硪士学位论文细胞爬片的制备

单位实验室做过，小编顺便推荐一下细胞爬片是从上海晶安生物公司买的，实验效果不错.细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。爬片可以在培养皿 六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。爬片置于37�.PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油

（一）细胞爬片的制备（1）如果使用载玻片或盖玻片，必须在使用之前灭菌。可以一次灭菌并贮存在无菌状态下。如果使用少量的盖玻片，用金属镊子夹住盖玻片，在70%乙醇中浸泡，然后在火焰上烤干。要轻轻地镊取，以防破裂。为了方便起见，可以将盖玻片浸泡于70%的乙醇中，使用时放在火焰上处理。如果使用的盖玻片或载玻片数量较多，可以将它们放于专用的金属支架上，然后高压消毒。如果需要的数量更大，则可将其放在耐热的容器中，干烤2小时；（2）在无菌状态下，把干燥的玻片放于适当的培养皿中。盖玻片可以用金属镊子镊取，圆形盖玻片可以放在24孔培养板的孔中，直径90mm的培养皿能够放入10-15张盖玻片，或者放入一张标准的载玻片；（3）将悬浮的细胞放入组织培养皿中，培养至少24小时，让细胞贴附在玻片上。要想得到一个较好的结果，在加细胞时，密度应低，以防细胞密度过高。（4）如果细胞数目有限，可把细胞悬液直接滴在玻片上，静置4小时后再轻轻加入培养液。通过这种方式，大部分细胞将粘附于玻片上，然后再培养约24小时，使细胞适当扩增。此时，取出载玻片或盖玻片可进行固定。以上资料仅供参考。

HE染色步骤：

1、脱蜡，脱蜡二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟，事先准备好盖玻片。

2、覆水，100%（Ⅰ、Ⅱ）、90%、80%、70%酒精各5分钟，自来水冲洗5分钟×3。

3.、苏木精染色5分钟，根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗。

4、5%乙酸分化1分钟，流水冲洗，用吸管滴加乙酸，布满玻片上的组织即可，分化后颜色变浅了一些，成为蓝色。

5、返蓝：返蓝液，实验室没有，也可不用。

6、伊红染色1分钟，根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗。

7、脱水：70%、80%、90%、100%酒精各10秒，二甲苯1分钟，可以在通风橱自然晾干再封

片，约5分钟左右。

8、滴上中性树胶，封片，用吸管滴上一滴即可，尽量少滴，但压片后要将组织全部覆盖完，避免中间有气泡。

扩展资料：

he染色原理：

易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性( basophilia )和嗜酸性( acidophilia )；而对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性（neutrophilia)。

构成组织内蛋白质的氨基酸的种类很多，它们有不同的等电点。在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色，这些物质称为嗜碱性。

而细胞质中的其它蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。如果改变染色液的酸碱度，pH值升高时，则原来被酸性染料染色的物质可变为嗜碱性；pH值降低时，原来被碱性染料染色的物质则可变为嗜酸性。

所以说染色液的pH值可以影响染色的反应。脱氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

参考资料来源：百度百科—he染色

zt一 取材和固定取材后经固定24小时（4%PA灌注取材的后固定6~8小时）以后，流水冲洗24小时，置于70%~80%乙醇中，可长期保存。二 脱水和包埋1、95%ALC（二道） Ⅰ 2~4hⅡ 2h2、无水ALC（二道） Ⅰ 1.5hⅡ 1h3、二甲苯+无水乙醇（1：1） 20min4、二甲苯（二道） Ⅰ 10min（注：脱水透明esp.透明时间可适当延长） Ⅱ 10min5、浸软蜡（50~52℃）（二道） Ⅰ 30minⅡ 1h6、浸硬蜡（58~60℃）（二道） Ⅰ 30minⅡ 30min7、包埋：注意温度、切面。三 切片修、切、展、贴、烤（烤片55~60℃） 3~10h四 HE染色1、二甲苯脱蜡 五道，每道5~10分钟2、无水乙醇 Ⅰ 5minⅡ 5min3、95%乙醇 Ⅰ 5minⅡ 5mn4、80%乙醇 5min5、70%乙醇 5min6、D．W． 3~5min7、Harris苏木素液 5min（冬天可适当延长，eg.20min）8、水洗9、0.5%盐酸酒精分色 3~10seconds，镜下观察10、水洗蓝化 15~30min（注意换水）11、70%乙醇 5min12、80%乙醇 5min13、伊红液（95%乙醇溶液） 3~30seconds14、95%乙醇 Ⅰ 1minⅡ 5min15、无水乙醇 Ⅰ 5minⅡ 5min16、二甲苯+乙醇（1：1） 5min17、二甲苯 Ⅰ 5minⅡ 5minⅢ 5min18、中性树胶封片。HE染色注意事项：1. 染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。2. 切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。3. 切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。4. 在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。5. 切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。6. 最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精（hematoxylin）是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红（eosin）是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。