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二代高通量测序技术已广泛应用于疾病和癌症的研究，但由于其短读长的特点，对结构变异的检测有一定的局限性。以Pacbio和ONT为代表的三代长读长测序技术弥补了这一不足，但因成本相对较高限制了其广泛应用。三代目标区域测序技术，不仅保留了长读长的测序优势，又可以针对感兴趣的基因或区域以更高的性价比进行高深度测序研究。目前，三代目标区域测序技术已被应用于疾病或癌症领域HLA、STR、融合基因、甲基化检测等研究中。目标区域富集的方法主要有三类：长片段PCR扩增、CRISPR/Cas9靶向捕获和液相探针捕获。下面为大家进行一一介绍。 长片段PCR扩增因其引物设计成本低，实验流程规范，是基因组靶向富集常用的方法之一。但PCR过程中容易产生嵌合体、出现参考比对偏差[1]，此外，基因组的复杂区域和高GC区域往往会影响PCR扩增效果，制约了其应用范围。长片段PCR扩增一般适用于非复杂区域变异检测研究。 Long-Read Nanopore Sequencing Validated for Human Leukocyte Antigen Class I Typing in Routine Diagnostics[2] 发表期刊：The Journal of Molecular Diagnostics（IF:5.561） 发表时间：2020年7月 人类白细胞抗原(HLA)的高分辨率分析是确定造血干细胞移植患者和供者相容性的金标准。Nanopore长读长测序能够直接跨越HLA区域，提供明确分型，但碱基的高错误率限制了其应用。该文章中第一阶段，选择已知HLA分型的33例样本，针对HLA I类基因 HLA-A 、 HLA-B 、 HLA-C 进行了特定基因全长扩增（扩增引物见表1），使用MinION 1D2建库试剂盒（SQK-LSK308）建库，MinION测序，使用2种HLA分析软件JSI和GenDx进行HLA分型分析，结果表明其分型结果与前期Sanger测序分型结果100%一致（表2），MinINO测序和分析流程图见图1。为了进一步验证该方法，第二阶段选择了67例临床样本进行MinION测序分析，与Sanger测序数据分析结果一致，该结果进一步表明了纳米孔测序技术已经发展到可以用于常规诊断并具有较高的准确性。 表1 扩增引物 表2 33例样本MinION分型结果和Sanger分型结果对比（仅展示前3行） Cas9靶向捕获技术，首先将DNA末端去磷酸化，然后用Cas9/guideRNA复合物引入新的切口，将测序接头特异性连接到剪切区域，从而达到靶向测序的效果。该技术无PCR扩增环节，可以同时进行结构变异、STR及碱基修饰鉴定等研究。 Targeted Nanopore Sequencing with Cas9-guided Adapter Ligation[3] 发表期刊：Naute Biotechnology（IF:54.9） 发表时间：2020年4月 目前的测序方法仍然受到无法检测碱基修饰，读长过短，核酸总量要求高，产量过低或实验流程过长等限制。该文章中作者开发了一种基于Cas9靶向捕获的纳米孔序列方法（nanopore Cas9-targeted sequencing，nCATS），该方法使用基于CRISPR–Cas9的靶向DNA捕获策略（图2A），将捕获的DNA进行纳米孔长读长测序。该文章表明nCATS技术可以同时进行SNP，SV，单体型和CpG甲基化鉴定。文章中研究发现多种guideRNAs组合可将 KRT19 基因的覆盖率从47X提高到407X（图2B），MinION整个cell的覆盖率中位数提升到680X（图2C）。文章中将nCATS方法在GM12878细胞系上检测的SNV与白金数据集进行比较，验证了双链数据过滤后SNP检测的准确性，结果显示只有一个假阳性位点存在于胸腺嘧啶密集的均聚物区域。将nCATS甲基化数据与WGBS数据进行了比较，结果显示每个CpG相关性为0.81。该方法将促进长读长测序技术在医学研究和临床中的应用。 针对感兴趣的基因或区域定制特异性探针，通过探针与基因组DNA进行杂交，将目标区域片段捕获富集后进行测序分析研究。但该技术由于建库环节中存在PCR扩增环节，会丢失碱基修饰信息，且需要额外考虑定制探针的周期。 Efficient Sequencing, Assembly, and Annotation of Human KIR Haplotypes[4] 发表期刊：Frontiers in Immunology（7.561） 发表时间：2020年10月 天然杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)区域具有高度同源性、重组率、多态性及重复序列等特点，利用二代高通量测序不能得到完整的单倍型信息。文章中提出了一种自主设计探针捕获目标区域，利用长读长测序来组装人类二倍体 KIR 单倍型的新方法。该方法设计了18个捕获探针来捕获 KIR 区间长度为2-8kb的DNA片段。采用PacBio Sequel平台CCS模式进行测序，使用Canu软件进行组装，按照 KIR 基因划分区域，基于每个基因和 KIR 全长进行组装，最后注释序列的位置信息。为了评估该流程的可靠性，作者对16个样本（单倍型信息已知）进行组装和注释评估。组装结果表明，仅使用18个探针对 KIR 区域进行捕获，就覆盖了参考基因组的97%，序列一致性为99.97%。该研究所提出的靶向探针捕获测序方法是第一个对人类所有 KIR 二倍体进行完整测序和组装的方法，可以有效地应用于人群规模研究和临床研究中。 综上，三代目标区域测序技术有PCR扩增，Cas9靶向捕获和探针液相捕获三类靶向富集方法，其优劣势总结如下（表3），可结合具体研究需求进行选择。 表3不同目标区域捕获方法比较汇总 参考文献 [1]Laver TW, Caswell RC, Moore KA,et al.Pitfalls of haplotype phasing from amplicon-based long-read sequencing[J]. Scientific Reports. 2016;17(6):21746. [2]Matern BM, Olieslagers TI, Groeneweg M, et al. Long-Read Nanopore Sequencing Validated for Human Leukocyte Antigen Class I Typing in Routine Diagnostics[J].The Journal of Molecular Diagnostics. 2020 ;22(7):912-919. [3]Gilpatrick T, Lee I, Graham JE, et al. Targeted nanopore sequencing with Cas9-guided adapter ligation[J]. Naute Biotechnology. 2020;38(4):433-438. [4]Roe D, Williams J, Ivery K, et al. Efficient Sequencing, Assembly, and Annotation of Human KIR Haplotypes[J]. Frontiers in Immunology . 2020;9(11):582927.
