rna的研究进展论文3000

:)--miRNA研究进展在许多生物学过程中都发现有miRNA的存在，而且它们还是众多生物学功能的承担者。例如，已经证实某个miRNA和肿瘤发生是相关联的。一项新的研究表明，在体内和体外，全面抑制miRNA的成熟过程可以提高细胞转变和肿瘤形成的几率。已有研究发现，与正常组织相比，癌症细胞中成熟miRNA的水平较低。为了进行深入研究，Kumar等人下调了小鼠肺腺癌细胞中的Drosha、DGCR8 以及Dicer1的表达——这些都是miRNA加工成熟过程中的调节蛋白。尽管下调而并不是完全敲除，但是这种做法确实产生了惊人的影响效应：这些含有加工缺陷miRNA的细胞在体外形成了更大的聚集体，另外一个特点就是由于增殖能力加强，导致细胞的转移能力提高。在另外三个人类癌症细胞系中，也观察到了类似结果。此外，把那些调节蛋白下调的小鼠细胞注射进入免疫缺陷的小鼠后发现，加工缺陷miRNA增加了这些细胞形成肿瘤的几率。尽管这些肿瘤的组织学切片和控制对照是相似的；但是，和控制对照不同的是，肿瘤形成的速度更快，而且它们还可以侵入周围组织，这和在下调的细胞中观察到的细胞迁移能力加强是一致的。不过，Kumar指出，如果仅仅损坏miRNA的加工过程，还不足以导致非癌症细胞的恶化。为了更好地阐明他们在下调细胞中所看到的这种效应的具体机制，Kumar等人发现在所有被测试的致癌基因中，只有MYC和KRAS的蛋白水平显著升高。他们指出miRNA在转录后水平直接调节Myc基因的表达。利用miRNA靶标预测程序，Kumar等人发现Myc和Kras基因的3′ UTR是let-7家族miRNA的靶标；随后在实验中也验证了这一发现。把他们在体外的发现扩大到小鼠模型中，他们在非小细胞肺癌细胞中，可以很容易地诱导出一种带有条件控制的、可激活的Kras等位基因——LSL-KrasG12D。当这些小鼠同时都是Dicer1条件型等位基因的纯合子或者杂合子的时候，它们就可以生长出更多的肿瘤细胞，而且比那些较小的小鼠的肿瘤要大。综合其它相关报道，对人类癌症中miRNA的全面抑制并不伴随着转录的前体miRNA水平的降低，这项研究表明在一些人类癌症细胞中，miRNA的加工机制似乎遭到了破坏。Kumar强调他们的研究工作和先前的与肿瘤相关的miRNA特性的研究报道并非直接相抵触。

美国《科学》周刊分别于２００１年、２００２年初评出上一年度的世界十大科学突破，ＲＮＡ研究均位居第二：生命可能始于ＲＮＡ，而非ＤＮＡ；ＲＮＡ干扰在使哺乳动物细胞的基因表达沉默和ＲＮＡ在调控方面的很多新发现超出了科学家原先的想象。国际上，ＲＮＡ研究正在受到人们前所未有的关注。 中、美、日、德、法、英六国科学家和美国塞莱拉公司于２００１年２月１２日联合公布人类基因组图谱及初步分析结果。经初步分析，人类基因组共有３万至３．５万个基因，蛋白质合成有关的基因只占整个基因组的２％。由此产生一些问题：第一，如果一个基因仅编码一个蛋白质，这么少的蛋白质如何维持人体那么复杂而多变的生命现象？科学家估计人体中蛋白质数远大于现在发现的基因数。第二，如果一个基因可以表达出多种蛋白质，生物又是如何做到这一点的？第三，余下的不编码蛋白质的９８％的基因组有何功能？针对这些问题，ＲＮＡ研究和ＲＮＡ组学研究可以提供部分解答。 传统观念认为：三类最重要的生物高分子化合物中，ＤＮＡ携带遗传信息，蛋白质是生物功能分子，而ＲＮＡ在这二者间起传递遗传信息的作用（即参与蛋白质的生物合成）。１９８０年代初，美国科学家切赫（Ｔ．Ｃｅｃｈ）发现ＲＮＡ也可成为生物催化剂，他命名这种ＲＮＡ催化剂为核酶。在酶学领域，核酶的发现打破了多年来“酶的化学本质就是蛋白质”的传统观念。在ＲＮＡ领域，这一发现对传统观念的冲击更大，它使人们认识到ＲＮＡ的生物功能远非“传递遗传信息”那么简单。此后，ＲＮＡ领域的新发现不断出现。 基因组研究中的“垃圾”可能是ＲＮＡ基因。在基因组研究过程中，科学家发现了大量的不编码蛋白质的重复序列。