呋喃丹的检测方法论文

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这个得具体问题具体分析。看你想达到什么检测目的了，另外还得看是什么病毒，存在于动植物什么部位。最简单的就是沉积实验：用标准抗原免疫鼠或兔等使其产生抗体，再用其血清作个沉积实验就可以了。这个实验不敏感，需要抗原抗体量较大，如果是特殊病毒或是感染初期，则检测不到。如果你有条件的话可以做ELISA，这个实验敏感性强。一,基本原理它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定.测定的对象可以是抗体也可以是抗原.在这种测定方法中有3种必要的试剂:①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂)②酶标记的抗原或抗体(标记物)③酶作用的底物(显色剂)测量时,抗原(抗体)先结合在固相载体上,但仍保留其免疫活性,然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物),此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性,当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后,再加上酶的相应底物,即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色.其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比.这种有色产物可用肉眼,光学显微镜,电子显微镜观察,也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定.其方法简单,方便讯速,特异性强.二,酶及其底物酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物.是ELISA成败的关键试剂,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同的酶选用不同的底物 ,将得到不同的颜色反应.360,450420 荧光黄色 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG) β-D-半乳糖苷酶 405420 黄色深蓝色 ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 葡萄糖氧化酶 400500 黄色红色 4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 碱性磷酸酯酶 492460449425642橘红色黄色棕色兰色蓝绿色邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2'-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐 辣根过氧化物酶 测定波长 显色反应 底 物酶 ELISA的种类和变化 (一)双抗体夹心法(二)间接法(三)竞争法 (四)双位点一步法(五)捕获法测IgM抗体(六)应用亲和素和生物素的ELISA (一)双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本(抗原)形成固相抗体-抗原复合物 洗涤除去其他未结合的物质 加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物 彻底洗涤未结合的酶标抗体 加底物进行酶催化反应 根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体,故称为间接法.(二)间接法包被固相载体: 用已知抗原包被固相载体 加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合洗涤,除去无关的物质 加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合;洗涤,除去未结合的酶标抗抗体 加底物显色 根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定(三)竞争法 此法可用于抗原和半抗原的定量测定,也可用于测定抗体 .用已知特异性抗体包被固相载体 测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合 分别洗涤除去未结合的成分 加底物显色分别测定两管的吸光度值,根据对照管与测定管吸光度值之比,计算标本中待测抗原含量对照管由于只加酶标抗原,与固相抗体充分结合,故分解底物显色深;测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异.如待测抗原量多,竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合,使固相上结合的酶标抗原量减少.因此,加入底物后显色反应较弱. 特点一:灵敏性该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶.众所周知, 酶是一种有机催化剂,很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ,产生可供观察的显色反应现象.因此该体系常被称为酶放大体系.ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位,或在微克,甚至纳克水平上对其进行定量.例如,在测定血清中某一物质的含量时,化学比色法的敏感度为mg/ml水平,酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml . 特点二:特异性其特异性来自抗体或抗原的选择性.抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间.由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系,所以抗原抗体反应具有高度的特异性.例如乙肝病毒中的表面抗原(HBsAg),e抗原(HBeAg)和核心抗体(HBcAg),虽来源于同一病毒,但仅与其相应的抗体结合,而不与另外两种抗体反应.抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物(例如血清)中测定某一特定的物质,而不需先分离待检物.ELISA应用实例饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中毒素的测定(主要包括黄曲霉毒素, 简曲霉毒素 ) 饲料中有害微生物的快速筛检 (如沙门氏菌 )甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析 ELISA在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测河豚毒素 植物毒素如罂粟碱,吗啡,藻类毒素 苯并芘 主要有除草剂与杀虫剂两大类例如杀暝松( FN ),甲氟磷酸异已酶( SOMAN ),草不绿( Alachor ),西维因( Carbaryl ),多菌灵及克菌丹( Captan )等.农药的检测:ELISA检测 "非典型肺炎"冠状病毒 ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2(hnRNPA2)/类风湿性关节炎(PtA)33抗体ELISA在疾病诊断中的作用ELISA法检测幽门螺杆菌抗体ELISA试剂盒商业资讯ELISA试剂盒酶联免疫井DNM-9602G酶标分析仪DNM-9602 标配酶标分析仪 DNM-9602A酶标分析仪几种酶标分析仪(一) 原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牵9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 (二) 操作步骤 方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。 4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 方法二 用于检测未知抗体的间接法： 用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。(三) 试剂器材 1. 试剂 (1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液): NaCO31.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至1000ml (2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml (3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5～10％使用。 (4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。 (5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸枣柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸(19.2克／L) 24.3ml 加蒸馏水50ml。 (6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl (7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl (8) 抗原、抗体和酶标记抗体。 (9) 正常人血清和阳性对照血清。 2. 器材: (1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。 (2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。 (3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。(四) 注意事项 1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。 2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括: (1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。 （2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。 (3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。 (4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