光从基因表达谱找有异常表达的基因也不全面。做出来的基因表达谱往往有很多基因存在差异，有的可能是一些下游的免疫生物学反应，有的可能是误差或个体差异（尤其是做的数量少时），剩下的可能才有加以考虑的价值。 另外，有时疾病易感基因本身表达并无改变，而是通过调控其它基因发挥作用。所以，致病基因的寻找应从多种途径着手。 一孔之见，如有谬误之处，请大家指教。 多谢verygood 兄，我的第一步可能只能做到表达谱的改变这一层次，如果有机会做下去的话，如你所言，应该从各种途径全面考虑。我现在的想法是以表达谱基因芯片技术为核心方法，做出患者和正常人小梁细胞基因表达谱的差异的总体信息，如maxon和你所说，这样可能找到新的致病相关基因，也可能不行，我想着起码是一个方面吧（不知对不对）。 我目前所能考虑的是如何组织自己的思路，来吧这个工作做好。还有几个问题请教： 1.基因文库的建立方法中，比如有一篇文章中选了1118个基因进行研究，通过BLAST，分成了已知基因、已知序列、未知基因等几类，我不明白他们是如何从基因文库（提取细胞全mRNA逆转录来的)中选定的?(还是从别的地方查到的?)，我理解好像是直接测序，请问是如何从基因文库中找出（分离）这些基因一一测序的？ 2.如何使用BLAST？比如同一文章中所说的已经测定出的1118个小梁细胞的表达谱基因序列我如何能查到？能给我讲解一下吗？太感谢了 有没有注意到一个问题,基因芯片只能检测已知的基因或序列,对于那些未知的则无能为力,一孔之见. Andrew说得不错，不过芯片中的基因数也在随对基因研究的深入而在不断增加。对普通的研究来说，主要的已知通路基本已能包括。 多谢指教。有能回答我上面几个问题的吗？我还是有些不明白，看了一天资料也没有明白。 请问：如果我用一个正常群体的基因表达谱cDNA定做了一个芯片（含已知的1118个基因），在与患者cDNA样品的杂交中发现有一个基因表达下调了或者不表达，其原因是什么呢？是真的没有表达还是别的？ 多谢多谢 样本是否一致？比如血细胞，其细胞亚群是否有可比性？ 有对照吗？ 样本是随机样本，小梁细胞是均一的内皮细胞。至于对照，你指的是阴性对照、阳性对照还是转录的内对照？ 小弟所知甚少，低级错误也可能犯，请多多指教。 除去实验和DNA芯片误差外，在与患者cDNA样品的杂交中发现有一个基因表达下调了或者不表达，需要用RT-PCR进行验证。其表达的下调或不表达，可能是受到其上游基因的调控，也可能是基因本身结构有改变，如无义突变可检测到表达的下降。对这些经RT-PCR证实后，应该进行测序，察看这些基因是否有结构的异常。 在天天站长和各位战友的帮助下，我对现在所申请的课题从无知到略懂，终于完成了自然科学基金申请书的写作，在明天，我们的这份凝结着大家的汗水和智慧的申请书就要送出去之前，对各位这几天来的帮助表示诚挚的感谢，尽管这是我第一次写这样的申请，尽管几乎没有中的可能，我还是觉得自己学到了很多东西，也结识了很多好朋友，真诚的感谢给了我这个机会！ 我把这份申请的正文部分放在了附件里了，希望感兴趣的朋友可以看一下，提一些宝贵意见，因为我认为这样的一个课题还是很值得去做的，尽管我们可能没有这个机会和能力去做。 再次感谢大家啦！ 88411-.doc (76.5k) 恭祝申请成功！！ 谢谢天天站长的指教，谢谢各位战友。 近日科研基金开始申报，老板急命申请课题。由于对基础刚刚接触，故请教站长以及各位战友。 1目前收集到一少见的单基因病（癫痫方面），在国内未见临床和基础报道。临床工作，包括留取血样已经完成。 2本病自从98年以来，致病基因得到了定位和克隆，但存在遗传异质性，相同的致病基因的突变位点也不相同。多篇文章发表在nature genetic等权威杂志上。最新的研究显示，仍有其他未知的致病基因。 3合作实验室，有曾经成功的定位和克隆了一例致病基因的经验。 我们申请的目的是致病基因的定位和克隆，并有望发现新的致病基因。 想请教各位： 1在目前仅仅掌握临床资料的情况下，能否提出申请？ 2还需要做那一方面的工作？ 2如果可以，可能申请失败的原因是什麽? 谢谢各位，急切盼望指教！谢谢 如果是单基因疾病，那要看你收集的家系怎么样了。另一个问题主要是你的临床诊断正确与否。我不是临床的，这个临床诊断事关重大，如果有些是诊断错误或分型有误的，很有可能导致无法discover disease gene 单基因疾病这方面的技术策略已经很成熟，有很多文献可以参考。国内也有多家研究机构在做。 我想研究下某个基因SNP与一种疾病的关联。国外已有报道在2个位点上有联系。那么我是进行RFLP分析，还是用SNP分析？ 各位大侠，我最近在做一个X染色体连锁遗传家系的疾病相关基因的定位，现在已用两个位点的MARKER(STR)做了基因组扫描，但是在连锁分析时遇到了困难，我用的是LINKAGE(version 5.1). 我想请教各位在进行连锁分析时，性连锁与常染色体连锁遗传参数设置有何不同？急盼各位予以赐教，不胜感激！ 答无事转转 我想研究下某个基因SNP与一种疾病的关联。国外已有报道在2个位点上有联系。那么我是进行RFLP分析，还是用SNP分析？ RFLP是最早期的遗传标记(第一代)，随着遗传学的发展和测序片段的不断增多，已出现了第二代、第三代遗传标记。RFLP通过酶切作用进行分析，操作简单，花费不多，但特异性差，有被淘汰的趋势；SNP定位明确，相对花费较大，对其分析可以通过测序、小测序(Snapshot)、荧光探针、SNP芯片等方法。 具体行RFLP分析，还是用SNP分析看你的研究目标和经济实力。 请教verygood，能否介绍一下小测序（snapshot）？ 我最近想检测某基因与疾病的关系，外显子较多（20），在其他疾病中已有突变热点（9、11、13、17exon），但我要研究的病未见报道。请问我应对所有外显子测序吗？ coldant wrote: 请教verygood，能否介绍一下小测序（snapshot）？ 我最近想检测某基因与疾病的关系，外显子较多（20），在其他疾病中已有突变热点（9、11、13、17exon），但我要研究的病未见报道。请问我应对所有外显子测序吗？ Snapshot为小测序反应，其原理简单地说是首先扩增包含SNP在内的一段DNA模板，再对PCR产物进行纯化，加入带有不同荧光的ddNTP和中间探针（所谓中间探针即SNP前20个bp左右寡核苷酸序列，探针与ddNTP按照模板序列结合，因为是ddNTP，其后不能再延伸，而结合的ddNTP反应的就是SNP情况），再纯化一下进行电泳，根据不同的荧光可以判断相应SNP基因型。 该方法适用于对已知SNP等位基因型进行确认，对探针要求不高；但操作步骤多，大规模应用较为困难（采用基于毛细管的测序方法，如ABI3100测序仪系列时，相对工作量小些）。 检测某基因与疾病的关系，外显子较多（20），在其他疾病中已有突变热点（9、11、13、17exon），建议你先研究一下这些位点。当然如果基因序列很短，也可以直接测序，因为目前发现的SNP或mutation毕竟还只有预计值的2%左右。 Good luck 谢谢verygood：） 最近忙着论文答辩的事情。我对于这方面完全是菜鸟，但是老板说要有新意，同学给出了个这样的主意。 目前已经提取DNA，进行基因分型。但是我希望测序进行确定。上面提到的SNAPSHOT是小型测序，我已经确定了突变位点，片段在300bp左右，是否可以全部测序？ 另外是全部的样本测序还是就挑选几个杂合子和纯合子测就可以证明？这方面的资料在哪里有介绍？我还是新手：（ 无事转转 wrote: 谢谢verygood：） 最近忙着论文答辩的事情。我对于这方面完全是菜鸟，但是老板说要有新意，同学给出了个这样的主意。 目前已经提取DNA，进行基因分型。但是我希望测序进行确定。上面提到的SNAPSHOT是小型测序，我已经确定了突变位点，片段在300bp左右，是否可以全部测序？ 另外是全部的样本测序还是就挑选几个杂合子和纯合子测就可以证明？这方面的资料在哪里有介绍？我还是新手：（ 如果只是300bp，且标本不多的话，还是直接测序好，因为不仅可以明确已知的SNP基因型，还可能顺带发现一些文献未报道过的，这也就是说所有标本都要测序。 如果只想对已知的那些SNP进行基因分型，你可以采用SNAPSHOT方法，当然亦可以用RFLP，只是特异性差些，所得的条带不一定与目标SNP不同等位基因有关，可能切到染色体其他区域。 这方面到没有一定的资料，我们也是做过以后才逐渐理解的，具体采用何种技术还是因地制宜吧。 verygood wrote 检测某基因与疾病的关系，外显子较多（20），在其他疾病中已有突变热点（9、11、13、17exon），建议你先研究一下这些位点。当然如果基因序列很短，也可以直接测序，因为目前发现的SNP或mutation毕竟还只有预计值的2%左右。 谢谢verygood老师。我研究的基因编码区2930bp，mRNA5084bp，基因全长80kb。本打算直接测序，但病人组18例（石蜡），对照组20例（外周血DNA行吗？），费用可能要6万！！！，所以现在想改成PCR-SSCP加异常条带测序，您看行吗？ verygood wrote: 如果只是300bp，且标本不多的话，还是直接测序好，因为不仅可以明确已知的SNP基因型，还可能顺带发现一些文献未报道过的，这也就是说所有标本都要测序。 如果只想对已知的那些SNP进行基因分型，你可以采用SNAPSHOT方法，当然亦可以用RFLP，只是特异性差些，所得的条带不一定与目标SNP不同等位基因有关，可能切到染色体其他区域。 这方面到没有一定的资料，我们也是做过以后才逐渐理解的，具体采用何种技术还是因地制宜吧。 测序以后的结果要分析突变有什么软件检测呢？另外的统计学分析是不是有专门的生物统计学书有相关的介绍？还是就是普通的统计就可以了？ To coldant ： 对于初步研究，您的方法应该可行。 To 无事转转： 测序以后的结果分析突变主要通过序列比对初筛，可以利用Blast进行。不过确定是否确实为突变需要谨慎，应扩大样本再进行分型研究。 作疾病相关研究，你的case 和control太少了。一般国内期刊好像也要200对200，国外一般性期刊需要400-500对500左右。一流的杂志一般都是至少1000对1000的。由于你经费不足，你不可能作测序，你还是直接选用已知的位点做。因为这个基因跟多种疾病相关，说明这个基因很保守，很有可能跟你所研究的疾病相关，就算没有相关，通过与年龄、性别、该疾病的危险因素综合分析（就是玩数字游戏），一般总能发文章的。 寻找疾病相关基因的SNP，目前主要是直接测序（外周血抽提的DNA，而不是组织），通过对比病人和正常人（无该疾病的人）该基因序列，搜寻SNP。verygood所说的blast，实际上并不适用。 你可对目标SNP所在区域设计一对prime1，使得该SNP位于其中,PCR长度500bp左右。同时在PRIMER1覆盖的区域内，再设计一对PRIMER2。PRIMER2其中一个引物的3‘最后一个碱基必需是与目标SNP所在位点的正常碱基互补，如此，若病人在此位点突变，将导致PRIMER2一对引物不能扩增。另外PRIMER2与PRIMER1至少相距100多bp,PRIMER2产物为200多BP。这样，在一个PCR反应中同时放入这2对引物，就可以得到4个片段（在设计引物时，必须使得这4个片段的长度不同，以便电泳时区别），而含有目标SNP的个体，则只有3个片段，通过电泳，就可以确定是否该个体有突变。 这个方法具体的名称我忘了。希望能对你有所帮组。 maxon wrote: 寻找疾病相关基因的SNP，目前主要是直接测序（外周血抽提的DNA，而不是组织），通过对比病人和正常人（无该疾病的人）该基因序列，搜寻SNP。verygood所说的blast，实际上并不适用。 你可对目标SNP所在区域设计一对prime1，使得该SNP位于其中,PCR长度500bp左右。同时在PRIMER1覆盖的区域内，再设计一对PRIMER2。PRIMER2其中一个引物的3‘最后一个碱基必需是与目标SNP所在位点的正常碱基互补，如此，若病人在此位点突变，将导致PRIMER2一对引物不能扩增。另外PRIMER2与PRIMER1至少相距100多bp,PRIMER2产物为200多BP。