它们一度被称为“垃圾”，而这种“垃圾”在越是高等的生物中含量却越多。现在发现，这些“垃圾”中的一种，称为Ａｌｕ家族的序列，被认为是反式可移动元件，可调控邻近基因的表达。基因组中，蛋白质合成有关的基因只占整个基因组的２％，而编码非蛋白质的各种ＲＮＡ基因占基因组的比例要大得多，可能要高一个数量级。由于发现ｍＲＮＡ的５′和３′非编码区也有调控功能，所以非编码（蛋白质）的ＲＮＡ基因数很可能大于蛋白质基因数。 ＲＮＡ控制着蛋白质的生物合成 生物体内绝大多数的生物化学反应均由酶（蛋白质）催化控制，因此，蛋白质的生物合成由谁催化，一直是人们关注的问题。核糖体是一由３～４种核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）与几十种蛋白质组成的核糖核蛋白体，是蛋白质生物合成的场所。多少年来，人们在努力寻找催化蛋白质生物合成的关键——转肽酶。直到２０００年，核糖体大、小两个亚基均得到了结晶，并获得了高分辨率的Ｘ射线衍射分析图谱。图谱分析表明，在肽键形成处２纳米的范围内，完全没有蛋白质的电子云存在。这说明肽键的形成不可能由蛋白质催化，而只可能由ｒＲＮＡ催化。核糖体是核酶，这成了２０００年的世界第二大科学成就之一。 生命起源：ＲＮＡ世界１９８１年度诺贝尔化学奖获得者吉尔伯特（Ｗ． Ｇｉｌｂｅｒｔ）提出了“ＲＮＡ世界”的假说。它指的是“在生命起源的某个时期，生命体仅由一种高分子化合物ＲＮＡ组成。遗传信息的传递建立于ＲＮＡ的复制，其复制机理与当今ＤＮＡ复制机理相似，作为生物催化剂的、由基因编码的蛋白质还不存在”。ＲＮＡ由于其五碳糖２′位是羟基，化学活泼性远大于ＤＮＡ，再加上其他原因，就特别容易发生突变，因此在携带遗传信息的能力方面，ＲＮＡ不如ＤＮＡ；ＲＮＡ又由于组成没有蛋白质复杂，不可能形成如蛋白质那么多样的结构，因此在功能分子的作用方面，ＲＮＡ又不如蛋白质。但ＲＮＡ是唯一的既能携带遗传信息又可以是功能分子的生物高分子化合物。因此，生命发生之初，很可能是在原始海洋深处的火山口边，高温、高压的条件下，在可作为催化剂的矿物质边富集了可能是雷电中合成的原始核苷酸。经过亿万年的进化，形成了具有自我复制能力的ＲＮＡ。在人工条件下，这种进化的某些过程已被成功地模拟。原始的具有自我复制能力的ＲＮＡ，再在以后的亿万年进化过程中，逐渐将其携带遗传信息的功能传给了ＤＮＡ，将其功能分子的功能传给了蛋白质。核糖体是核酶的发现大大支持了ＲＮＡ世界的假说。 ＲＮＡ的运动功能与调控功能ＲＮＡ虽然只由４种核苷酸组成，但核苷酸的修饰增加了ＲＮＡ结构的复杂性，为ＲＮＡ功能多样性提供了物质基础。一些ＲＮＡ如ｒＲＮＡ中，核苷酸的甲基化修饰和假尿嘧啶的生物合成，以及ｒＲＮＡ的加工和细胞定位转运，均有一类核仁小分子ＲＮＡ(ｓｎｏＲＮＡ)参与。ｓｎｏＲＮＡ参与的ＲＮＡ修饰并不局限于ｒＲＮＡ一种，被修饰的ＲＮＡ种类不断被发现。 ＲＮＡ具运动功能。中国旅美学者郭培宣发现：一种细菌病毒（噬菌体）装配依赖于ＲＮＡ的运动功能。 ＲＮＡ的调控功能是近年ＲＮＡ研究的主要突破。 男性第２３对染色体是ＸＹ，女性的第２３对染色体是ＸＸ。如果女性两条Ｘ染色体都能正常表达的话，女性Ｘ染色体编码基因的表达量将是男性的两倍。事实上男性与女性Ｘ染色体编码蛋白的表达量是一致的。其原因是哺乳类动物细胞中有一Ｘｉｓｔ基因，它不编码蛋白质，但可被转录成ＲＮＡ，即ＸｉｓｔＲＮＡ。Ｘｉｓｔ ＲＮＡ可通过一复杂的过程，与２条Ｘ染色体中的一条结合，使其失活。生命过程有时序性。如线虫生长过程中有幼虫１期、幼虫２期、幼虫３／４期和成虫期四个不同的发育阶段。有一些不编码蛋白质的小ＲＮＡ（称为反义ＲＮＡ），如ｌｉｎ－４ＲＮＡ、ｌｅｔ－７ ＲＮＡ等，前者控制幼虫１期到幼虫２期的过渡，后者控制幼虫３／４期到成虫期的过渡。 在细胞周期调控中，一种ｍｅｉＲＮＡ调控细胞从Ｇ１期进入Ｓ期。天然反义ＲＮＡ对ＤＮＡ复制、ＲＮＡ转录、蛋白质生物合成的调控的事例已越来越多。 