1.速测技术检测原理 目前食菜中毒主要是由有机磷和氨基甲酸酯类农药引起，特别是甲胺磷最易引起急性中毒，它会抑制人体中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使人致死。农药残留速测法就是基于有机磷或氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的强烈抑制作用，利用这种毒理学反应的共性，能使显色剂正常显色的为安全菜，被抑制不能显色的表明农药残留超过了标准。2.只测这两类农药行吗？有机磷和氨基甲酸酯类农药是当前生产量最大，蔬菜上使用最多，也最容易引起中毒的两大类农药，是国家重点监控的目标。有机氯农药因其难以降解，早已禁止生产和使用。而一些除草剂因其除草机理与人体亲缘较远，对人体危害不大，还有一类杀菌剂大多数属于低毒农药。为此只要监管好这两类农药，就基本可避免食菜中毒事件发生。3.农药残留速测法依据的标准2001年10月1日，国家质量技术监督局正式颁布了“农产品安全质量”标准，在标准的5.2.2条中明文规定了酶抑制法的快速检测技术。2003年3月，国家质量技术监督局又颁布了“蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯的快速检测方法”，纸片速测法作为第一方法被选用。我们采用的纸片法是通过选择酶的活性和量来控制其灵敏度，考虑到有些农药国家明令禁止在蔬菜上不得使用，如甲胺磷、氧化乐果、呋喃丹等，而有些农药可以用在蔬菜上，但不能超过一定的限量标准，如敌敌畏是0.2ppm，乐果是1.0ppm，因为该速测法是针对有机磷和氨基甲酸酯两大类农药的，无法准确判定是那一种农药，所以，为了避免误判，我们将其灵敏度定为1.0ppm，即超过此限量，速测卡就显阳性，农药残留一定超标。

微生物

总大肠菌群（MPN/100mL或CFU/100mL） 不得检出

耐热大肠菌群（MPN/100mL或CFU/100mL） 不得检出

大肠埃希氏菌（MPN/100mL或CFU/100mL） 不得检出

菌落总数（CFU/mL） 100

毒理指标

砷（mg/L） 0.01

镉（mg/L） 0.005

铬（六价，mg/L） 0.05

铅（mg/L） 0.01

汞（mg/L） 0.001

硒（mg/L） 0.01

氰化物（mg/L） 0.05

氟化物（mg/L） 1.0

硝酸盐（以N计，mg/L） 10

地下水源限制时为20

三氯甲烷（mg/L） 0.06

四氯化碳（mg/L） 0.002

溴酸盐（使用臭氧时，mg/L） 0.01

甲醛（使用臭氧时，mg/L） 0.9

亚氯酸盐（使用二氧化氯消毒时，mg/L） 0.7

氯酸盐（使用复合二氧化氯消毒时，mg/L） 0.7

化学指标

色度（铂钴色度单位） 15

浑浊度（NTU-散射浊度单位） 1

水源与净水技术条件限制时为3

臭和味无异臭、异味

肉眼可见物 无

pH （pH单位） 不小于6.5且不大于8.5

铝（mg/L） 0.2

铁（mg/L） 0.3

锰（mg/L） 0.1

铜（mg/L） 1.0

锌（mg/L） 1.0

氯化物（mg/L） 250

硫酸盐（mg/L） 250

溶解性总固体（mg/L） 1000

总硬度(以CaCO3计，mg/L） 450

耗氧量（CODMn法，以O2计，mg/L） 3

水源限制，原水耗氧量>6mg/L时为5

挥发酚类（以苯酚计，mg/L） 0.002

阴离子合成洗涤剂（mg/L） 0.3

放射性

总α放射性（Bq/L） 0.5

总β放射性（Bq/L） 1

①MPN表示最可能数；CFU表示菌落形成单位。当水样检出总大肠菌群时，应进一步检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群；水样未检出总大肠菌群，不必检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群。