这样，在一个PCR反应中同时放入这2对引物，就可以得到4个片段（在设计引物时，必须使得这4个片段的长度不同，以便电泳时区别），而含有目标SNP的个体，则只有3个片段，通过电泳，就可以确定是否该个体有突变。 这个方法具体的名称我忘了。希望能对你有所帮组。 呵呵，我指的是借用blast来方便序列的比对，当然applied biosystems有更好的软件，不过您如未购买相应仪器则很难获得。 至于标本量的多少，确实是越多越好。对于相对危险度为2的致病位点来说，case-control各1000例检测效能才能达到100%，病例数减少则检测效能也随之降低。但对于初步研究，还不清楚该位点是否有研究疾病有关就大规模投入，有可能颗粒无收。 供参考。 今天基康公司建议我直接测序，把样本4个一组形成一个“pool？”来测，节省经费。他们本来的建议是正常和病人各用4例分别形成1个“pool”来找SNP，然后用公司的TAG MAN（一种新技术）大规模检测SNP，但我没有这么多病人标本。所以只好只是测序。 请大侠看看这样好吗？如果我总共25例病人分成6个“pool”测序再分析可以吗？ 先谢谢了。 maxon wrote: 寻找疾病相关基因的SNP，目前主要是直接测序（外周血抽提的DNA，而不是组织），通过对比病人和正常人（无该疾病的人）该基因序列，搜寻SNP。verygood所说的blast，实际上并不适用。 你可对目标SNP所在区域设计一对prime1，使得该SNP位于其中,PCR长度500bp左右。同时在PRIMER1覆盖的区域内，再设计一对PRIMER2。PRIMER2其中一个引物的3‘最后一个碱基必需是与目标SNP所在位点的正常碱基互补，如此，若病人在此位点突变，将导致PRIMER2一对引物不能扩增。另外PRIMER2与PRIMER1至少相距100多bp,PRIMER2产物为200多BP。这样，在一个PCR反应中同时放入这2对引物，就可以得到4个片段（在设计引物时，必须使得这4个片段的长度不同，以便电泳时区别），而含有目标SNP的个体，则只有3个片段，通过电泳，就可以确定是否该个体有突变。 这个方法具体的名称我忘了。希望能对你有所帮组。 呵呵，谢谢了。我在相关文献上看到的是设计2个引物（突变和未突变的），另外反义引物相同。正常对照组设计的引物很象你所谈到的PROMER2。我就纳闷为什么这样做？ verygood wrote: To 无事转转： 测序以后的结果分析突变主要通过序列比对初筛，可以利用Blast进行。不过确定是否确实为突变需要谨慎，应扩大样本再进行分型研究。 确定是不可能做出结论，只是提出个展望。测序以后可以用SEQUENCEMAN软件分析，但是后面我想加个RFLP，按照相关文献报道来进行。这样分析起来好象就有更多的数据支持。 coldant wrote: 今天基康公司建议我直接测序，把样本4个一组形成一个“pool？”来测，节省经费。他们本来的建议是正常和病人各用4例分别形成1个“pool”来找SNP，然后用公司的TAG MAN（一种新技术）大规模检测SNP，但我没有这么多病人标本。所以只好只是测序。 请大侠看看这样好吗？如果我总共25例病人分成6个“pool”测序再分析可以吗？ 先谢谢了。 呵呵，你也是在基康做吗？他们好象是用探针来检测SNP啊。我听说探针的准确性不如直接测序。不知道他们和你提出的是什么样的建议？：） maxon wrote: 作疾病相关研究，你的case 和control太少了。一般国内期刊好像也要200对200，国外一般性期刊需要400-500对500左右。一流的杂志一般都是至少1000对1000的。由于你经费不足，你不可能作测序，你还是直接选用已知的位点做。因为这个基因跟多种疾病相关，说明这个基因很保守，很有可能跟你所研究的疾病相关，就算没有相关，通过与年龄、性别、该疾病的危险因素综合分析（就是玩数字游戏），一般总能发文章的。 5555555，可是我收集不到这么多的病例呀，经费也有限。 您说的直接做已知位点是什么方法啊？另外您有看过《生物学统计》这样的书吗？听说参照它就可以进行相关的分析了。上海哪个图书馆或是书店有呀？ 具体什么方法我忘了。统计学主要就是T检验和X2 多态性分析方法有两大类： 其一，基于家系分析，主要采用连锁不平衡方法。 其二，基于case-control，如maxon所言，主要就是T检验和X2 。但是应注意control是否能代表所抽样的群体。因抽样错误而导致的假阳性结果在早期文献中比比皆是，这已逐渐引起大家的关注。 无事转转wrote： 呵呵，你也是在基康做吗？他们好象是用探针来检测SNP啊。我听说探针的准确性不如直接测序。不知道他们和你提出的是什么样的建议？：） 看样子无事转转做的工作与我的很相似，可以多多交流！ 基康公司建议：病人与对照各25例（病人只收集到25例），4例一组形成一个“pool”，PCR扩增所以外显子，直接测序。（节省费用） 申能公司建议：对每个病人进行扩增，直接测序，与genbank比较（不设对照组，费用18000元/10例） 北京鼎国公司：PCR-SSCP，（正常，病人各25例） 请verygood，maxon，无事转转等战友们参谋参谋，哪个可行？ 申请斑竹们帮助。 coldant wrote: 看样子无事转转做的工作与我的很相似，可以多多交流！ 基康公司建议：病人与对照各25例（病人只收集到25例），4例一组形成一个“pool”，PCR扩增所以外显子，直接测序。（节省费用） 申能公司建议：对每个病人进行扩增，直接测序，与genbank比较（不设对照组，费用18000元/10例） 北京鼎国公司：PCR-SSCP，（正常，病人各25例） 请verygood，maxon，无事转转等战友们参谋参谋，哪个可行？ 申请斑竹们帮助。 我病例30，对照12。人家的建议是直接测序。我想测序以后再做个RFLP，因为是要写论文，所以内容不可以少。
