24小时隔离, 隔离时间从进入生活区洗澡开始计时；后勤职工凭行政部24小时隔离、洗澡证明方可进入生产区；5. 沐浴时要使用洗发水和沐浴露；到指定厕所如厕；在食堂就餐前后要消毒双手；6. 送菜人员要将菜品放到门岗处，由伙房将菜品中转到仓库，严禁送菜人员进入场区和携带猪肉相关产品。（五）工作靴消毒·1. 火碱，即氢氧化钠溶液，腐蚀性非常高！稀释状态下依然具有强腐蚀性，会灼伤眼睛，损坏工作靴，如果渗及皮肤会造成灼伤！2. 建议使用德国Menno外特消毒剂，并使用4％的混合浓度，在消毒盆或池中消毒混合溶液至少5厘米深，并且需要经常更换；3. 工作靴必须在清洗污垢后消毒才有效！（六）销售部管理1. 要与对待访客一样落实防疫措施，如果拜访客户，要随身携带和穿戴一次性工作服和鞋套；2. 严禁与养猪（养猪设备、兽药、饲料、客户）相关业务人员在公司（除场外市场部办公楼外）洽谈业务，必要的业务通过电话、微信、电子邮件等方式交流。（七）饲料配送：制定新的配送计划1. 每周只配送一次饲料，从周一开始：2. 首先向核心场提供饲料，之后为其它场配送（如育肥场）；3. 周六：送料车清洗和消毒，必须先清洗清洁再消毒，否则消毒无效！（因能确保使用效果，强烈推荐德国Menno外特消毒剂，4％浓度即可）4. 周日：停用配料车；5. 因而，猪场必须能够存储至少10天饲料用量；6. 配料车进入猪场：a.司机尽可能不下车；b.如司机必须下车，必须为其准备每个场区新的一次性防疫服和鞋套；c.强烈建议：人工彻底清洗消毒配料车辆！d.每次消毒结束后更换新的消毒液，并确保有效消毒时间。（八）拉猪车管理1. 驶往至客户场和本集团猪场之前至少24小时停用，停用前必须彻底清洗消毒；2. 使用后直接冲洗，由内到外；3. 使用高压设施设备（大于100bar）和热水进行清洗；4. 使用碱性浸泡液进行清洗；5. 清洗后彻底消毒，由内到外（因能确保使用效果，强烈推荐德国Menno外特消毒剂，4％浓度即可）6. 驾驶员绝对不得进入生产车间，只能呆在车里！7. 装猪时必须使用本猪场自有设施设备，而且这些设施设备只能保留在本场使用；8. 装猪时，必须穿戴一次性防疫服和手套，每装一批猪都必须换用新的一次性防疫服和手套，使用过的只能在本场销毁，不能带离；9. 装猪后洗手并消毒；10. 配备两双工作用靴，分别在在场区内部和外部使用，不能混用，而且每次使用后都必须清洗消毒；11. 驾驶员不得携带任何食物（高风险物品）。·（九）猪场内部相关生物安全措施1. 严格遵循和落实场内所有生物安全规范与规定，包括猪只清洗和圈舍消毒措施（参考“猪场清洗清洁和消毒实用技术报告”：北京牧道天成科技有限公司官网中“下载资料”）2. 按照欧洲标准严防鼠害和昆虫（“欧洲防鼠害技术报告”：官网中“下载资料”），随时落实，1年2次完全不够！3. 严防鸟类进入生产车间；4. 猪只转群：猪只进入目标圈舍前必须对圈舍消毒，同时必须对猪只进行清洗，目标之一是以防猪只将各种致病菌和寄生虫及虫卵带入已消毒的圈舍，使圈舍消毒徒劳无功！因能确保使用效果，强烈建议使用德国Menno力诺猪只清洗剂和圈舍消毒剂（参考“猪场清洗清洁和消毒实用技术报告”：官网中“下载资料”）；5. 无论使用哪种消毒剂，必须正确调整浓度，并确保有效消毒时间！

非洲猪瘟检测方法可用pcr检测法，可对取自待检测样本的分析物或其他分析物中的目标核酸进行快速、准确的定性检测。