染色体ＤＮＡ的３′末端在端粒酶的作用下，以端粒ＲＮＡ(一种小分子ＲＮＡ)为模板，合成一段ＤＮＡ——端粒。细胞分裂时，ＤＮＡ每复制一次，端粒ＤＮＡ会短一点，直到端粒全部消失。此时细胞再也不能分裂，走向死亡。成人正常细胞没有端粒酶和端粒ＲＮＡ，而癌细胞含有端粒酶和端粒ＲＮＡ。所以，我们也可说是端粒ＲＮＡ，控制了细胞的寿命和癌症的发生。 ＲＮＡ携带与调制遗传信息在一些病毒中，是ＲＮＡ携带遗传信息，而不是ＤＮＡ携带遗传信息。属于ＲＮＡ病毒的有烟草花叶病毒等侵染植物的病毒，鸡法氏囊病病毒等侵染动物的病毒。它们大多对农牧业生产有巨大的危害。与艾滋病有关的ＨＩＶ病毒，以及严重危害人民健康的丙肝病毒等也是ＲＮＡ病毒。乙肝病毒虽是ＤＮＡ病毒，但在其生命周期中，需要经过一全长ＲＮＡ的过程。 ＲＮＡ调制遗传信息。如酵母、植物、动物等真核生物（细菌等不是真核生物）的基因有很多是断裂基因。即基因的初始转录物（ｍＲＮＡ前体）中，一段段的蛋白质编码区被居间序列分开。只有居间序列被去除后，也即成熟了的ｍＲＮＡ，才能成为蛋白质生物合成的模板。这过程称为ＲＮＡ剪接。通过不同方式的ＲＮＡ剪接，一种基因可在不同的发育分化阶段、在不同的生理病理条件或不同的细胞、组织中合成不同的蛋白质。果蝇的性别决定就是通过不同的剪接途径完成的。ＲＮＡ剪接在ＲＮＡ水平上调控基因的开放和关闭，增加或减少遗传信息，使一种基因合成出多种蛋白质。 很多生物的ｍＲＮＡ在成熟过程中，均需经ＲＮＡ编辑。一种ＲＮＡ编辑是以另一ＲＮＡ为模板来修饰ｍＲＮＡ前体的。通过编辑，可以给ｍＲＮＡ前体添加新的遗传信息。添加最多的实例中，来自原始基因的遗传信息只占成熟ｍＲＮＡ的４５％，其余５５％的遗传信息来自其他ＲＮＡ。现在生物体内发现有８种不同的ＲＮＡ编辑方式。不同编辑方式，可以在ＲＮＡ水平上调控基因的开放和关闭，增加或减少遗传信息，使一种基因合成出多种蛋白质，从而调控生物的不同发育分化阶段等。 在蛋白质生物合成过程中，除了常规的合成规律外，还发现有４种被称为“再编码”的方式。通常情况下，ｍＲＮＡ编码区中的每三个核苷酸组成一个密码子，每个密码子可按一定的密码表翻译成一个氨基酸，或用作翻译的起始和停止信号。这种情况下，编码区的每个核苷酸只能也必须被阅读一次。但在再编码过程中，有的核苷酸被跳过而没有被阅读，有的核苷酸却被阅读了两次，有的密码子被用来翻译特殊的氨基酸。因此，经过再编码，一个基因可合成出多种蛋白质或改变遗传信息量。 从上可知，遗传信息从ＤＮＡ到蛋白质的过程中，ＲＮＡ并非只是起简单的传递遗传信息作用，ＲＮＡ通过各种剪接、编辑和再编码等方式，调控基因表达的方向，调制遗传信息。 ＲＮＡ与疾病关系及ＲＮＡ研究的应用很多ＲＮＡ的突变或异常可以引起疾病，如红斑狼疮、重症肌无力、某些ＩＩ型糖尿病、某些帕金森病、某些老年性痴呆等均由某些ＲＮＡ异常引起。必须指出，ＲＮＡ研究相对落后，然而随研究的发展，将会发现更多的由ＲＮＡ引起的疾病。一些ＲＮＡ突变常造成蛋白质合成障碍或蛋白质合成错误率的增加，因此，一种ＲＮＡ突变，常可因其发生部位如组织细胞的不同，影响到不同的蛋白质，而引起不同的疾病。不同ＲＮＡ的突变又可能因为发生在同一种细胞或组织中，而引起同一种疾病。也可因引起一系列蛋白质合成的错误，而表现为综合征。这种特性增加了这类ＲＮＡ疾病的研究难度。 ＲＮＡ异常致病研究有助于了解疾病发生机理，为治疗疾病找到合适的途径。 ＲＮＡ可应用于制药、基因工程等。１９９０年代初，核酶的应用研究迅猛发展，现已有多种核酶药物进入ＩＩ期临床研究。从１９９０年代初开始，由反义ＲＮＡ发展而来的反义寡脱氧核苷酸类药物（包括三链形成寡脱氧核苷酸）同样发展迅猛。１９９８年第一种反义核酸药物在美国获得ＦＤＡ批准正式进入临床应用。现进入各期临床研究的反义核酸药物有数十种。近年来，通过体外筛选技术，发展核酸类抗体药物的工作也很热门。因为它具有蛋白质抗体的优点，而且没有蛋白质类抗体的人源化问题和在人源化途径中滴度下降的问题。ＲＮＡ干扰的应用研究也迅速展开，已有多个这方面的专利出现。