刘岩，王国英，刘俊君，彭学贤，谢友菊，戴景瑞，郭世伟，张福锁1998大肠杆菌gutD基因转入玉米及耐盐转基因植物的获得 中国科学（C辑） 28（6）：542-547周逢勇，戴景瑞，王国英，谢友菊，崔洪志，郭三堆 1998玉米自交系P9-10遗传转化体系的构建 科学通报 43（23）：2517-2520张宏，戴景瑞 1998 玉米原生质体培养及可育植株的再生 作物学报 24（4）：497-502戴景瑞 1998 中国玉米生产发展的前景及对策 作物杂志 5：6-11吴敏生，戴景瑞 1998 扩增片段长度多态性（AFLP）—一种新的分子标记技术 植物学通报15（4）：68-74戴景瑞 1998 发展玉米育种科学迎接21世纪的挑战 作物杂志6：1-4吴敏生，戴景瑞，王守才 1998玉米优良自交系优势群划分的初步研究中国农业大学学报3（5）：97-100曹永国，戴景瑞 1998玉米F2群体中偏分离RFLP标记在染色体上的分布及原因分析中国农业大学学报 3（增刊）：1-5吴敏生，王守才，戴景瑞 指纹图谱技术在品种鉴定和纯度分析上的应用农业生物技术学报 6（1）：51-56王志民，戴景瑞 1998 植物RFLP连锁图谱构建 生命科学研究进展 1：141-145曹永国，王国英，王守才，魏艳玲，卢江，谢友菊，戴景瑞 1999玉米RFLP遗传图谱的构建及矮生基因定位 科学通报 44（20）：2178-2181吴敏生，戴景瑞，王守才 1999 RAPD分子标记与玉米杂种产量优势预测的研究 遗传学报 26（5）：578-584王守才，王国英，丁群星，张宏,谢友菊，戴景瑞 1999转基因在玉米中的遗传分离与整合特性研究遗传学报 26（3）：254-261吴敏生，戴景瑞，王守才 1999 RAPD玉米品种鉴定和纯度分析中的应用 作物学报 25（4）：489-493吴敏生，王守才，戴景瑞 1999差异显示技术(DD-PCR)及其应用植物生理学通讯 35（4）：307-312吴敏生，戴景瑞 1999灰色系统理论在玉米育种上的综合应用华北农学报 14（2）：30-35张建福，戴景瑞 1999基因工程固氮菌肥对玉米生产发育的影响初探上海农业学报 15（1）：79-82向道权，戴景瑞 1999 玉米产量QTL和杂种优势遗传基础研究进展中国农业大学学报 15（1）：79-82吴敏生，戴景瑞 1999植物杂种优势研究新进展 中国农业科技导报 2：59-62刘大文，戴景瑞，谢友菊，王守才 1999玉米雄性不育基因和恢复基因表达载体的构建与鉴定 种子1：34-35高志环，薛勇彪，戴景瑞 2000玉米小斑病菌C小种毒素的致病作用位点科学通报 45（6）；622-626吴敏生，戴景瑞 2000 AFLP标记与玉米杂种产量、产量杂种优势的预测植物学报 42（6）：600-604刘大文，王守才，谢友菊，戴景瑞 2000转Zm13-Barnase基因玉米的获得及其花粉育性研究 植物学报42（6）：611-615吴敏生，王守才，戴景瑞 2000 AFLP分子标记在玉米优良自交系优势群划分中的应用作物学报 26（1）：9-13刘大文，谢友菊，王守才，戴景瑞 2000 拟南芥菜菜花药绒毡层启动子的克隆和序列分析 作物学报 26（4）：406-410陈彦惠，王利明，戴景瑞 2000中国温带玉米种质与热带、 亚热带种质杂优组合模式研究 作物学报 26（5）：557-564吴敏生，戴景瑞，谢友菊 2000 一个与玉米基因沉默表达有亲友的cDNA片段的克隆与序列分析 植物生理学报戴景瑞 2000玉米抗病相关候选基因DNA片段克隆中国农业科学（增刊） 33（1）：141-146吴敏生，戴景瑞 2000中国17个优良玉米自交系的分子标记杂合性及其与杂交种性状的关系研究 西北植物学报 20（5）691-700王守才，王国英，戴景瑞 2000玉米转基因遗传问题的讨论 生物工程进展 20（4）：64-66陈彦惠，王利明,戴景瑞 2000 热带、亚热带自交系与中国温带玉米种质杂交种的研究 中国农业大学学报 5（1）；50-57GAO ZH,XUE YB,DAI J R 2001 CDNA-AFLPanalysis reveals that maize resistance to Bipolaris maydisis associated with the induction of multiple defence nelated genes Chinese Science Bulletin 46（17）：1454-1458向道权，曹海河，曹永国，杨俊品，黄烈健，王守才，戴景瑞 2001玉米SSR遗传图谱的构建及产量性状基因定位 遗传学报 28（8）：778-784吴敏生，高志环，戴景瑞 2001利用cDNA—AFLP技术研究玉米基因的差异表达 作物学报 27（3）：339-342杨会，王国英，戴景瑞 2001玉米优良自交系综3、综31的转化研究农业生物技术学报 9（4）：334-337向道权，黄烈健，曹永国，戴景瑞 2001玉米产量性状主基因-多基因遗传效应的初步研究 华北农学报 16（3）：1-5田增元，戴景瑞 2002 利用cDNA-AFLP技术分析玉米灌浆期功能叶基因差异表达与杂种优势科学通报 47（18）：1412-1416黄烈健，向道权，杨俊品，戴景瑞 2002 玉米RFLP连锁图谱构建及大斑病QTL定位 遗传学报 29（12）：1100-1104赵君，王国英，胡剑，张晓红，戴景瑞 2002玉米弯孢菌叶斑病抗性的ADAA遗传模型的分析作物学报 28（1）：127-130曹永国，向道权，黄烈健，王守才，吴敏生，戴景瑞 2002 SSR分子标记与玉米杂种优势关系的研究 农业生物技术学报 10（2）：120-123田曾元，戴景瑞 2003玉米杂种与亲本穗分化期功能叶基因差异表达与杂种优势 遗传学报 30（2）：154-162刘章雄，王守才，戴景瑞，黄烈健，曹海河 2003玉米P_（25）自交系抗锈病基因的遗传分析及SSR分子标记定位 遗传学报 30（8）戴景瑞，赵克明，苏胜宝 2003优良玉米杂交种农大3138的选育与推广 山西农业科学 31（2）：19-22Song,XF,T.M. Song,J.R. Dai,T. Rocheford,J.S. Li 2004 QTL mapping of kernel oil concentration with high-oil maize by SSR markers Maydica 49:41-48白琪林， 陈绍江， 董晓玲， 孟庆祥， 严衍禄， 戴景瑞 2004 近红外漫反射光谱法测定玉米秸秆NDF与ADF含量，光谱与光谱分析 24 （11）：1345