②放射性指标超过指导值，应进行核素分析和评价， [3]  判定能否饮用。

表2 饮用水中消毒剂常规指标及要求

消毒剂名称 与水接触时间 出厂水

中限值 出厂水

中余量 管网末梢水中余量

氯气及游离氯制剂（游离氯,mg/L） 至少30min 4 ≥0.3 ≥0.05

一氯胺（总氯，mg/L） 至少120min 3 ≥0.5 ≥0.05

臭氧（O3，mg/L） 至少12min 0.3 0.02

如加氯，

总氯≥0.05

二氧化氯（ClO2，mg/L） 至少30min 0.8 ≥0.1 ≥0.02

非常规

编辑

指 标 限 值

微生物

贾第鞭毛虫（个/10L） <1

隐孢子虫（个/10L） <1

毒理指标

锑（mg/L） 0.005

钡（mg/L） 0.7

铍（mg/L） 0.002

硼（mg/L） 0.5

钼（mg/L） 0.07

镍（mg/L） 0.02

银（mg/L） 0.05

铊（mg/L） 0.0001

氯化氰（以CN-计，mg/L） 0.07

一氯二溴甲烷（mg/L） 0.1

二氯一溴甲烷（mg/L） 0.06

二氯乙酸（mg/L） 0.05

1,2-二氯乙烷（mg/L） 0.03

二氯甲烷（mg/L） 0.02

三卤甲烷（三氯甲烷、一氯二溴甲烷、二氯一溴甲烷、三溴甲烷的总和） 该类化合物中各种化合物的实测浓度与其各自限值的比值之和不超过1

1,1,1-三氯乙烷（mg/L） 2

三氯乙酸（mg/L） 0.1

三氯乙醛（mg/L） 0.01

2,4,6-三氯酚（mg/L） 0.2

三溴甲烷（mg/L） 0.1

七氯（mg/L） 0.0004

马拉硫磷（mg/L） 0.25

五氯酚（mg/L） 0.009

六六六（总量，mg/L） 0.005

六氯苯（mg/L） 0.001

乐果（mg/L） 0.08

对硫磷（mg/L） 0.003

灭草松（mg/L） 0.3

甲基对硫磷（mg/L） 0.02

百菌清（mg/L） 0.01

呋喃丹（mg/L） 0.007

林丹（mg/L） 0.002

毒死蜱（mg/L） 0.03

草甘膦（mg/L） 0.7

敌敌畏（mg/L） 0.001

莠去津（mg/L） 0.002

溴氰菊酯（mg/L） 0.02

2,4-滴（mg/L） 0.03

滴滴涕（mg/L） 0.001

乙苯（mg/L） 0.3

二甲苯（mg/L） 0.5

1,1-二氯乙烯（mg/L） 0.03

1,2-二氯乙烯（mg/L） 0.05

1,2-二氯苯（mg/L） 1

1,4-二氯苯（mg/L） 0.3

三氯乙烯（mg/L） 0.07

三氯苯（总量，mg/L） 0.02

六氯丁二烯（mg/L） 0.0006

丙烯酰胺（mg/L） 0.0005

四氯乙烯（mg/L） 0.04

甲苯（mg/L） 0.7

邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（mg/L） 0.008

环氧氯丙烷（mg/L） 0.0004

苯（mg/L） 0.01

苯乙烯（mg/L） 0.02

苯并(a)芘（mg/L） 0.00001

氯乙烯（mg/L） 0.005

氯苯（mg/L） 0.3

微囊藻毒素-LR（mg/L） 0.001

化学指标

氨氮（以N计，mg/L） 0.5

硫化物（mg/L） 0.02

钠（mg/L） 200