ＲＮＡ还有ＲＮＡ水平的扩增、ｔＲＮＡ介导的基因工程等应用。ＲＮＡ组学的提出基因组的研究最终可以提供给人们全套的ＤＮＡ序列，从中可以检出所有的蛋白质基因。由于每个细胞都有全套的遗传信息，但在不同的生长发育阶段、不同的组织或不同的生理病理情况下，表达的蛋白质谱是不一样的。因此１９９５年提出了蛋白质组学以研究蛋白质在不同时空情况下的表达及其生物学意义。由于ＤＮＡ与蛋白质的不完全对应性，１９９７年又有人提出了转录组（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）计划，主要研究蛋白质基因转录的时空关系及其生物学意义。但是如上所述，ＲＮＡ的生物功能远远超出了作为遗传信息传递中介的ｍＲＮＡ的功能范围，所以研究所有上述各种ＲＮＡ在内的所有ＲＮＡ的时空表达情况及其生物学意义，将在全面破解生命奥秘过程中发挥重要作用。 中外科学家都注意到了以此为研究对象的ＲＮＡ组问题。我国科学家在１９９８年１２月第１０９次香山科学会议、２０００年１月第１１次东方科技论坛和２０００年３月国家重点基础研究计划(９７３项目)评审会上，提到了“开展功能ＲＮＡ组研究”的问题。国外在２０００年底提出了ＲＮＡ组学（ＲＮｏｍｉｃｓ）。ＲＮＡ组学研究将会在探索生命奥秘中和促进生物技术产业中，作出巨大贡献。如果说基因组学正全力构筑生命科学基石的话，那么ＲＮＡ组学和蛋白质组学、生物信息学等都是它不可缺少的同盟军。

靶向血管紧张素Ⅱ受体基因的短发夹RNA的功能比较【关键词】 RNA干扰；高血压；血管紧张素Ⅱ受体；载体Gene silencing targeted to the rat AT1 receptors by efficient shRNAs and its screening 【Abstract】 AIM: To investigate the efficacy of short hairpin RNAs (shRNAs) to modulate the expression of rat angiotensin Ⅱ type1 (AT1) receptor gene in mammalian cells and to explore the correlations between the features of efficient shRNAs and shRNAs functionality. METHODS: We generated 4 shRNAs expression vectors targeting against rat angiotensinⅡ receptors. The shRNAs were targeted to 4 different regions of the same gene. The rat C6 glioma cells were transfected with constructed pGenesil1shRNA plasmid and scrambled plasmid. The cultured cells were collected at different phases for RTPCR and Western blot analyses. RESULTS: 24 h later, no significant reduction in AT1 mRNA levels at all treated groups could be detected. 