普通期刊1-3个月，核心期刊3-6个月
大家好，本周给大家分享的是2022年最近发表在PNAS上关于 通过GWAS分析重症肌无力遗传风险位点的识别 相关的一篇文章。
文章题目： Identification of genetic risk loci and prioritization of genes and pathways for myasthenia gravis:a genome-wide association study (重症肌无力遗传风险位点的识别及基因和途径的优先排序：全基因组关联分析)
期刊： Proceedings of the National Academy of Sciences （PNAS）
影响因子： 2020_IF = 11.205; 中科大类: 综合性期刊 1区; 中科小类: 综合性期刊 1区; JCR分区: Q1
发文单位： 马里兰州贝塞斯达国家老龄研究所神经遗传学实验室神经肌肉疾病研究室和意大利都灵大学等14家单位。
摘要： 重症肌无力是一种慢性自身免疫性疾病，以自身抗体介导的神经肌肉接头信号传导干扰为特征。作者进行了一项全基因组关联分析（GWAS），涉及1873名被诊断为乙酰胆碱受体抗体阳性的重症肌无力患者和36370名健康人，以确定疾病相关的遗传风险位点。在英国生物银行的一个独立队列中尝试重复发现的基因座。作者还利用骨骼肌、全血和胫神经的表达数据进行了全转录组关联分析（TWAS），以测试疾病相关多态性对基因表达的影响。作者在编码乙酰胆碱受体亚单位的基因中发现了两种信号，乙酰胆碱受体亚单位是自身抗体最常见的抗原靶点：正常骨骼肌中胆碱能受体烟碱α1亚单位（ CHRNA1 ）基因内的GWAS信号和与胆碱能受体烟碱β1亚单位（ CHRNB1 ）基因的TWAS关联。在10p14和11q21上发现了另外两个基因座，并确认了先前在 PTPN22 、 HLA-DQA1/HLA-B 和 TNFRSF11A 上的关联信号。亚组分析表明，早发和晚发病例具有不同的遗传风险因素。遗传相关分析证实了重症肌无力与其他自身免疫性疾病之间的遗传联系，如甲状腺功能减退、类风湿关节炎、多发性硬化和1型糖尿病。最后，作者应用优先指数分析来确定潜在的可药物基因/蛋白质和途径。这项研究深入了解了重症肌无力的遗传结构，并证明编码乙酰胆碱受体亚单位的基因座内的遗传因素会导致其发病。
本研究中作者进行了一项全基因组关联研究（GWAS）和一项全转录组关联研究（TWAS），以确定与疾病病因学有关的遗传风险和候选基因（图1）。这项工作将样本量进行扩大，增加了检测与重症肌无力相关的遗传风险因素的能力。然后，作者利用遗传数据来识别与重症肌无力相关的疾病，并对可能成为疾病修饰治疗目标的基因和途径进行优先排序。
图1. 分析流程。流程图概述了本研究中进行的分析。
作者对1873例重症肌无力患者和36370名健康人进行GWAS分析。作者重点关注了乙酰胆碱受体抗体阳性病例，因为这些抗体在～90%的全身性重症肌无力患者中发现。除了先前报道的PTPN22、HLA-DQA1/HLA-B和TNFRSF11A中的信号外，作者还观察到染色体2q31.1、10p14和11q21上的关联信号（图2A）。由于已知重症肌无力存在年龄依赖性遗传异质性，作者分别对早发病例和晚发病例进行GWAS分析。和之前对重症肌无力进行的GWAS研究一样，作者发现这些人群的遗传结构存在明显差异（图2 B和C）。
图2. 重症肌无力的GWAS。顶部（A）、中部（B）和底部（C）面板分别显示了整个队列（n=1873例重症肌无力病例和36370名健康个体）、早发病例队列（n=595例病例和2718名对照者）和晚发病例队列（n=1278例病例和33652名对照者）的GWAS结果。
接着作者对重症肌无力进行TWAS分析以确定与疾病发病机制相关的其他基因。这种分析方法将基因型和表达量与表型性状相关联，以确定与该性状相关的基因表达的顺式遗传成分。该方法确定了六个基因，它们的差异表达与组织间重症肌无力风险显著相关（图3）。
图3. 重症肌无力的TWAS。
最后作者使用优先级指数方法进行了靶点优先级分析，以深入了解重症肌无力的相关途径，并确定潜在的药物靶点。该分析将来自GWAS的遗传信息与功能基因组数据和免疫相关注释数据相结合，以指定最相关的基因（图4A）。对优先级指数得分最高的前1%基因的富集分析确定了一组与适应性免疫反应、免疫系统中的细胞因子信号和受体酪氨酸激酶信号有关的富集途径（图4B）。
图4. 基于优先级指数和药物可用量的重症肌无力免疫靶点的优先级。（A）基于使用优先指数生成的基因预测矩阵的常染色体基因的评分。（B）富集分析显示了免疫和信号转导模块中的优先目标路径。
总之该研究涉及1873名患者和36370名健康个体，是一项广泛的重症肌无力全基因组关联研究。通过GWAS和TWAS确定了编码乙酰胆碱受体亚单位的两个信号，即 CHRNA1 和 CHRNB1 ，识别这些基因证实了利用遗传学来识别作为自身抗体抗原靶标的蛋白质的潜在效用。该研究为重症肌无力病理生理学的遗传结构提供了更广泛的见解。
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文章链接地址：
参考文献：
Chia R, Saez-Atienzar S, Murphy N, et al. Identification of genetic risk loci and prioritization of genes and pathways for myasthenia gravis: a genome-wide association study[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2022, 119(5).
meta析偏倚叫发表偏倚能找文献阳性结文献都实验结A由于B才发表（假设A新B）做A并优于B文章数没发表（改数据改A优于B发表）所检索文章都A优于B认别随机研究都A药优于B药事情没必要做meta析meta析我看种些相近随机研究数据整合起变随机研究计算结（简单考虑）结说A,说B说效检索相关文献剔除效用meta析看看底AB
对于初次投稿的作者，审稿流程以及审稿状态是其主要关注的，了解审稿流程，不仅可以掌握自己稿件的随时状态，以及状态背后所隐藏的信息，进而做到心中有数，今天为大家分享一篇SCI论文审稿流程的详细介绍。 参与审稿的人： （1）Editor in Chief（EIC），主编，对稿件有最终决定权。（2）ADM- (可能是) Administrator，协助主编日常工作。（3）Associated Editor（AE）副编辑，其会在审稿人（reviewers）意见的基础上对文章作个综合评价后，给主编一个recommendation。一般主编都会按照AE的意见写最终的decision letter。（4）Reviewer--审稿人，对你的文章进行审稿，并将审稿意见提交给AE。 Articlesubmitted后（即论文提交后）： 1、awaiting admin.procession一般3－4天后就会安排主编。2、awaiting reviewerassignment 等待指定审稿人。主编在选择审稿人，等待审稿人回复是否同意审稿。一般在一周以内。看审稿人回复速度。3、awaiting reviewerscores 等待审稿人审稿意见。一般会要求审稿人三周内给审稿意见。但是审稿人觉得时间不够，可以写信给主编要求延长审稿期限。这个时间长短要取决于审稿人是否有空看你的文章，还要看他是否守时。一般三周左右。4、awaiting AEassignment 等待AE的指派。编辑部在选择/联系AE。一般1－3天左右。5、awaiting AErecommendation 等待AE的推荐。有些杂志要求AE三周内给结果。基本都是期限的最后一两天才给结果。6、awaiting EICdecision －激动人心的时刻。等待主编的决定。一般3－4天。 EIC的最终决定也分以下几种情况： 1－Accept2－accept after minorrevision(withour re-review不需要再送审)3－reconsiderationafter major revision.(要再送审，即要再经过审稿流程3－6)4－reject and resubmit(论文现在状态不能接受，但可以修改后重新再投。要重新经过审稿流程1－6)5－reject （没有希望了，尽快改投其它期刊) 很多作者在投稿后，对自己论文的后续审稿状态不是很了解，心里一直坎坷不安，其实，熟悉审稿流程及各状态情况，可以消除您的不安，也在出现不希望看到的结果后，能及时转变投稿方向，这对于作者是非常必要的。参考：查尔斯沃思论文润色贴士
《石油化工》这个期刊吗？有的只有一天时间就分好了，下面是之前一篇文章的详细投稿状态流程记录表: （开始时间、实际完成时间、理论完成时间）收稿 编辑部 2014-06-26 2014-06-26主编分稿 编辑部 2014-06-26 2014-07-26 2014-06-27责编 编辑部 2014-06-27 2014-07-11 2014-07-01
论文的审核周期得分情况，分刊物。两方面来说：如果你是投稿到普刊，就是非核心期刊，审稿周期一般在1-2个月左右，如果是核心期刊，审稿周期在2-4个月左右。如果你是找论文发表机构投稿发表，普刊，审核周期在3-5个工作日，核心期刊在2个月左右。
大多数情况下，建议作者自己投稿，如果实在投稿没有音讯或者想快速发表出来，可以找淘淘论文网这样的专业论文服务机构，2-3个月就能发表见刊。
论文关键词：
关键词是从论文的题名、提要和正文中选取出来的，是对表述论文的中心内容有实质意义的词汇。关键词是用作计算机系统标引论文内容特征的词语，便于信息系统汇集，以供读者检索。每篇论文一般选取3-8个词汇作为关键词，另起一行，排在“提要”的左下方。
主题词是经过规范化的词，在确定主题词时，要对论文进行主题分析，依照标引和组配规则转换成主题词表中的规范词语。（参见《汉语主题词表》和《世界汉语主题词表》）。