48 h later, AT1 mRNA level of Pb treated group droped to (±)% of that in control group, and reached their lowest point after 72 h (±)%. No significant inhibition of AT1 receptor mRNA expression was found in other groups (P＞). The AT1 mRNA and protein levels behaved ultimately similarly. At hour 24 and 48, the AT1 protein was (±)% and (±)% respectively compared to control and a maximum reduction was observed after 72 h incubation 〔(± compared to controls)〕. CONCLUSION: Besides some general rules, we believe that the loop structure in the mRNA at the region targeted by siRNA and the better accessibility of the siRNA to targeted mRNA do have a strong effect on silencing. 【Keywords】 RNAi; hypertension; angiotensinⅡreceptor; vector 【摘要】 目的：研究哺乳动物细胞中shRNA调节大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体基因表达的有效性并探索有效shRNA的特征与shRNA功能性之间的关系. 方法：设计并构建四个靶向大鼠AT1受体基因不同区域的shRNA表达载体，转染大鼠神经胶质瘤C6细胞，并在不同时相收集转染的细胞，进行RTPCR和Western blot检测. 结果：转染24 h之后，各处理组均未见AT1 mRNA水平有明显减少. 与对照组相比，Pb组在转染后48 h血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因水平下降到（±）%，72 h后达到最低点（±）%. 其它组AT1受体mRNA表达无明显抑制(P＞). 抑制大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果类似. 与对照组相比，Pb组血管紧张素Ⅱ受体蛋白在24 h和48 h分别减少至（±）% 和（±）%，最大减少在转染后72 h （±）%. 结论：选择有效的shRNA序列时，除了一般的原则之外，靶位mRNA的环状结构及siRNA是否能到达靶位对基因干扰实验能否成功具有重要作用. 【关键词】 RNA干扰；高血压；血管紧张素Ⅱ受体；载体 基因干扰（RNA interference）可以特异性地靶向降解目的基因mRNA，从而使组织或细胞中的靶基因表达减少或沉默〔1〕. 在本实验中，我们采用RNAi技术，拟靶向降解大鼠神经胶质瘤C6细胞中的血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）的mRNA，选取并合成了多条编码大鼠AT1R mRNA的短发夹RNA（shRNA）的核苷酸单链，退火形成双链结构并将其克隆进入质粒载体，在构建完成四条编码AT1R shRNA的表达载体之后，转染C6细胞. 根据不同核苷酸序列shRNA质粒在哺乳动物细胞内的功能表达，研究核苷酸序列及碱基不同的shRNA其靶向沉默大鼠AT1R的作用差别，探索筛选有效shRNA的原则. 1材料和方法 1．1材料载体pGenesil1质粒购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司，限制性核酸内切酶BamHⅠ，HindⅢ，SalⅠ，PstⅠ购自大连宝生物工程有限公司; T4 DNA连接酶及缓冲液购自New England Biolabs公司; 大鼠神经胶质瘤细胞株C6细胞购自中国典型物保藏中心; 细胞培养液DMEM购自Hyclone公司; 转染试剂Metafectamine购自德国Biotex公司. 所有的DNA合成及引物合成服务均由上海博亚生物技术有限公司提供. 1．2方法 1．2．1靶基因AT1R mRNA的shRNA的构建在GenBank上选取大鼠AT1R的基因序列（序列号NM_030985），利用网上设计软件siRNA Target Finder，选取siRNA以碱基TT结尾、长度为21个核苷酸的序列，并且GC含量最大不超过60%，剔除含有连续四个或四个以上的A或T碱基的核苷序列，并通过BLAST验证的靶基因核苷酸序列四条，化学合成编码shRNA序列的DNA前向和反向序列单链如下：靶基因核苷酸序列同时设计一对非特异性序列作为阳性对照. 将合成的shRNA序列退火，与线性化的pGenesil1质粒连接，转化并提阳性克隆，PstⅠ和SalⅠ酶切和测序鉴定证实.以上不同的靶基因序列质粒分别称为pGenesilA（Pa），pGenesilB（Pb），pGenesilC（Pc）和pGenesilD（Pd）质粒. 1．2．2细胞培养及转染按2×108/L密度以相同的细胞数接种培养板，过夜至细胞铺满50%～60%. 用Metafectamine转染细胞，按1∶6的比例，根据试剂提供商的转染方案进行转染. 1．2．3RTPCRAT1基因引物序列为：5′TGTTCCCTTTCCTTATCATTCT3′, 5′CTTTGCTTGGTTACT CCTTCA3′，内参GAPDH的引物序列为：5′TTCAACGGCACAGTCAAGG3′, 5′TTAGTGGGGTCT CGCTCC3′. 反应体积25 μL包括5 μL cDNA，各引物 μL， μL MgCl2， μL Taq DNA聚合酶， μL dNTP混合物和5 μL 10×缓冲液. 反应条件: 在94℃退火3 min之后，94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s进行30个循环. 毕后，产物上琼脂糖凝胶电泳. 1．2．4Western Blot分析转染pGensilAT1shRNA质粒和对照质粒之后，不同时相收获C6细胞. PBS液洗涤后，上样缓冲液溶解细胞. 煮沸溶解液10 min后，离心，取上清，弃沉淀物. 确定蛋白浓度. 电泳分离细胞溶解液，转膜. 50 g/L脱脂奶封闭后，加入抗AT1抗体（1∶1000）和抗βactin抗体（1∶1500）室温下孵育 h，再加入二抗（抗兔HRP抗体）孵育，增强型化学发光显色.统计学处理：根据RTPCR和Western Blot分析结果，用图像处理软件ImageTool 测灰度值，并与内参照相比得相对值. 用SPSS 统计软件oneway ANOVA进行组间方差分析. 显著性水平为P＜. 2结果 2．1不同shRNA表达质粒靶点及二级结构我们选择大鼠血管紧张素Ⅱ受体基因mRNA序列的部分序列,即556~575 bp，469~488 bp，595~614 bp， 663~682 bp,做为基因沉默靶位（图1）. 构建了四条碱基序列不同的pGenesilAT1shRNA质粒，预计产生的短发夹RNA如图2所示. 除在3′端缺乏两个连续的胸苷之外，AT1shRNA的正义链与大鼠AT1基因的mRNA序列的靶位基因序列是相同，反义链与靶序列互补. 其转录产生的RNA，预计可以折叠成短发夹siRNA. 所转录出的shRNA在理论上应可裂解靶基因mRNA，而经重新洗牌的对照质粒所转录出的shRNA则不应对AT1受体基因产生有效的基因沉默效应. 2．2AT1shRNA转染后AT1 mRNA水平和蛋白表达转染四组阳性质粒24 h后，各组AT1 mRNA水平无明显减少. 在48 h后与对照组相比，转染Pb质粒组的AT1 mRNA表达水平下降到（±）%，72 h下降到最低点〔仅为对照组的（±）%〕. 转染重新洗牌的siRNA大鼠神经胶质瘤C6细胞其AT1受体mRNA表达水平无明显抑制(P>). 