在正常的情况下，很多人普遍认为SCI期刊的影响因子越低，就越好投，就是容易发表。一般情况下，这样的思维和想法都是对的。但是对于一些特殊类的文章，这种想法是行不通的，例如纯生信（没有补任何实验的）。 现在做纯生信的人非常多，竞争很大，特别是比较旧的分析套路，一般都是比较难发表。为什么比较旧的纯生信分析套路难发？原因就是在于成本低，可能随便在网上都能找到免费的资源， 所以基本上人人都可以做，文章特别容易弄出来。做的人多了，文章自然就多，但是期刊的版面是有限的，即使这本期刊再怎么水，也不可能把所有文章都接收出版。 有的人是这样想的：虽然自己的文章没有什么创新，3分以上的期刊发不了，3分以下的期刊总可以投吧，不行的话，1分的期刊也可以考虑。最怕就是有无数的人都是这样想的，结果造成扎堆投稿，拒稿率自然就大。 之前有朋友的纯生信文章总挑影响因子低的投稿，首先是投了 Med Sci Monit （IF：2.649，6月份之前是1点多的），结果被秒拒了，然后再投 Bioengineered （IF：3.269，6月份之前是2点多的），还是被秒拒。 后面有一次偶然的机会，被人鼓励投了一本接近5分的期刊，结果小修之后就被接收出版 。 Med Sci Monit 、 Bioengineered 的影响因子不高，为啥这么难投？ 原因很简单，人家对纯生信极度友好， 但是就是太出名了，造成扎堆投稿，期刊主编没有办法筛选稿件送审了，只能通过补实验来过滤。 有些高分一点的期刊反而还比较容易投，原因也很好理解， 人家愿意接收纯生信，而且投稿的人不多，命中的机会自然就多 。 总结 纯生信投稿的秘诀： 先搜索一下自己的文章，检查是否有类似文章发表，自己的文章是不是热点套路，是否抓住机会，再来决定期刊的影响因子。 出名的期刊尽量不投，不管其影响因子高不高 ， 因为扎堆投稿的拒稿率从来都不低。
收。openmedicine收纯生信，该刊作为生物医学领域的2-3分的SCI期刊，最大的特点是对国人友好、且乐于接收纯生信的文章。而且，这本期刊相对冷门，投稿的人比较少，中稿的几率相应会大幅增加。
有粉丝问道：有没有5分以上的纯生信友好期刊推荐呢？我们回答：有的，不过要看你文章的创新性。结果一看ta的标题和摘要，发现是烂大街的分析套路，这样的文章已经在 plos one 上找到好几篇了，这样的文章还能有什么创新性可说的，该发的都被抢先发了。 根本没有任何优势，哪来的勇气发5分+SCI? 现在的纯生信行情：烂大街的纯生信满天飞，1到3分的水刊都不太愿意接收，更何况是5分以上的期刊。纯生信要想发5分以上的期刊， 需要增加自己的优势，要么做别人没有做过的热点套路，成为第一个吃螃蟹的人，要么补实验，做到人无我有的境界 。 不过，有些粉丝并没有清楚认识到现在的纯生信行情，坚信自己做的分析套路可以发5分+SCI，非常有耐心地投稿。 结果被七八本5+SCI期刊秒拒了 ，差不多一年时间已经过去了，文章连送审的机会都没有，离发表还差十万八千里。 懂纯生信行情的人都知道， 纯生信拖得越久就越难发表 ，因为纯生信更新是非常快的，新的热点不断出来， 期刊都是喜新厌旧的 ，最后可能连低分的水刊都看不上一年之前的烂大街分析套路。 烂大街的纯生信文章被高估是一件非常可怕的事情。 除了浪费时间之外，还会对纯生信失去信心，脑海一直浮现出纯生信被秒拒的情景。 要想发好一点的期刊，就要制造多一点优势，要么利用创新打败别人，要么利用补实验打败别人 。 烂大街的纯生信分析套路唯一的优点就是容易模仿，免费的资源多，但是不容易发表。当然，这个也不是绝对的，有可能烂大街的纯生信分析套路可以发CNS呢，有信心的人可以去尝试一下CNS。
昨天分享了一些会接收纯生信的 2区SCI期刊 ，然后在微信公众号后台有粉丝留言想看对纯生信友好的 3区SCI期刊 ，现在我就整理一些对纯生信友好的3区SCI期刊。 对纯生信友好的3区SCI期刊： 1、Frontiers in Oncology 影响因子：4.8 审稿周期：2-4个月不等（ 审稿周期偏短 ） OA期刊：需要收取版面费 难度：**（ 相对比较容易，现在需要补一个PCR或者WB比较好发，完全纯的主编不感兴趣了 ） 不在中科院《国际期刊预警名单（试行）》名单（ 2021年1月发布版）上 2、Aging-US 影响因子：4.8 审稿周期：4-8个月不等（ 审稿周期比较长 ） OA期刊：需要收取版面费 难度：**（ 比较容易，基本上阳性结果好的都接收 ） 在中科院《国际期刊预警名单（试行）》名单（ 2021年1月发布版）上： 预警等级：中 3、International Journal of Molecular Sciences 影响因子：4.5 审稿周期：1个月左右（ 审稿周期非常短，审稿速度快 ） OA期刊：需要收取版面费 难度：****（ 相对比较难 ） 不在中科院《国际期刊预警名单（试行）》名单（ 2021年1月发布版）上 4、JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY 影响因子：4.2 审稿周期：2-3个月（ 审稿周期偏短 ） 非OA期刊：不需要收取版面费 难度：***（ 有点偏难 ） 在中科院《国际期刊预警名单（试行）》名单（ 2021年1月发布版）上： 预警等级：高 5、Cancer Cell International 影响因子：4.1 审稿周期：5-8个月左右（ 审稿周期较长，审稿速度较慢 ） OA期刊：需要收取版面费 难度：**（ 相对比较容易 ） 不在中科院《国际期刊预警名单（试行）》名单（ 2021年1月发布版）上
以下信息供参考药物分析化学SCI论文投稿指南医药分析和生化分析在投文章的时候怎么挑选一个最合适的杂志。