结果提示，Pb质粒明显抑制了AT1受体mRNA基因的表达，其它三组质粒抑制AT1受体mRNA基因作用不显著（图3，4）. 将抑制AT1受体mRNA有效的Pb质粒进行Western Blot分析. 在24 h和48 h，AT1蛋白的表达分别为（±）% 和（±）%. 与对照组相比，表达减少的最大时相在转染后的72 h〔仅为对照组的（±）%〕. 结果表明，Pb质粒转染的细胞，AT1蛋白水平下降. 而转染重新洗牌的shRNA质粒和对照组则并不能减少AT1基因的表达（图5）. 所有的结果清楚表明，转染Pb质粒能够抑制AT1基因的表达. 3讨论 肾素血管紧张素系统其主要的效应分子血管紧张素Ⅱ具有调节血压、水钠平衡、神经功能等作用. 研究证实，血管紧张素Ⅱ参与了动脉硬化、心肌梗塞、血管和心肌重塑以及充血性心力衰竭的病理生理过程. 血管紧张素Ⅱ通过直接激活AT1R并间接刺激一些生长因子和细胞因子的释放，诱导心肌细胞,血管细胞肥厚和增生〔2〕. 同时也可刺激AT2，激活与AT1相反的生物学效应而导致血管扩张、缓激肽生成增加、抑制纤维化和血管重塑〔3〕. 本研究构建AT1短发夹RNA表达质粒，试图用基因沉默技术抑制哺乳动物细胞的AT1 mRNA的表达，希望在阻滞AT1受体之后，通过血管紧张素Ⅱ对AT2的作用，达到血管扩张，降低血压、抑制血管重塑等目的〔4〕. 实验结果表明，我们观测到AT1基因mRNA的表达在早期即有减少，而随着mRNA水平的抑制，相应的蛋白也有所减少. 结果表明，U6启动子驱动的shRNA序列可有效地和特异地抑制AT1基因在转染的C6细胞中的表达. 因此，通过shRNA的表达，在细胞中抑制与高血压病理生理相关的AT1基因的表达，有可能成为一种有效的治疗方法. 目前尚无选择siRNA序列的共识性意见或标准〔5〕. 为了优化siRNA诱导的基因沉默效率，许多研究小组对寡核苷酸长度、二级结构及siRNA双链的序列特异性进行了研究. 普遍认为〔6〕，siRNA序列应在靶基因起始密码子下游100个碱基之后进行选择，应避开起始密码子的5′或3′端非编码区选择siRNA序列. 选择的正义链序列应是AA（N19）TT，其中N代表任何核苷酸，即选择的siRNA应该有两个尿嘧啶核苷的3′突出末端. 并且所选的siRNA的长度应是21个核苷酸. 决定RNA干扰研究成功与否的因素还有很多，包括靶位在mRNA三级结构中的位置、转染效率以及双链shRNA的特异性等〔7-8〕. 在比较本实验中设计的四条质粒时我们注意到，其中Pc和Pd的靶向裂解部位均位于靶基因mRNA二级结构中的核心位置尤其以Pd明显，这可能是质粒转染细胞后转录产生的短发夹RNA在与RISC (RNA诱导的基因沉默复合物)结合后无法进入靶mRNA裂解部位而导致实验失败的原因之一. 而Pa和Pb的靶向裂解部位位于靶基因mRNA二级结构中的表面位置，但质粒Pa也无效，分析可能的原因：①质粒Pa的GC含量偏低可以导致对靶基因mRNA的识别效率的减少; ②与RISC杂交效率的下降. 除此之外，我们还发现Pb质粒裂解靶基因的局部二级结构比质粒Pa裂解的部位更松散一些，也就是前者靶位中的氢键相对弱于后者的靶位. 在这些影响因素中，我们认为最重要的因素是siRNA能否进入靶位，而靶位中mRNA的结构是否足够松散，允许siRNA与RISC复合体进行靶向裂解. 总之，在进行短发夹RNA设计时，除了要遵循如靶序列应位于开放阅读框，而不能选择非编码区；GC含量应在50%左右；避开起始密码子后至少100个碱基；搜索5′AA（N19）序列并进行BLAST等一些普遍的规则〔9〕之外，我们认为siRNA能否进入靶裂解部位并且靶位的二级结构是否松散是有效shRNA合理设计并取得实验成功的最重要的因素. 【参考文献】 〔1〕 Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al. 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